Summary
이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).
Abstract
수두 대상 포진 바이러스 (VZV)는 탯줄 혈액 이식 (UCBT) 다음과 같은 병적 상태와 사망률의 중요한 원인이다. 이러한 이유로, antiherpetic 예방은 VZV 감염과 관련된 합병증을 방지하기 위해 소아 UCBT받는 사람에게 체계적으로 투여하지만, 최적의 기간을 정의하는 더 강력한 증거 기반의 합의가되지 않습니다. T 세포 성 면역은 UCBT는 예방이 유지되어야하거나 중단 할 수 있는지 여부에 대해 표시를 제공 할 수있는 다음과 같은 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성을 평가, VZV 감염의 관리에 대한 책임이 있기 때문이다. 이를 위해, VZV 특정 감마 인터페론 (IFN-γ), 효소 - 결합 immunospot (ELISPOT) 분석은 조사 된 약독 VZV 백신 시험 관내 자극에 반응하여 T 림프구에 의해 IFN-γ 생산을 특성화하기 위해 개발되었다. 이 분석은 VZV 특정 C의 빠른 재현하고 민감한 측정을 제공합니다엘 임상 환경에서 VZV 특정 면역 재구성을 모니터링하고 VZV 항원에 면역 응답 성을 평가하기위한 적절한 면역을 중재.
Introduction
처음으로 1989 년에 수행 UCBT 점점 아이들 1에서 다양한 종양 및 nonneoplastic 혈액 장애의 치료의 일부로서 사용된다. VZV는 두 개의 서로 다른 질환, 수두 (차 감염 후)과 대상 포진 (활성화 후)를 일으키는 원인이되는 세포 변성 인간 alphaherpesvirus입니다. 차 감염 후, VZV는 후근 신경절의 감각 신경에서 숨겨 호스트의 전 생애에 걸쳐 지속. UCBT 다음 가장 위협하는 감염성 합병증의 하나가 VZV 2-4와 연결되어 있습니다. 우리의 임상 센터에서, VZV 예방의 부재에서 3 년에서 VZV 질환 VZV 질환의 누적 발생률은 postUCBT 46 % 2. 이러한 환자에서 새로이 감염 또는 VZV의 재 활성화는 종종 중추 신경계, 폐, 간 5-7에 내장 보급과 관련이 있습니다. 그 결과, 아 시클로 비르, 팜 시클로 비어 발라 시클로 비르 또는 예방 일반적 UB에 투여함에CT받는 8,9. 그러나,이 치료 전략의 계정에 VZV 특정 T 림프구 또는 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성의 반응 속도의 보호 가능성을 고려하지 않습니다. 장기 antiherpetic 예방의 확장 사용과 관련된 잠재적 인 문제는) 환자의 overtreatment를 포함한다; b) 항 바이러스 약제 내성 10, 11의 개발; 및 C) VZV 특정 면역 재구성 (12, 13)의 손상. 기능 VZV 특정 T 림프구의 검출은 이식 후 기간 동안 VZV에 대한 감독 세포 매개 면역 반응을 모니터링, VZV 감염에서 장기 보호의 존재와 개선 된 임상 결과 4,14,15과 관련이 있기 때문에 바이러스의보다 합리적인 사용이 발생할 수 있습니다 VZV부터 혜택을받을 환자를 구별하기 위해 의료인 있도록함으로써 치료는 그의 면역 시스템 VZV 복제 4,13를 제어 할 수있다 것과 예방 치료.
IFN-γ ELISPOT 분석 널리 실험 시스템 및 임상 다양한 조건의 모니터링 세포 매개 면역 반응에 사용됩니다. 스팟은 반응 사이트에 가시적이고 안정적 침전물을 생성, 발색 기질의 절단 뒤에 생성된다. 각각의 자리하여 개별 사이토 카인을 생산하는 셀의 공간을 나타냅니다. IFN-γ ELISPOT은 동족 항원 시험 관내 자극에 응답하여 IFN-γ를 생산하는 개별 세포를 생체의 능력을 측정 할 수있을뿐 아니라 관련 세포 집단 (16, 17)의 셀 응답의 주파수의 추정치를 제공한다. 높은 감도 외에, IFN-γ ELISPOT은 항 바이러스 치료의 개시 또는 정지를 안내 겨냥 개인화 임상 프로토콜 컨텍스트에서 가능한 사용을 만드는 수행 간단하다. 절차는 describ 아래에 자세히 설명ES 구체적 VZV 유래 항원 시험 관내 자극 다음 말초 혈액 단핵 세포에 의해 IFN-γ의 생산을 검출하고 측정하기 위해 설계된 ELISPOT 분석.
