Summary
Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).
Abstract
Varicella zoster (VZV) è una causa importante di morbilità e mortalità dopo trapianto di sangue del cordone ombelicale (UCBT). Per questo motivo, la profilassi antierpetico è amministrato sistematicamente ai destinatari UCBT pediatrici per evitare complicazioni associate con infezione VZV, ma non vi è un consenso prove basate forte che definisce la sua durata ottimale. Poiché cellule T mediata è responsabile del controllo di infezione VZV, valutare la ricostituzione di VZV specifiche risposte delle cellule T seguente UCBT potrebbe fornire indicazioni sul fatto profilassi possono essere mantenute o possono essere sospesi. A tal fine, un VZV specifico interferone gamma (IFN-γ) immunospot enzimatico (ELISpot) saggio è stata sviluppata per caratterizzare la produzione di IFN-γ da linfociti T in risposta alla stimolazione in vitro con vaccino vivo attenuato irradiato VZV. Questa analisi fornisce una misurazione rapida, riproducibile e sensibile di VZV specifico cell immunità adatto per monitorare la ricostituzione del VZV dell'immunità specifica in ambito clinico e di valutare la risposta immunitaria agli antigeni VZV mediata.
Introduction
La prima volta nel 1989 UCBT è sempre più utilizzato come parte del trattamento di vari disturbi del sangue neoplastiche e non neoplastiche in bambini 1. VZV è un alphaherpesvirus umana citopatico che provoca due malattie diverse, varicella (dopo l'infezione primaria) e dell'herpes zoster (dopo la riattivazione). Dopo l'infezione primaria, VZV persiste per tutta la vita dell'ospite riparata entro nervi sensoriali del gangli spinali. Una delle complicanze infettive più minacciosi seguenti UCBT è associato con VZV 2-4. Nel nostro centro clinico, in assenza di VZV la profilassi, l'incidenza cumulativa di malattia VZV malattia da VZV a 3 anni postUCBT era del 46% 2. In questi pazienti, de novo infezione con o riattivazione di VZV è spesso associato con diffusione viscerale al sistema nervoso centrale, polmoni e fegato 5-7. Come profilassi conseguenza, aciclovir, valaciclovir e famciclovir viene comunemente somministrato a UBCT destinatari 8,9. Tuttavia, questa strategia di trattamento non tiene conto del potenziale protettivo di VZV linfociti T specifici o la cinetica di ricostituzione del VZV specifiche risposte delle cellule T. Potenziali problemi associati con l'uso crescente di profilassi antierpetico lungo termine includono a) overtreatment paziente; b) lo sviluppo di resistenza ai farmaci antivirali 10,11; c) violazione di VZV specifico ricostituzione immunitaria 12,13. Poiché il rilevamento di VZV funzionali specifici linfociti T è correlata con la presenza di una protezione a lungo termine da VZV e un miglior risultato clinico 4,14,15, monitoraggio delle cellule mediata risposte immunitarie contro VZV nel periodo post-trapianto potrebbe comportare un uso più razionale antivirale trattamento consentendo medici di distinguere i pazienti che potrebbero trarre vantaggio da VZV profilassi da coloro il cui sistema immunitario è in grado di controllare la replicazione VZV 4,13.
Il ELISpot saggio IFN-γ è ampiamente usato per le cellule monitoraggio risposte immunitarie mediate in una varietà di sistemi sperimentali e condizioni cliniche. Macchie sono generate a seguito clivaggio di un substrato cromogenico, generando un precipitato visibile e stabile al sito di reazione. Ogni singolo spot rappresenta quindi l'impronta di una cella producenti citochine individuale. IFN-γ ELISpot non solo misura la capacità delle singole cellule ex vivo per produrre IFN-γ in risposta alla stimolazione in vitro con antigene affine, ma fornisce anche una stima della frequenza di rispondere cellule in una data popolazione cellulare 16,17. Oltre alla sua elevata sensibilità, IFN-γ ELISpot è semplice da eseguire, rendendo possibile il suo impiego nel contesto di protocolli clinici personalizzati volti a guidare l'inizio o cessazione del trattamento antivirale. La procedura di seguito dettagliata descries un saggio ELISpot che è specificamente progettato per rilevare e misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico dopo stimolazione in vitro con antigeni derivati VZV.
