Summary
Novel generasjoner av funksjonelle analyser slik som gamma-interferon (IFN-γ) ELISPOT, som registrerer cytokin produksjon på celle-nivået, og gi både kvantitativ og kvalitativ karakterisering av T-celle-responser kan bli brukt for å vurdere celle-medierte immunresponser rettet mot varicella zoster virus (VZV).
Abstract
Varicella zoster virus (VZV) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet etter navlestreng blod transplantasjon (UCBT). Av denne grunn er antiherpetic profylakse administreres systematisk for å pediatriske UCBT mottakere for å forhindre komplikasjoner forbundet med VZV-infeksjon, men det ikke er noen sterke bevis basert konsensus som definerer den optimale varighet. Fordi T-celle mediert immunitet er ansvarlig for kontroll av VZV-infeksjon, vurdere rekonstituering av VZV spesifikke T-celle responser etter UCBT kunne gi indikasjon om hvorvidt profylakse bør opprettholdes, eller kan opphøre. For dette formål ble et VZV spesifikke gamma-interferon (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) analyse utviklet for å karakterisere IFN-γ produksjonen av T-lymfocytter som respons på in vitro stimulering med bestrålt levende svekkede VZV-vaksine. Denne analysen gir en rask, reproduserbar og følsom måling av VZV spesifikk cell mediert immunitet egnet for overvåking av tilberedning av VZV spesifikk immunitet i en klinisk setting og vurdere immunrespons til VZV antigener.
Introduction
Urfremført i 1989, er UCBT stadig mer brukt som en del av behandlingen av ulike neoplastiske og nonneoplastic blodsykdommer hos barn en. VZV er en cytopatisk menneskelig alphaherpesvirus som forårsaker to forskjellige sykdommer, varicella (etter primærinfeksjon) og herpes zoster (etter reaktivering). Etter primær infeksjon, vedvarer VZV gjennom hele livet av verten skjermet innenfor sensoriske nerver av ryggnerveknutene. En av de mest truende infeksiøse komplikasjoner etter UCBT er forbundet med VZV 2-4. I vår kliniske senter, i fravær av VZV profylakse, den kumulative forekomsten av VZV sykdom VZV sykdommen på tre år postUCBT var 46% to. I disse pasientene, er de novo infeksjon med eller reaktivering av VZV ofte forbundet med visceral formidling til sentralnervesystemet, lungene og leveren 5-7. Som et resultat, acyclovir, Valacyclovir eller famciclovir profylakse er ofte administrert til UBCT mottakere 8,9. Men denne behandlingsstrategi tar ikke hensyn til et beskyttende potensiale VZV spesifikke T-lymfocytter eller kinetikken av tilberedning av VZV spesifikke T celle responser. Potensielle problemer knyttet til den voksende bruken av langsiktige antiherpetic profylakse inkluderer a) pasient overbehandling; b) utvikling av antiviral medikamentresistens 10,11; og c) nedskrivning av VZV spesifikk immun tilberedning 12,13. For påvisning av funksjonelle VZV spesifikke T-lymfocytter korrelerer med tilstedeværelse av langvarig beskyttelse mot VZV-infeksjon og forbedret klinisk resultat 4,14,15, overvåking celle medierte immunresponser rettet mot VZV under fasen etter transplantasjonen kan resultere i en mer rasjonell bruk av antiviral behandling ved at leger å skille pasienter som vil ha nytte VZV profylakse fra dem som immunsystemet er i stand til å kontrollere VZV replikering 4,13.