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Protocol
이 연구 프로토콜은 연구가 실시되었다 CHU 세인트 - 저스틴, 몬트리올, 퀘벡, 캐나다의 기관 윤리 심의위원회의 승인을 받았다. 동의가 추구하고 모든 연구 참가자, 부모 또는 법적 보호자로부터 얻은 것입니다. 전체 절차는 1 일에 수행하고 2 (a 층류 후드하에 즉) 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 인간의 혈액을 처리하기위한 표준 안전 절차를 엄격하게 준수해야합니다.
1. 플레이트를 코팅
- 각 웰에 1 분 35 % 에탄올 20 μl를 추가하여 96 웰 MultiScreen의 IP 흰색 ELISPOT 플레이트의 하단에 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막을 투과. 막 약간 반투명하게한다.
- MUL을 사용하여, 즉시 1X 인산염 완충 생리 식염수 200 μL (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, pH 7.4의 PBS)와 웰을 3 회 세척피펫 또는 유사한 장치를 tichannel. 이 단계는 에탄올 잔기가 세포 생존에 영향을 포획 항체에 결합 할 수있는 관련 중요하다. ELISPOT 판은 연약하고 신중하게 처리해야한다 : 자동 접시 세척기의 사용을 권장하지 않습니다.
- 코트 10 μg / ML의 최종 농도에 1X PBS에 희석 정제 된 마우스 항 - 인간 IFN-γ 캡처 항체의 10 μL와 우물. 일반 플라스틱 랩으로 접시를 덮고 4 ℃에서 하룻밤 배양
2. 플레이트 차단
- 그들이 건조 도청, 우물을 비우기 및 1X PBS 200 μL와 접시에게 5 번 씻는다.
- 전체 RPMI 1640 배지 200 ㎕ 씩 우물을 입력하고 (단계 차단) 37 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 플레이트는 1X PBS 200 ㎕ 씩 5 배 세포 도금 할 준비가 될 때까지 전체 1X PBS의 우물을 계속 씻으십시오.
3. 셀 도금 및 자극
- P 준비표준 절차를 사용하여 피콜-Paque 구배 원심 분리에 의해 인간의 정맥 혈액 샘플로부터 eripheral 혈액 단핵 세포 (PBMC). 또한, 표준 방법을 사용하여, 액체 질소에서 냉동 PBMC의 분취 량을 해동. 마지막으로 원심 분리,에 resuspend ml의 2 × 10 6 세포 /의 최종 농도에서 세포와 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 한 후.
- 인큐베이터에서 PBMC를 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지 5 ㎖의 최종 부피를 재현 탁.
- 실온에서 5 분간 세라 티아 마르세 슨스에서 유전자 조작 효소의 10 μL의 존재에 PBMC를 품어.
- PBMC의 50 μL 나누어지는을 제거하고 트리 판 블루 염색의 50 μL와 혼합. 세포를 세어 혈구와 현미경 검사 (염료 배제 방식)를 사용하여 %의 가능성을 예상하고있다. 셀 카운팅과 세포 생존 캔 알의 평가를위한 다양한 자동화 된 방법그래서 사용. PBMC는> 95 % 실행 가능해야합니다. 가능성이 95 %보다 낮은 경우 샘플을 폐기하십시오.
- 5 분, 폐기 뜨는, 2 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (HIS)와 보충 AIM-V 매체에 resuspend 세포 700 XG에 원심 분리기 PBMC. 자극 혼합물이 판에 추가 될 때까지 37 ℃에서 보관하십시오.
- , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 자극 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 후술하는 바와 같이 세 개의 자극의 혼합물이 사용되어야한다 :
- 사용 AIM-V 매체는 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (IHS)와 같은 음성 대조군과 보충.
- 0.5 ㎍ / ml로 긍정적 인 제어)의 최종 농도 2 % (V / V) IHS 보충 AIM-V 매체에 희석 항 CD3 단클론 항체 (클론 OKT3)를 사용합니다.