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Protocol
Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Consiglio di CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, dove è stato condotto lo studio Istituzionale valutazione etica. Il consenso informato è stato chiesto e ottenuto da tutti i partecipanti allo studio, i loro genitori o tutori legali. Tutte le procedure eseguite nei giorni 1 e 2 devono essere eseguite in condizioni sterili (cioè sotto una cappa a flusso laminare). Procedure di sicurezza standard per il trattamento del sangue umano devono essere rigorosamente rispettate.
1. Rivestimento delle piastre
- Permeabilize il difluoruro di polivinilidene (PVDF) membrane in fondo 96 pozzetti MultiScreen IP piastre ELISpot bianco aggiungendo ad ogni pozzetto 20 pl di 35% etanolo per 1 min. Membrane dovrebbero diventare leggermente traslucido.
- Lavare immediatamente i pozzetti 3 volte con 200 ml di 1x tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) utilizzando un multichannel pipetta o un dispositivo simile. Questo passaggio è fondamentale dato che i residui di etanolo possono influenzare la vitalità cellulare e legame di anticorpo di cattura. Piastre ELISpot sono fragili e devono essere maneggiati con cura: l'uso di un lavatore automatico non è raccomandato.
- Cappotto pozzetti con 10 ml di topo purificato cattura IFN-γ anticorpo anti-umano diluito in 1x PBS ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire le piastre con pellicola trasparente e regolare incubare una notte a 4 ° C.
2. Blocco Plates
- Svuotare i pozzetti, toccando asciugare e lavare i piatti 5 volte con 200 ml di 1x PBS.
- Riempire i pozzetti con 200 ml di terreno RPMI 1640 completo e incubare le piastre per 2 ore a 37 ° C (blocco passo).
- Lavare le piastre 5x con 200 microlitri di PBS 1x e mantenere i pozzi pieno di PBS 1x finché le cellule sono pronte per essere placcato.
3. Cella placcatura e di stimolazione
- Preparare peripheral cellule mononucleate del sangue (PBMC) a partire da campioni di sangue venoso umano mediante centrifugazione su gradienti di Ficoll-Paque utilizzando le procedure standard. In alternativa, utilizzando metodi standard, disgelare le aliquote di PBMC congelati in azoto liquido. Dopo centrifugazione ultimi, risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 6 cellule / ml e incubate overnight a 37 ° C sotto atmosfera di CO 2 5% in un incubatore a camicia d'acqua.
- Rimuovere PBMC dall'incubatore e risospendere in un volume finale di 5 ml di RPMI completo 1640.
- Incubare PBMC in presenza di 10 ml di endonucleasi geneticamente da Serratia marcescens per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere un'aliquota 50 microlitri di PBMC e mescolare con 50 ml di trypan colorante blu. Contare le celle e stimare% vitalità usando un emocitometro e l'esame microscopico (metodo esclusione del colorante). Vari metodi automatizzati per il conteggio e la valutazione della vitalità cellulare can al cellularecosì essere utilizzato. PBMC deve essere> 95% praticabile. Scartare campione quando vitalità è inferiore al 95%.
- Centrifugare PBMC a 700 xg per 5 minuti, il surnatante scarto, e risospendere le cellule in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) di siero umano inattivato (HIS) ad una concentrazione finale di 2 x 10 6 cellule / ml. Mantenere a 37 ° C fino miscele di stimolazione sono aggiunti alla piastra.
- Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri della miscela stimolazione appropriata. Tre le miscele di stimolazione devono essere utilizzati come descritto di seguito:
- Medio uso AIM-V integrato con il 2% (v / v) di siero umano inattivato (IHS) come controllo negativo.
- Utilizzare anti-CD3 anticorpo monoclonale (clone OKT3) diluito in mezzo AIM-V supplementato con 2% (v / v) IHS ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml come controllo positivo).