Den IFN-γ ELISPOT-analysen er mye brukt for overvåkning celle-medierte immunresponser i en rekke eksperimentelle systemer og kliniske tilstander. Flekker er generert som følge av spaltning av et kromogent substrat, å generere et synlig og stabil bunnfall på stedet av reaksjonen. Hver enkelt spot representerer dermed fotavtrykk av en individuell cytokin-produserende celle. IFN-γ ELISPOT måler ikke bare evnen til individuelle celler ex vivo for å produsere IFN-γ som svar på in vitro stimulering med antigen beslektet, men den gir også et estimat av frekvensen for å reagere celler i en gitt cellepopulasjon 16,17. I tillegg til høy følsomhet, er IFN-γ ELISPOT enkel å utføre, noe som gjør dens bruk er mulig i sammenheng med tilpassede kliniske protokoller som tar sikte på å lede start eller stans i antiviral behandling. Fremgangsmåten beskrevet nedenfor describes en ELISPOT analysen som er spesielt utviklet for å oppdage og måle produksjonen av IFN-γ ved perifere mononukleære blodceller etter in vitro stimulering med VZV avledet antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen protokollen ble godkjent av Institutional Etikk Review Board of CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, der studien ble gjennomført. Informert samtykke ble søkt og fått fra alle deltagerne, deres foreldre eller verger. Alle prosedyrer utført på dagene 1 og 2 må utføres under sterile betingelser (dvs. under en laminær strømningshette). Standard sikkerhetsprosedyrer for håndtering av menneskeblod bør følges nøye.
En. Coating Plates
- Permeabilize polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner ved bunnen av 96-brønners Multiscreen IP white ELISPOT plater ved å tilsette til hver brønn 20 pl av 35% etanol i 1 min. Membraner bør bli litt gjennomsiktig.
- Umiddelbart vaske brønnene 3 ganger med 200 ul av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH PO 2 til 4, pH 7,4) ved hjelp av en multichannel pipette eller lignende enhet. Dette trinnet er kritisk ettersom etanol rester kan påvirke cellenes levedyktighet og binding av fangst-antistoff. ELISPOT plater er skjøre og bør håndteres forsiktig: bruk av en automatisert platevasker er ikke anbefalt.
- Belegge brønnene med 10 pl renset mus anti-humant IFN-γ fangst-antistoff fortynnet i 1 x PBS til en sluttkonsentrasjon på 10 pg / ml. Dekk platene med vanlig plastfolie og inkuber over natten ved 4 ° C.
2. Blokkering Plates
- Tømme brønnene, tappe dem tørre, og vaske tallerkener fem ganger med 200 mL 1x PBS.
- Fylle brønnene med 200 pl av komplett RPMI 1640-medium og inkuber platene i 2 timer ved 37 ° C (blokkerende trinn).
- Vask platene 5x med 200 mL 1x PBS og holde brønnene full av 1x PBS før cellene er klar til å bli belagt.
Tre. Cell Plating og stimulering
- Forbered peripheral mononukleære blodceller (PBMC) fra humane venøse blodprøver ved sentrifugering på Ficoll-Paque-gradienter ved anvendelse standard prosedyrer. Alternativt, ved anvendelse av standardmetoder, tine alikvoter av PBMC frosset i henhold flytende nitrogen. Etter siste sentrifugering, resuspender cellene ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10 til 6 celler / ml og inkuberes over natten ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære i en vannkappe inkubator.
- Fjern PBMC fra inkubatoren og resuspendere dem i et sluttvolum på 5 ml med komplett RPMI 1640-medium.
- Inkuber PBMC i nærvær av 10 ul av genetisk konstruert endonuklease fra Serratia marcescens i 5 min ved romtemperatur.
- Fjerne en 50 ul alikvot av PBMC og bland med 50 pl av trypan blått fargestoff. Telle celler og estimere% levedyktighet ved hjelp av en haemocytometer og mikroskopisk undersøkelse (fargestoffeksklusjonsmetoden). Forskjellige automatiserte metoder for celletelling, og vurdering av cellelevedyktighet kan alså anvendes. PBMC bør være> 95% levedyktig. Kast prøven når levedyktigheten er lavere enn 95%.
- Sentrifuger PBMC ved 700 xg i 5 min, forkast supernatant og resuspender cellene i AIM-V medium supplert med 2% (v / v) inaktivert humant serum (HIS) ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10 til 6 celler / ml. Lagres ved 37 ° C til stimulerings blandinger er lagt til plate.
- Legg til brønnene, en dråpe om gangen, og 100 pl av den aktuelle stimuleringsblandingen. Tre stimulerings blandinger bør brukes som beskrevet nedenfor:
- Bruk AIM-V medium supplert med 2% (v / v) inaktivert humant serum (IHS) som negativ kontroll.