- γ-조사 중 하나의 형태로, VZV의 항원을 사용하여 (10,000 Gy를, 30 분의 노출 시간) 감쇠 VZV 백신 (1,350 플라크 형성 단위 [PFU] / ml)에 살고 diluAIM-V 매체의 테드 1:200 2 % (V / V) IHS) 또는 즉시 초기에 VZV의 순서 (IE63) 인 단백질에 따라 합성 67 펩티드 (15 아미노산 잔기)의 몰 혼합물의 1 μg로 보충 . PBMC 배양 4 일 후 세포 변성 효과의 흔적이 없음을 모니터링하여 조사 효과를 제어 할 수 있습니다.
- 중복의 모든 우물을 준비합니다.
- , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 우물 단계 5.4에서 준비 세포를 100 μl를 추가합니다. 두 우물은 음성 대조군없이 남아 있어야합니다. 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 20 시간 동안 배양한다. 흔들 이동하거나 배양하는 동안 서로의 위에 접시를 쌓아 두지 마십시오.
4. 스팟 개발 및 검출
- 세포를 버리고 1X PBS로 접시에게 배 세척 0.05 % (V / V) 트윈 20 (PBST)로 보충. 트윈 20은 PVDF 나에 부착 한 세포를 분리하는 데 도움이하룻밤 배양 한 다음 mbrane.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여, 0.5 mg의 100 μl를 추가 / ㎖의 바이오틴 결합 된 항-IFN-γ 모노클로 날 항체 (w / v) 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 %를 함유하는 1X PBS에 희석 (4S.B3 클론). 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
- 우물 PBST로 6 배 세척하고 각 웰에게 (W / V) BSA 0.5 %를 포함 1X PBS에서 1:1000 희석 알칼리 포스 파타 아제와 스트렙 타비 딘의 conjugatd 100 μl를 추가합니다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 판을 PBST로 3 배 세척하고 1X PBS로 3 배. 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 일 포스페이트 (BCIP) / 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 기질 용액 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분간 배양한다.
- 증류수 흐르는 물에 접시를 씻으십시오. ELISPOT 플레이트의 바닥 부분을 제거하고 증류수로 멤브레인의 양면을 씻는다. 공기는 판을 건조.
- 우물을 검사하고 입체 D를 사용하여 지점을 열거issection 현미경 또는 자동화 자리 카운터를 사용하여 번호판을 검색합니다. 그들은 동일한 날에 시험 될 수없는 경우에 얻어 빛으로부터 판을 유지한다.
- 해당 중복 우물에서 계산 지점의 수를 평균 및 테스트 우물 계산 반점의 수와 부정적인 제어 우물에서 계산 지점의 수 (무 세포)를 뺍니다.
- 10 6 PBMC 당 반점 형성 단위 수 (SFU)으로 IFN-γ 생산을 표현한다.
- SFU의 수가 대조군 이상> 50 10 당 6 PBMC 2 표준 편차 (SD) 인 경우 그 시료가 긍정적 인 고려 (세포 + AIM-V 매체는 2 % (V / V) IHS 보충).
- 장소는 계산이 너무 많은 경우 잘 당 400 SFU의 값을 사용합니다.
- 테스트 ELISPOT 데이터는 일반적으로 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 분산할지 여부. 데이터가 정규 분포를하는 경우, 학생의 t TES를 사용하여 통계적인 비교를 수행T (2 그룹) 또는 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트 (다중 비교). 데이터가 정규 분포를하지 않는 경우는 Mann-Whitney U 테스트 (2 그룹) 또는 크루스 칼 - 월리스 테스트와 던의 사후 테스트 (다중 비교)을 사용합니다.