- Utilizzare antigene VZV, sotto forma di una γ-irradiati (10.000 Gy; 30 min tempo di esposizione) vaccino vivo attenuato contro VZV (1.350 unità formanti placca [PFU] / ml) diluizioneTED 1:200 in AIM-V mezzo supplementato con 2% (v / v) IHS) o 1 mg di una miscela equimolare di 67 peptidi (15 residui amminoacidici) sintetizzato sulla base della sequenza del VZV immediatamente precoce (IE63) fosfoproteina . Controllare l'efficacia irradiazione monitorando l'assenza di segni visibili di effetto citopatico dopo 4 giorni in culture di PBMC.
- Preparare tutti i pozzetti in duplicato.
- Aggiungere ai pozzetti, una goccia alla volta, 100 microlitri di cellule preparate nel passo 5.4 ai pozzetti appropriati. Due pozzetti devono essere lasciati senza cellule (controllo negativo). Incubare per 20 ore a 37 ° C sotto atmosfera di CO 2 5% in un incubatore a camicia d'acqua. Non scuotere, spostare o impilare i piatti su uno sopra l'altro durante l'incubazione.
4. Spot Sviluppo e rilevamento
- Scartare le cellule e lavare le piastre 10x con PBS 1x integrato con 0,05% (v / v) di Tween 20 (PBST). Tween 20 aiuta staccare cellule che hanno aderito al PVDF membrane seguente notte di incubazione.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di 0,5 mg / ml biotina coniugato anti-IFN-γ anticorpo monoclonale (clone 4S.B3) diluito in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) di siero albumina bovina (BSA). Incubare le piastre per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti 6x con PBST e aggiungere ogni ben 100 ml di streptavidina conjugatd con fosfatasi alcalina diluito 1:1000 in 1x PBS contenente 0,5% (w / v) BSA. Coprire le piastre e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le piastre 3x con PBST e 3x con 1x PBS. Aggiungere 100 pl di un fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP) / nitro blu tetrazolio cloruro (NBT) soluzione di substrato e incubare 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare le piastre sotto acqua distillata. Rimuovere la sezione inferiore della piastra ELISpot e lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata. Far asciugare i piatti.
- Esaminare i pozzi ed enumerare le macchie con un d stereoscopicamicroscopio issection o la scansione delle piastre utilizzando un contatore posto automatizzato. Conservare le piastre lontano dalla luce se non possono essere esaminati lo stesso giorno.
- Calcolare la media dei numeri di punti contati in corrispondenti pozzetti duplicati e sottrarre il numero di punti contati in pozzetti di controllo negativo (nessuna cella) dal numero di punti contati nei pozzetti.
- Esprimere la produzione di IFN-γ, come il numero di unità in loco di formatura (SFU) per 10 6 PBMC.
- Si consideri che i campioni di prova sono positivi se il numero di SFU è> 50 per 10 6 PBMC e 2 deviazioni standard (SD) sopra il controllo negativo (medium cellule + AIM-V integrato con il 2% (v / v) IHS).
- Utilizzare un valore di 400 SFU per bene quando i punti sono troppi per essere contati.
- Verificare se i dati ELISpot sono distribuiti normalmente o non utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov. Quando i dati sono distribuiti normalmente, effettuare confronti statistici con t tes di Studentt (2 gruppi) o ANOVA e il post-test di Bonferroni (confronti multipli). Se i dati non sono distribuiti normalmente, utilizzare il test di Mann-Whitney U (2 gruppi) o il test di Kruskal-Wallis e post-test di Dunn (confronti multipli).