- Bruke anti-CD3 monoklonalt antistoff (klon OKT3) fortynnet i AIM-V medium supplert med 2% (v / v) IHS til en sluttkonsentrasjon på 0,5 pg / ml som positiv kontroll).
- Bruk VZV-antigen, i form av enten γ-bestrålte (10.000 Gy, 30 min eksponeringstid) live attenuated VZV-vaksine (1350 plakkdannende enheter [PFU] / ml) fortynningted 1:200 i AIM-V medium supplert med 2% (v / v) IHS), eller 1 mg av en ekvimolar blanding av 67 peptider (15 aminosyrerester) syntetisert basert på sekvensen av den VZV umiddelbart tidlig (IE63) fosfoprotein . Styr bestråling effekt ved å overvåke fravær av synlige tegn på cytopatiske virkninger etter 4 dager i PBMC kulturer.
- Forbered alle brønnene i duplikat.
- Legg til brønnene, en dråpe om gangen, og 100 ul av celler fremstilt i trinn 5.4 til de passende brønner. To brønner bør stå uten celler (negativ kontroll). Inkuber i 20 timer ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære i en vannkappe inkubator. Ikke rist, flytte, eller stable platene oppå hverandre under inkubasjon.
4. Spot Utvikling og Detection
- Kast cellene og vask platene 10x med 1 x PBS supplert med 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hjelper løsner celler som har sluttet seg til den PVDF megmbrane følgende natten inkubasjon.
- Ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 100 pl av 0,5 mg / ml biotin-konjugert anti-IFN-γ monoklonalt antistoff (klon 4S.B3) fortynnet i 1 x PBS inneholdende 0,5% (w / v) bovint serumalbumin (BSA). Inkuber platene i 2 timer ved romtemperatur.
- Vask brønnene med 6x PBST og tilsett hver brønn 100 pl av streptavidin conjugatd med alkalisk fosfatase fortynnet 1:1.000 i 1 x PBS inneholdende 0,5% (w / v) BSA. Dekk platene og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
- Vask platene 3x med PBST og 3x med 1x PBS. Tilsett 100 pl av en 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) / nitroblått tetrazolium-klorid (NBT) substrat-løsning og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask platene under rennende destillert vann. Fjern den nederste delen av ELISPOT plate og vaske begge sider av membranen med destillert vann. Air tørke platene.
- Undersøk brønnene og oppsummere de flekker ved hjelp av en stereoskopisk dissection mikroskop eller skanne platene ved hjelp av en automatisert flekk mot. Hold platene bort fra lys hvis de ikke kan bli undersøkt på samme dag.
- Gjennomsnittlig antall flekker telles i tilsvarende duplikatbrønner og trekke fra antall plasser telles i de negative kontrollbrønner (ingen celler) fra antall plasser telles i testbrønnene.
- Uttrykke IFN-γ produksjon som antall stikkdannende enheter (SFU) per 10 6 PBMC.
- Betrakt at test-prøvene er positive dersom antallet SFU er> 50 10 6 PBMC og 2 standardavvik (SD) over den negative kontroll (celler + AIM-V medium supplert med 2% (v / v) IHS).
- Bruk en verdi av 400 SFU per brønn når plassene er for mange til å telles.