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Representative Results
위에서 자세히 IFN-γ ELISPOT 프로토콜은 크기 및 VZV 4 향한 세포 매개 성 면역 반응의 품질을 측정하기 위해 개발하고 실험실에서 최적화되었다. VZV 항원의 다양한 소스는 자극 공정에 사용될 수있다. 풍향 :) VZV에서 시판 세제를 불 활성화 추출물 베로 세포 18 감염; IE63 15 ORF4 19을 포함한 특정 VZV 인코딩 된 단백질의 합성 펩티드를 중복 B) 풀; C) 약독 화 수두 대상 포진 백신 20 살; 와 D) VZV의 UV 불 활성화 준비가 중단 VZV의 상층 액 항원 MRC 셀 (14)을 감염. 세포 배양 항원 소스와 준비의 균일 성을 확보하고 임상 원내 변속기에 살고있는 야생형 VZV 균주의 배양 및 조작을 제한하기 위해 VZV 파생을 통해 우리의 경우, 약독 VZV 백신을 희석하는 것이 바람직했다N은 심각한 우려 10. 또한, γ 조사로 인해 전달 될 수있는 γ 방사선 투여와 비교 정밀도 UV 불 활성화 21 선호하고, UV는 달리, γ-선을 효율적으로 VZV가 들어있는 밀봉 된 유리 병을 침투하기 때문이다. 바이러스 주식의 조사 시험 VZV 항원 (그림 1)의 모든 희석에 건강한 기증자로부터 얻은 PBMC 샘플에서 VZV 특정 IFN-γ 생성 세포의 주파수를 지속적으로 높은 추정되었다. 이것은 아마도 세포 배양액에서 약독 VZV 의해 유도 된 세포 변성 효과의 완화의 결과이다.
희석 VZV 항원 10 6 PBMC 당 SFU의 숫자면에서 최대 판독 값을 산출 확인하려면, IFN-γ ELISPOT은 생균 VZV 백신을 조사 γ의 2 배 희석액을 사용하여 수행하고 PBMC 샘플은 세 면역 아이들의 그룹에서 얻은 것 9개월 12 너희 사이수두 및 / 또는 양의 VZV에 대한 혈청 검사 (N = 50)의 문서화 된 역사를 가지고 ARS. . 연구 대상 2007 년 6 월 2009 년 9 월 사이의 감염성 질환 클리닉 CHU 세인트 - 저스틴 특별 면역학 클리닉에 등록 된 통계적으로 유의 한 차이는 1:200, 1을 사용하여 얻은 IFN-γ 생성 세포의 중간 주파수 사이에 관찰되었다 : VZV 항원 (P <0.0001, 크루스 칼 - 월리스 시험) (그림 2)의 400 1:800 희석. 이러한 불균형은 1:200 희석 사이의 차이를 차지했다 (평균 = 10 6 PBMC 당 115.0 SFU, 분위수 범위 [IQR] = 75.0 - 10 6 PBMC 당 232.5 SFU)와 1:800 희석 (평균 = 50.0 SFU 10 6 PBMC 당, IQR은 = 20.0 - 10 6 PBMC 당 105.0 SFU), 그리고 1:400 희석 (중간 사이 = 92.5 10 6 PBMC 당 SFU, IQR = 52.5 - 10 6 PBMC 당 177.5 SFU)와 1:800 희석 (P <0.001과 P (그림 2). 이 때문에, γ의 1:200 희석 생균 VZV 백신은 VZV 특정 세포 매개 성 면역 반응의 측정 루틴에서 사용을 위해 선택되었다 조사.
IFN-γ 생산이 CD4 + 및 / 또는 CD8 + T 림프구의 부분 집합에 상주 여부를 확인하려면, 건강한 기증자로부터 얻은 PBMC 샘플 안티 - CD4 또는 항 CD8 항체 결합 자석 구슬을 사용하여 CD4 + 나 CD8 + 세포의 고갈을 실시 하였다 제조업체의 지시에 따라. 이전에 게시 된 보고서 (22, 23)와 일치에서, CD4 + 세포의 고갈, VZV 항원의 1:100, 1:200 및 1:400으로 희석하여 얻은 IFN-γ 생성 세포의 빈도에서 현저한 감소를 초래 CD8 + 세포의 고갈은 감소하고 긍정적 인 제어로 연결되지 않은 상태초 (항 CD3 단클론 항체로 자극)과 유사 (그림 3) 영향을받지 않았다. 이러한 결과는 VZV 항원으로 자극에 응답하여 IFN-γ 생산 세포의 대부분은 CD4 + T 세포임을 시사한다. 또한, 이러한 결과는 PBMC 풀 (즉, 단핵 세포, 수지상 세포) CD4 + 항원 제시 세포의 고갈에서 줄기 수, VZV의 프레 젠 테이션의 감소 수준을 선도하는 CD8 + T 림프구를 응답하는 항원. 조사 VZV의 사용은 CD4 지배력을 향한 응답의 기울임에 기여하지 않을 수 있습니다, 유사한 결과는 서로 다른 기술과 항원 소스 14,21,22를 사용하여 다른 그룹에 의해 얻어졌다. 대표 ELISPOT 우물의 낮은 배율의 현미경 사진은 그림 4에 제시되어있다.