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Representative Results
Il protocollo ELISpot IFN-γ sopra descritto è stato sviluppato ed ottimizzato nel nostro laboratorio per misurare l'entità e la qualità delle cellule risposte immunitarie mediate dirette contro VZV 4. Diverse fonti di antigene VZV possono essere utilizzati per la fase di stimolazione. Questi includono: a) disponibile in commercio dei detergenti estratti inattivati da VZV infettate cellule Vero 18; b) le piscine di sovrapposizione peptidi sintetici da specifiche proteine codificate VZV, compresi IE63 15 e ORF4 19; c) vaccino vivo attenuato contro la varicella zoster 20; e d) UV preparazioni inattivati dei VZV antigeni dal surnatante della perturbato VZV infettato cellule MRC 14. Nel nostro caso, diluizioni di vaccino vivo attenuato VZV sono stati preferiti rispetto coltura cellulare derivato VZV al fine di assicurare uniformità di origine antigene e di preparazione e di limitare la cultura e la manipolazione di ceppi VZV tipo selvatico vive in un ambiente clinico in cui transmissio nosocomialen è un problema serio 10. Inoltre, l'irraggiamento γ è stato preferito inattivazione UV 21 a causa della precisione con cui comparativa dosi di radiazioni γ erogabile e perché, a differenza UV, raggi γ efficiente penetrare fiale sigillate contenenti VZV. Irradiazione degli stock virali che hanno portato a stime costantemente superiori della frequenza di VZV specifiche cellule IFN-γ producono in campioni di PBMC ottenute da un donatore sano a tutte le diluizioni di antigene VZV testati (Figura 1). Questo è forse il risultato della mitigazione degli effetti citopatici indotti dal vivo attenuato VZV in coltura cellulare.
Per determinare quale antigene VZV diluizione prodotto letture massime in termini di numero di SFU per 10 6 PBMC, IFN-γ ELISpot è stata effettuata utilizzando diluizioni doppie di γ irradiati vaccino VZV vivo attenuato e campioni di PBMC ottenuti da un gruppo di bambini immunocompetenti di età tra 9 mesi e 12 years che avevano una storia documentata di varicella e / o una sierologia positiva per VZV (n = 50). . Soggetti dello studio sono stati arruolati presso le Malattie Infettive Clinica ed Immunologia Clinica speciale del CHU Sainte-Justine tra giugno 2007 e settembre 2009 sono state osservate differenze statisticamente significative tra le frequenze mediana di cellule che producono IFN-γ che sono stati ottenuti utilizzando il 1:200, 1: 400 e 1:800 diluizioni di antigene VZV (p <0,0001, test di Kruskal-Wallis) (figura 2). Queste disparità sono state valutate con la differenza tra il 1:200 diluizione (mediana = 115.0 SFU per 10 6 PBMC; interquartile [IQR] = 75,0-232,5 SFU per 10 6 PBMC) e la diluizione 1:800 (mediana = 50.0 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU per 10 6 PBMC), e tra il 1:400 diluizione (mediana = 92,5 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU per 10 6 PBMC) e 1:800 diluizione (p <0,001 ep (Figura 2). Per questo motivo, la diluizione 1:200 di γ irradiato vivo attenuato vaccino VZV è stato selezionato per l'utilizzo in misure di routine di VZV cella specifica risposte immunitarie mediate.
Per determinare se la produzione di IFN-γ risiede in CD4 + e / o CD8 + T sottopopolazioni linfocitarie, campioni di PBMC ottenute da un donatore sano stati sottoposti a deplezione di CD4 + o CD8 + usando anti-CD4 e anti-CD8 anticorpi accoppiati biglie magnetiche secondo le istruzioni del fabbricante. In concordanza con i report pubblicati in precedenza 22,23, esaurimento delle cellule CD4 + ha comportato una riduzione notevole delle frequenze di cellule che producono IFN-γ che sono stati ottenuti utilizzando le 1:100, 1:200 e 1:400 diluizioni di antigene VZV, mentre deplezione di cellule CD8 + non ha portato a tale riduzione e controllo positivos (stimolazione con l'anticorpo monoclonale anti-CD3), non sono stati ugualmente colpiti (Figura 3). Questi risultati suggeriscono che la maggioranza delle cellule che producono IFN-γ in risposta alla stimolazione con antigeni VZV sono cellule T CD4 +. In alternativa, questi risultati potrebbero derivare da l'esaurimento delle cellule presentanti l'antigene CD4 + (cioè monociti, cellule dendritiche) dalla piscina PBMC, con conseguente riduzione dei livelli di presentazione del VZV antigeni di responder linfociti T CD8 +. L'uso del combustibile irraggiato VZV è improbabile che hanno contribuito alla inclinazione della risposta verso CD4 dominante, risultati analoghi sono stati ottenuti da altri gruppi con tecniche diverse e fonti antigene 14,21,22. A partire micrografia ingrandimento di pozzi ELISpot rappresentativi è presentato nella Figura 4.