| 문제 / 문제 | 가능한 원인 | 해결 방법 / 솔루션 </ TD> |
| 고 배경 / 가난하게 정의 또는 합류 지점 | 죽은 세포의 높은 숫자. | 문화의 설정과 자극하기 전에 세포 생존 능력을 평가합니다. |
| 부적절한 막 사전 습윤 단계. | 1 분 후 회색 사전 습윤 시간과 그 막 회전을 존중해야합니다. 35 % 에탄올을 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다. | |
| 플레이트는 배양 기간 동안 이동. | 제대로 정의 달팽이 흔적 지점을 피하기 위해 번호판을 이동하지 마십시오. | |
| 단계를 씻으십시오. | 수동 세척 접시 세척기보다 더 효율적입니다. | |
| 단백질 응집체의 형성. | 배경과 거짓 긍정적 인 반점을 줄이기 위해 모두 캡처 및 탐지 항체를 필터링합니다. | |
| 이차 및 검출 항체 농도. | 바이오틴 자체를 조정배경을 감소시키기 condary / 검출 항체 농도. | |
| 콜드 발전 시약. | 저 발전을 피해 실온까지 기판을 가져온다. | |
| 없음 장소 / 빈 우물 | 저조한 지점을 정의. | 다른 우물에서 균일 한 온도를 가지고 배양 기간 동안 접시를 쌓아 두지 마십시오. |
| 자극 기판 잘 준비하지. | 크리스탈 형성을 방지하기 위해 15 분 동안 실온으로 펩타이드 혼합물 나누어지는 가져 오십시오. | |
| 세포 응집. | 스폿 형성 단위의 과소를 피하기 위해 단일 세포 현탁액으로 세포를 재현 탁. | |
| 세포는 적절하게 자극하지. | 양성 대조군으로 클론 활성제를 사용합니다. | |
| 트윈 -20에 의한 효소 반응 억제. | 이 되었나요BCIP / NBT 기질 용액을 추가하기 전에 PBS와 H 판. | |
| 잘못된 항체 쌍. | 캡처 및 탐지 항체가 다른 항원 에피토프에 반응해야합니다. |
표 1. 추가 문제 해결.
으로 IFN-γ 생성 세포의 주파수에서 방송 비활성화 VZV 백신의 γ-조사 그림 1. 효과 사용하여 결정 IFN-γ ELISPOT. VZV 특정 IFN-γ ELISPOT는 제어 자원 봉사에서 PBMC를 사용하여 프로토콜 텍스트에 설명 된대로 수행 하였다 (10,000 Gy의) 조사 γ의 시리얼 희석 항원 감쇠 VZV 백신을 살고있다. 데이터 중복 방식 측정의 평균을 나타냅니다국세청 및 오류 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. PBMC 말초 혈액 단핵 세포; SFU : 단위를 형성하는 자리; VZV : 수두 대상 포진 바이러스.
VZV의 그림 2. 정량화 특정 세포로 이전 감염의 문서화 된 증거를 가진 아이들에서 면역 반응을 매개 VZV. VZV 특정 PBMC는 수두의 역사를 가진 주체로부터 격리 (N = 50)를 사용하여 프로토콜 텍스트에 설명 된대로 IFN-γ ELISPOT을 수행 하였다 및 (10,000 Gy의) 조사 γ의 시리얼 희석 항원 감쇠 VZV 백신을 살고있다. 수평 라인이 상자 분위 범위 (IQR)를 나타내고, 평균을 나타내며, 수염 값의 범위를 나타냅니다. PBMC 말초 혈액 단핵 세포; SFU : 단위를 형성하는 자리; VZV : 수두 대상 포진 바이러스 .
에 설명 된대로 그림 3. IFN-γ ELISPOT. CD4 +의 고갈 또는 CD8 + 세포와 VZV 특정 IFN-γ ELISPOT을 이용하여 측정 한 IFN-γ 생성 세포의 빈도에 CD4 + 나 CD8 + 세포의 파괴의 효과는 실시 하였다 (10,000 Gy의) 조사 제어 자원 봉사 및 γ의 시리얼 희석에서 PBMC를 사용하여 프로토콜 텍스트 항원 감쇠 VZV 백신을 살고있다. 데이터는 중복 측정하고 오차 막대의 평균치가 평균의 표준 오차를 나타낸다 나타낸다. PBMC 말초 혈액 단핵 세포; SFU : 단위를 형성하는 자리; VZV : 수두 대상 포진 바이러스.