| Problema / issue | Possibili cause | Soluzione / soluzione </ Td> |
| Alta sfondo / macchie mal definiti o confluenti | Un numero elevato di cellule morte. | Valutare la vitalità cellulare prima di coltura set-up e di stimolo. |
| Membrana inadeguata fasi pre-bagnanti. | Assicurati di rispettare tempo di pre-bagnatura e quella membrana turno al grigio dopo 1 min. 35% etanolo deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. | |
| Piatti spostati durante il periodo di incubazione. | Non spostare le piastre per evitare mal definiti spot sentiero lumaca. | |
| Lavare passi. | Lavaggio a mano è più efficiente di rondelle piastre. | |
| Formazione di aggregati proteici. | Filtra entrambi gli anticorpi di cattura e di rilevamento per ridurre background e punti di falsi positivi. | |
| Concentrazione di anticorpo secondario e il rilevamento. | Regolare biotinilato seconcentrazione di anticorpi condary / individuazione di ridurre sfondo. | |
| Reagenti in via di sviluppo a freddo. | Portare substrato a temperatura ambiente per evitare il sottosviluppo. | |
| Senza macchie / pozzi vuoti | Mal definito macchie. | Non impilare le piastre durante il periodo di incubazione di avere una temperatura omogenea nei diversi pozzetti. |
| Substrato di stimolazione non ben preparati. | Portare l'aliquota miscela peptidica a temperatura ambiente per 15 min per evitare la formazione di cristalli. | |
| Aggregazione delle cellule. | Risospendere le cellule in cella singola sospensione per evitare la sottovalutazione di unità in loco formano. | |
| Le cellule non stimolate adeguatamente. | Utilizzare un attivatore policlonale come controllo positivo. | |
| L'inibizione della reazione enzimatica Tween-20. | Erah piastre con PBS prima di aggiungere soluzione di substrato BCIP / NBT. | |
| Coppie di anticorpi sbagliati. | Assicurarsi che gli anticorpi di cattura e di rilevazione reagiscono con differenti epitopi antigenici. |
Tabella 1. Risoluzione dei problemi.
Figura 1. Effetto di γ-irradiazione di vaccino vivo inattivato VZV sulla frequenza di IFN-γ cellule che producono, come determinato utilizzando IFN-γ ELISpot. VZV specifica è stata eseguita IFN-γ ELISpot come descritto al protocollo testo utilizzando PBMC da un volontario controllo e diluizioni seriali di γ irradiati (10.000 Gy) vaccino vivo attenuato VZV come antigene. I dati rappresentano la media di MeasureMe duplicatonti e barre di errore rappresentano l'errore standard della media. PBMC: cellule mononucleate del sangue periferico; SFU: individuare unità formanti; VZV: virus varicella zoster.
Figura 2. Quantificazione dei VZV cella specifica mediata risposte immunitarie nei bambini con prove documentate di una precedente infezione da VZV. VZV specifico è stato eseguito IFN-γ ELISpot come descritto nel quadro del protocollo di testo utilizzando PBMC isolati da soggetti con una storia di varicella (n = 50) e diluizioni seriali di γ irradiati (10.000 Gy) vaccino vivo attenuato VZV come antigene. Le linee orizzontali rappresentano la mediana, scatole rappresentano range interquartile (IQR), e baffi rappresentano l'intervallo di valori. PBMC: cellule mononucleate del sangue periferico; SFU: individuare unità formanti; VZV: virus varicella zoster .