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그림 4. 대표 ELISPOT 우물. VZV 특정 IFN-γ (10,000 Gy의)이 항원으로 감쇠 VZV 백신을 살고 조사 다섯 제어 자원 봉사자와 γ의 시리얼 희석에서 PBMC를 사용하여 프로토콜 텍스트에 설명 된대로 ELISPOT을 수행 하였다. 첫 번째 행 : 음성 대조군 (AIM-V 매체는 2 % (V / V) IHS 보충) 두 번째 행 : 양성 대조군 (항-CD3 단클론 항체) 세 번째 행 : VZV 항원. 자동화 된 스폿 카운터를 사용하여 측정 된 상부 모서리에있는 숫자는 웰 당 SFU를 나타낸다. PBMC 말초 혈액 단핵 세포; SFU : 단위를 형성하는 자리; VZV : 수두 대상 포진 바이러스; IHS : 인간 혈청을 불 활성화.
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Discussion
변형 및 문제 해결 : IFN-γ ELISPOT 분석법은 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 24, 25, 간염 C 바이러스 (HCV) (26)를 포함하여 미생물 병원체의 종류에 대하여 지시 세포 매개 성 면역 반응을 조사하는 데 사용되어, 27, 및 결핵균 28,29, 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 여기에서 우리는 소아 UCBT받는 사람을 복구하는 VZV 특정 면역 재구성의 상관 관계를 정의하는 희망으로, 대한 세포 성 면역을 측정하는 IFN-γ ELISPOT 분석의 개발을 설명했다.
이 분석의 주요 특징은 4 배입니다. 첫째, 시간 소모적 인 T 세포의 시험 관내 팽창 이전을 필요로하지 않는다. 둘째, 간 (interassay) 변동을 최소화하는 최선의 동결 보존 PBMC 시료를 사용하여 수행 될 수있다. 또, 냉동 보존 및 병렬 처리가 잘 longitudi하도록되어있다샘플을 일괄 적으로 처리 할 것을 요구 NAL 연구. 셋째, PBMC, 고순도 세라 티아 마르세 슨스에서 유전자 조작 효소 사용과 치료의 해동시 발생하는 세포의 응집을 방지합니다. 처리하기 전에 실온에서 하룻밤 남아있는 혈액 샘플을 사용할 때 해동 PBMC에 따라 세포 응집이 더 자주 발생합니다. 세라 티아 마르세 슨스에서 유전자 변형 효소의 결합이 사용된다 클레아의 저급시기 SFU 측면에서 세포 생존, 세포 표면 마커의 발현과 동족 항원 자극에 대한 반응에 영향을 미치지 않기 위하여 공지과 노출 기간은 22 짧으면된다. 넷째, γ 조사 약독 VZV 백신은 PBMC를 자극하는 데 사용 하였다. 이것은 항원의 투여 량 및 제제의 균일 성을 확보하기 위해 환자의 안전성 및 임상 환경에서 살아있는 VZV 조작의 필요성을 극복하기 위하여 세포 배양 물 유래 VZV 선호했다실험실 직원이 주요 관심사입니다. 이와 함께, VZV-ELISPOT 분석에 도입 된 수정은 더 나은 임상 환경에서 사용하기에 적합하게 구성되었다.