Figura 3. Effetto della deplezione di cellule T CD4 + o CD8 + sulla frequenza di cellule che producono IFN-γ misurato secondo IFN-γ ELISpot. Depletion di CD4 + o CD8 + e VZV specifico ELISpot IFN-γ sono state eseguite come descritto sotto Testo protocollo utilizzando PBMC da un volontario di controllo e diluizioni seriali di γ irradiati (10.000 Gy) vaccino vivo attenuato VZV come antigene. I dati rappresentano la media di misurazioni duplicati e barre di errore rappresentano l'errore standard della media. PBMC: cellule mononucleate del sangue periferico; SFU: individuare unità formanti; VZV: virus varicella zoster.
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Figura 4. Pozzetti rappresentativa ELISpot. VZV specifico IFN-γ ELISpot è stata eseguita come descritto al protocollo testo utilizzando PBMC di cinque volontari di controllo e diluizioni seriali di γ irradiati (10.000 Gy) vaccino vivo attenuato VZV come antigene. Prima fila: controlli negativi (medio AIM-V integrato con il 2% (v / v) IHS); seconda fila: controlli positivi (anti-CD3 anticorpo monoclonale); terza fila: antigene VZV. I numeri negli angoli superiori rappresentano SFU per pure misurato con un contatore posto automatizzato. PBMC: cellule mononucleate del sangue periferico; SFU: individuare unità formanti; VZV: virus varicella zoster; IHS: inattivato siero umano.
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Discussion
Modifiche e risoluzione di problemi: saggi IFN-γ ELISpot sono stati utilizzati per esaminare le risposte immunitarie mediate da cellule contro una varietà di patogeni microbici, inclusi tipo virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) 24,25, virus dell'epatite C (HCV) 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, solo per citarne alcuni. Qui abbiamo descritto lo sviluppo di un ELISpot test IFN-γ per misurare l'immunità cellulare contro, con la speranza di definire correlati di VZV specifico ricostituzione immunitaria nel recupero destinatari UCBT pediatrici.
Le caratteristiche principali di questo test sono quattro volte. In primo luogo, non richiede prima espansione in vitro di cellule T, che richiede molto tempo. In secondo luogo, può essere eseguita utilizzando campioni di PBMC crioconservati, che è meglio per minimizzare la variabilità interassay. Inoltre, la crioconservazione e di elaborazione parallela si adattano bene a longitudinalmentestudi nali, che richiedono che i campioni trattati in lotti. In terzo luogo, per evitare grumi di cellule incontrate durante lo scongelamento di PBMC, il trattamento con un ultrapura endonucleasi geneticamente da Serratia marcescens è stato utilizzato. Aggregazione cellulare dopo lo scongelamento PBMC si verifica più frequentemente quando si utilizzano campioni di sangue che sono rimasti tutta la notte a temperatura ambiente prima della lavorazione. L'incorporazione di endonucleasi geneticamente da Serratia marcescens è noto non influenzare la vitalità cellulare, espressione di marcatori di superficie cellulare e risposta alla stimolazione con l'antigene affine in termini di SFU da bassi livelli di nucleasi sono utilizzati e la durata dell'esposizione è breve 22. Quarto, γ irradiato vaccino VZV vivo attenuato è stato usato per stimolare PBMC. Esso è stato preferito coltura cellulare VZV derivata per assicurare uniformità di dose di antigene e di preparazione e di eliminare la necessità di manipolare vivo VZV in un ambiente clinico in cui la sicurezza dei pazienti epersonale di laboratorio è una delle principali preoccupazioni. Nel loro insieme, le modifiche che sono state introdotte nel saggio VZV-ELISpot erano destinate a renderlo più adatto per l'uso in un ambiente clinico.
Limiti della tecnica significatività rispetto ai metodi esistenti: metodi semplici, sensibili e riproducibili sono necessari per misurare cellula ospite risposte immunitarie mediate diretti contro antigeni microbici nel contesto del follow clinico. IFN-γ ELISpot è un test affidabile, riproducibile e informativo che può essere eseguita su campioni di sangue venoso mediante apparecchiature relativamente low-tech (centrifughe, incubatori, microscopio dissezione). Tuttavia, essa non è in grado consentono la rilevazione simultanea di più citochine e marcatori di superficie cellulare. Vitro T saggi tradizionali proliferazione cellulare, che sono stati classicamente utilizzati per il conteggio di CD4 + e CD8 + antigene specifile risposte delle cellule T c, sono alta intensità di manodopera, mancano di sensibilità e tendono a soffrire di un elevato grado di variabilità interdosaggio 30,31. D'altra parte, linfociti T citotossici saggi (CTL) in base alla lisi dei bersagli autologhi caricati con 51 Cr e limitando l'analisi di diluizione tendono a dipendere tempo passi espansione in vitro per quantificare specifiche cellule T CD8 + antigene che sono presenti in un bassa precursore frequenze 32,33. Saggi basati citometria a flusso che misurano la secrezione di citochine dopo stimolazione antigenica (citochine colorazione intracellulare [ICS]) 34,35 possono anche essere usati per caratterizzare le risposte immunitarie antigene-specifiche. ICS permette la rilevazione simultanea della produzione di citochine e di superficie cellulare espressione di marcatori fenotipici in singole cellule. La sensibilità di ICS paragona a quella di ELISpot, ma richiede un maggior numero di cellule 36,37. I metodi che fanno uso di classe I fluorescenti o una classe II peptide-macomplesso di istocompatibilità Jor (pMHC) oligomeri (tetrameri pMHC) 38-40 sono precisi e consentono la caratterizzazione multiparametrica di sottopopolazioni linfocitarie basato su espressione di marcatori di superficie delle cellule. Tuttavia, pMHC tetramero colorazione richiede la preventiva conoscenza dei pazienti antigene leucocitario umano (HLA) tipo, che può essere ingombrante e limitare iscrizione paziente in un dato studio. Un altro limite di questa tecnica è che pMHC tetramero colorazione permette principalmente la rilevazione di cellule T che esprimono medio alta affinità recettori delle cellule T (TCR) 41. D'altro canto, le cellule CD8 + T che esprimono TCR bassa affinità che non sono macchiati da tetrameri pMHC possono essere facilmente rilevati utilizzando IFN-γ ELISpot 41. Inoltre, tetrameri pMHC possono legarsi ai cosiddetti esausti linfociti CD8 + T che sono prevalenti nelle infezioni virali croniche 42,43, alterando così la valutazione funzionale delle cellule antigene specifico risposte immunitarie mediate. Finally, pMHC tetramero colorazione e ICS in genere richiedono personale altamente qualificato, reagenti relativamente costosi, sofisticati strumenti e strutture dedicate, rendendo queste tecniche notoriamente difficile da attuare in un follow-up clinico.
Le applicazioni future: doppio colore ELISpot saggi in grado di rilevare simultaneamente la produzione di IFN-γ sia e IL-2, 44 e metodi dual e triple-colore fluorospot 45 hanno generato notevole interesse, in quanto consentono la valutazione della polifunzionalità di antigene specifico T linfociti, che è una caratteristica importante di cellule efficiente risposte immunitarie mediate 46.
Fasi critiche all'interno del protocollo: Gli aspetti tecnici deve essere data attenta considerazione. Poiché molte variabili incidono sulla qualità del posto (cioè le dimensioni e densità) e intorpiditeer, l'adesione al protocollo è fondamentale per ottenere risultati sensibili e riproducibili. L'uso costante di specifici marchi di anticorpi monoclonali (cattura e rilevamento), piastre ELISpot con membrane PVDF, e il 35% di etanolo per il trattamento delle membrane prima del rivestimento è di grande importanza. Ad esempio, overtreatment con etanolo può influire sulle prestazioni del dosaggio e qualità spot. Per evitare di ottenere pozzetti uninformative (cioè> 300 spot), si consiglia di utilizzare non più di 2 x 10 5 PBMC per pozzetto. Quando di fronte a basse frequenze di cellule T antigene specifiche, sensibilità del test può essere migliorata dalle cellule prestimulating in vitro con antigene affine o ampliare con attivatori policlonali come fitoemoagglutinina (PHA) per un determinato periodo di tempo (in genere 3-7 giorni) 38 . Tuttavia, la procedura finale ottimizzato per il saggio ELISpot VZV qui presentato non comprende in prestimulation vitro e / o fasi di espansione. Numero e quality di macchie erano simili su una gamma di incubazione di 16-21 ore. Oltre 21 ore di incubazione, le macchie erano spesso più diffusa e talvolta sovrapposte, rendendo la loro enumerazione più difficile. Inoltre, spostando le piastre mentre le cellule sono incubando può portare a mal definiti macchie sentiero lumaca che sono anch'esse più difficili da contare. Ulteriori spunti di risoluzione dei problemi sono riportate nella Tabella 1.