기존의 방법에 대한 기술의 중요성의 제한 사항, 알기 쉬운 민감하고 재현성있는 방법은 임상 후속의 환경에서 미생물 항원에 대한 감독 숙주 세포 매개 면역 반응을 측정하기 위해 필요합니다. IFN-γ ELISPOT은 상대적으로 낮은 기술 장비 (원심 분리기, 인큐베이터, 해부 현미경)을 사용하여 정맥의 혈액 샘플에서 수행 할 수있는 강력한 재현하고 정보를 분석합니다. 그러나, 용이하게 여러 사이토 카인과 세포 표면 마커의 동시 검출을 허용하지 않는다. 고전적인 CD4 +와 CD8 +의 열거 형 항원이 사양에 사용 된 기존의 체외 T 세포 증식 분석,C T 세포 반응은 노동 집약적 민감도 부족과 간 (interassay) 변동성 (30, 31)의 높은 수준에서 고통을하는 경향이있다. 한편, 세포 독성 T 림프구 분석법 (CTL)가 51 크롬 및 제한 희석 분석 적재자가 표적의 용해에 근거는 존재 아르 항원 특정 CD8 + T 세포를 정량화하기위한 생체 외 팽창 단계에 소요되는 시간에 의존하는 경향 낮은 전구체 (32, 33) 주파수에서. 항원 자극 (세포 내 사이토 카인 염색법 [ICS]) 34,35 또한 항원 특이적인 면역 반응을 특성화하기 위해 사용할 수있는 다음과 같은 사이토 카인의 분비를 측정 계측법 기반 분석법을 흐른다. ICS는 사이토 카인 생성 및 단일 세포에서 표현형 마커의 세포 표면 발현의 동시 검출을 허용한다. ICS의 감도 ELISPOT의 것과 비교하지만 셀 (36, 37)의 큰 숫자를 필요로한다. 형광 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드-MA의 활용 방법조의 조직 적합성 복합체 (pMHC) 올리고머 (pMHC의 테트라)은 38 ~ 40은 정확하고 세포 표면 마커의 발현에 따라 림프구 아형의 multiparametric 특성을 가능하게합니다. 그러나 pMHC의 테트라 염색은 복잡하고 주어진 연구에 환자 등록을 제한 할 수 있습니다 환자의 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형에 대한 사전 지식이 필요합니다. 이 방법의 또 다른 한계는 pMHC 량체 염색은 주로 높은 친화력 T 세포 수용체 (TCR)에 매체 (41)를 발현하는 T 세포의 검출을 허용한다는 것이다. 한편, pMHC의 테트라 스테인드되지 않습니다 선호도가 낮은 TCR도를 표현하는 CD8 + T 세포는 쉽게 IFN-γ ELISPOT (41)를 사용하여 검출 할 수있다. 또한, pMHC의 테트라함으로써 항원 특정 세포 매개 면역 반응의 기능 평가를 왜곡, 만성 바이러스 성 감염 42,43에 유행하는 소위 소진 CD8 + T 림프구에 바인딩 할 수 있습니다. FINA베드로, pMHC 량체 염색 및 ICS는 일반적으로 임상 후속 환경에서 구현하기 위해 이러한 기술이 어렵기로 악명하고, 고도로 훈련 된 인력, 비교적 고가의 시약, 정교한 장비 및 전용 설비가 필요합니다.
미래의 응용 프로그램 : 동시에 IFN-γ와 IL-2 (44)와 듀얼 및 트리플 컬러 fluorospot 방법들은 항원의 polyfunctionality의 평가는 특정 T 수로 (45)는, 상당한 관심을 생성 한 양의 생산을 검출 할 수있는 듀얼 컬러 ELISPOT 분석 실험 효율적으로 세포 매개 성 면역 반응 (46)의 중요한 기능입니다 림프구.
프로토콜 내에서 중요한 단계 : 추가 기술적 인 문제는 신중하게 고려되어야한다. 많은 변수가 자리 품질 (즉, 크기와 밀도)과 감각에 영향을 미칠 수 있기 때문에어, 프로토콜의 준수는 민감하고 재현 가능한 결과를 달성하기 위해 필수적이다. 특정 단일 클론 항체의 브랜드 (캡처 및 탐지), PVDF 멤브레인와 ELISPOT 플레이트, 사전 코팅 막 처리를위한 35 % 에탄올의 일관된 사용은 높은 중요하다. 예를 들어, 에탄올 overtreatment는 분석 스폿 품질의 성능에 영향을 미칠 수있다. 가치가없는 우물 (예> 300 반점)을 얻는 것을 방지하기 위해, 우리는 더 이상 5 10 × 2 이상 PBMC를 사용하여 잘 당 좋습니다. 항원 특정 T 세포의 낮은 주파수에 직면했을 때, 분석 감도가 동족 항원 체외에서 prestimulating 세포에 의해 강화 된 또는 정의 된 시간 동안 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)와 같은 클론 활성제 (일반적으로 3-7일)로 확장 할 수있다 (38) . 그러나 여기에 제시된 VZV ELISPOT 분석을위한 최적화 된 최종 절차는 체외 prestimulation 및 / 또는 확장 단계에 포함되지 않습니다. 수와 qualit에지점의 Y는 16 ~ 21 시간의 배양 범위에서 유사했다. 배양 21 시간을 넘어, 장소는 열거가 더 어려워 종종 확산하고 때로는 중복되었습니다. 또한, 세포 배양하는 동안 판을 이동하는 마찬가지로 계산하기가 더 어렵 제대로 정의 달팽이 트레일 명소로 이어질 수 있습니다. 추가적인 문제 단서는 표 1에 제공된다.
자동화 자리 카운터, 감도 및 초점 크기의 게이트를 사용하는 경우 양성 대조군 (항 CD3 단클론 항체) 및 음성 대조군 (AIM-V 매체는 2 % (V / V) IHS 보충)를 사용하여 설정됩니다. 자리 열거하는 동안 고려해야 할 중요한 특성은 크기와 모양 (그림 4)이다. 전 하나는 무시해야 배경 장소에서 T 세포 유래 사이토 카인 지점을 구별 할 수 있습니다. 스팟 번호 관련 PB 존재 VZV 특정 T 세포의 주파수의 추정치를 제공한다MC 샘플, 반점의 크기는 각각의 세포에 의해 생산 얼마나 많은 IFN-γ 반영하고있다.
우리의 상식으로,이 항원 4로 VZV 백신 감쇠 라이브 조사 γ의 사용을 만드는 유일한 IFN-γ ELISPOT 방법입니다. 중복 합성 펩티드 (15-mers의)의 패널도 VZV IE63의 인 단백질의 아미노산 서열에 근거 펩티드의 혼합물을 포함하여 항원으로 사용되어왔다. IE63은 47 높은 면역 원성 및 바이러스 성 감염 및 지연 (48)의 설립을위한 중요한 것 같습니다. IE63 특정 T 세포는 IE63가 VZV에 대한 감독 세포 성 면역의 중요한 대상 것을 제안 건강한 VZV의 혈청 양성 기증자 15 일에 발견되었다. 그러나, 반응성 세포는 주로 CD4 + T 세포 (15) 인 것으로 밝혀졌다.
VZV IFN-γ ELISPOT 분석은 이전에 O에 의해 사용되었다종양 또는 상속 혈액 장애 4를 치료하기 위해 UCBT을받은 28 어린이 VZV 특정 T 세포 반응을 평가하기 UR 그룹. 이 연구의 과정에서 얻어진 결과는보다 강력한 VZV 특정 세포 매개 면역 반응의 주도 CD4 +와 CD8 + T 세포의 하위 집합이 모두 IFN-γ 생산과 순진 CD8 + T 세포 구획의 재구성에 연루되었다는 것을 제안 IFN-γ 생산의 측면. 중요한 것은, 이러한 결과는 또한 10 6 PBMC 당 150 SFU의 검출이 VZV 감염 또는 재 활성화 4에 대한 T 세포 매개 성 보호와 일치 함을 보여 주었다. 그러나, VZV UCBT의 맥락에서 특정 세포 성 면역과 계속되는 면역 재구성 또는 부족이 임계 값은 이들의 더 큰 잠재 다기관 연구에서 검증 될 것이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 연구 참가자와 그들의 부모를 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 ELISPOT 리더, 통계 분석 박사 Lubo 알렉산드로에 액세스 박사 Réjean LAPOINTE (미끼 노트르담, 몬트리올, 캐나다) 감사, 데니스 BLAIS, 산드라 카론, Silvie 루아 및 기술 전문가에 대한 마틴 CATY 것 지원. 르 퐁 디부 작업 라 매그 센터 드 cancérologie 찰스 - Bruneau에 의해, HS 및 PO에 레 projets 드 공들인 크리니크 등 디부 인 evalution 데 기술 (CHU 세인트 - 저스틴)를 부어, 그리고 백혈병과 림프종 사회에 의해에서 교부금에 의해 지원 캐나다. ISF는 라 매그 CHU 세인트 - 저스틴 르 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡 - 상테 (FRQS)에서 장학금으로 지원되었다. AJG 미생물학, Infectiology & 면역학, Université 드 몬트리올 (가브리엘 - 후작 장학금), FRQS학과에서 장학금을받는 사람, 그리고 건강의 캐나다 연구소 R이 esearch (CIHR). 뉴 멕시코 라 매그 CHU 생트 저스틴, 콜 재단과 FRQS에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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