Quando si utilizza un contatore posto automatico, la sensibilità e la dimensione del punto gating sono impostati mediante controllo positivo (anti-CD3 anticorpo monoclonale) e controllo negativo (medium AIM-V integrato con il 2% (v / v) IHS). Le caratteristiche importanti da considerare durante posto enumerazione sono dimensione e forma (Figura 4). Il primo permette di distinguere cellule macchie di citochine derivate T da sfondo punti che devono essere ignorati. Numero di spot fornisce una stima della frequenza di cellule T specifiche VZV presenti in un dato PBCampione MC, mentre dimensione del punto riflette quanto IFN-γ è prodotto da ogni singolo cellule.
A nostra conoscenza, questo è l'unico metodo ELISpot-IFN γ che fa uso di γ irradiato vivo attenuato vaccino VZV come antigene 4. Pannelli di peptidi sintetici sovrapposti (15-meri) sono stati utilizzati anche come antigene, compreso miscela di peptidi basati sulla sequenza aminoacidica della fosfoproteina VZV IE63. IE63 è altamente immunogenico 47 e sembra essere cruciale per l'infettività virale e la creazione di latenza di 48. Cellule T specifiche IE63 sono stati rilevati in soggetti sani donatori sieropositivi VZV 15, il che suggerisce che IE63 è un obiettivo importante di immunità mediata dalle cellule diretto contro VZV. Tuttavia, le cellule reattive sono risultati essere in gran parte delle cellule T CD4 + 15.
Il saggio VZV IFN-γ ELISpot è stato precedentemente utilizzato da our gruppo per valutare le specifiche risposte delle cellule T VZV in 28 bambini che hanno subito UCBT per il trattamento di neoplasie o malattie del sangue ereditarie 4. I risultati che sono stati ottenuti nel corso di questo studio suggeriscono che sia CD4 + e sottogruppi di cellule T CD8 + sono stati implicati nella produzione di IFN-γ e che ricostituzione del vano naive cellule CD8 + T comportato più robusta cella specifica VZV risposte immunitarie mediate in termini di produzione di IFN-γ. È importante sottolineare che questi risultati hanno anche mostrato che l'individuazione di oltre 150 SFU per 10 6 PBMC era coerente con cellule T mediata protezione contro l'infezione VZV o riattivazione 4. Tuttavia, questo valore soglia per VZV specifica cella mediata nel contesto della UCBT e conseguente ricostituzione immunitaria o la loro mancanza dovrà essere convalidato in grandi studi multicentrici prospettici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i partecipanti allo studio e ai loro genitori. Vorremmo anche ringraziare il Dott. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) per l'accesso al suo lettore ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov per l'analisi statistica, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty per esperto tecnico assistenza. Sostenuto da finanziamenti le Fonds d'opération pour les projets de recherche clinique et d'evalution des tecnologie (CHU Sainte-Justine) per HS e PO, per la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, e dal Leukemia & Lymphoma Society of Canada. ISF è stato sostenuto da borse di studio la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG è stato il destinatario di borse di studio dal Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Malattie infettive, Université de Montréal (Gabriel-Marquis borsa di studio), FRQS, e la Canadian Institutes of Health Ricerca (CIHR). NM è stato supportato da la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondazione Cole, e FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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