- Test om ELISPOT data er normalfordelt eller ikke bruker Kolmogorov-Smirnov test. Når data er normalfordelt, utføre statistiske sammenligninger ved hjelp av Student t test (to grupper) eller ANOVA og Bonferroni posttest (multiple sammenligninger). Hvis dataene ikke er normalfordelt, bruke Mann-Whitney U-test (to grupper) eller Kruskal-Wallis test og Dunns posttest (multiple sammenligninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den IFN-γ ELISPOT protokollen beskrevet ovenfor ble utviklet og optimalisert i vårt laboratorium for å måle størrelsen og kvaliteten av celle-medierte immunresponser rettet mot VZV 4.. Diverse kilder til VZV-antigen kan brukes for stimulering trinn. Disse omfatter: a) kommersielt tilgjengelig vaskemiddel inaktiverte ekstrakter fra VZV-infiserte Vero-celler 18; b) bassenger av overlappende syntetiske peptider fra bestemte VZV kodede proteiner, inkludert IE63 15 og ORF4 19; c) levende svekket varicella zoster vaksine 20; og d) UV-inaktiverte preparater av VZV-antigenene fra supernatanten av forstyrret VZV infiserte MRC-celler 14. I vårt tilfelle ble fortynninger av levende svekkede VZV-vaksine foretrukket over cellekultur avledet VZV for å sikre ensartethet i antigen kilde og preparatet, og for å begrense kultur og manipulering av levende villtype VZV-stammer i et klinisk miljø hvor nosocomial Transmisjonn er en alvorlig bekymring 10. I tillegg ble γ bestråling foretrukket over UV-inaktivering 21 på grunn av den sammenlignende presisjon med hvilken doser av γ stråling kan leveres, og fordi, i motsetning til UV, γ-stråler effektivt trenge inn i forseglede ampuller inneholdende VZV. Bestråling av virale stocks ført til stadig høyere estimater av hyppigheten av VZV spesifikke IFN-γ produserende celler i PBMC prøver tatt fra en frisk donor ved alle fortynninger av VZV-antigen testet (figur 1). Dette er muligens et resultat av innstrammingen av cytopathic effekter indusert av levende svekket VZV i cellekultur.
For å finne ut hvilken fortynning VZV antigen ga maksimal avlesninger i form av antall SFU pr 10 6 PBMC, ble IFN-γ ELISPOT utført ved hjelp av to-fold fortynninger av γ bestrålt live svekket VZV vaksine og PBMC prøver innhentet fra en gruppe av immunkompetente barn i alderen mellom 9 måneder og 12 years som hadde en historie med dokumentert varicella og / eller et positivt serologi for VZV (n = 50). . Forsøkspersonene ble innrullert ved Infeksjonsmedisinsk klinikk og Spesial Immunologi Clinic av CHU Sainte-Justine mellom juni 2007 og september 2009 Statistisk signifikante forskjeller ble observert mellom median frekvenser av IFN-γ produserende celler som ble innhentet ved hjelp av 1:200, 1: 400 og 1:800 fortynninger av VZV-antigen (p <0,0001, Kruskal-Wallis test) (figur 2). Disse ulikhetene ble regnskapsføres etter forskjellen mellom 1:200 fortynning (median = 115,0 SFU per 10 6 PBMC; interkvartile området [IQR] = 75,0 til 232,5 SFU per 10 6 PBMC) og 1:800 fortynning (median = 50,0 SFU per 10 6 PBMC, IQR = 20,0 til 105,0 SFU per 10 6 PBMC), og mellom 1:400 fortynning (median = 92,5 SFU per 10 6 PBMC, IQR = 52,5 til 177,5 SFU per 10 6 PBMC) og 1:800 fortynning (p <0,001 og p (figur 2). Av denne grunn er bestrålt på 1:200 fortynning av γ levende-svekkede VZV-vaksine ble valgt for bruk i rutinemessige målinger av VZV spesifikk celle-medierte immunresponser.
For å avgjøre om IFN-γ produksjon ligger i CD4 + og / eller CD8 + T lymfocytt undergrupper, ble PBMC prøver hentet fra en frisk donor utsatt for nedbryting av CD4 + eller CD8 + celler ved hjelp av anti-CD4 eller anti-CD8 antistoff kombinert magnetiske kuler i henhold til produsentens anvisninger. I samsvar med tidligere publiserte rapporter 22,23, utarming av CD4 +-celler resulterte i en slående reduksjon av frekvensene av IFN-γ produserende celler som ble oppnådd ved hjelp av de 1:100, 1:200 og 1:400 fortynninger av VZV-antigen, samtidig uttømming av CD8 +-celler ikke førte til en slik reduksjon, og positive kontrolls (stimulering med anti-CD3 monoklonalt antistoff) ble ikke påvirket på samme måte (fig. 3). Disse resultatene tyder på at de fleste av cellene som produserer IFN-γ i respons til stimulering med VZV-antigener er CD4 + T-celler. Alternativt kan disse resultatene stammer fra nedbryting av CD4 + antigenpresenterende celler (dvs. monocytter, dendrittiske celler) fra PBMC pool, som fører til reduserte nivåer av presentasjonen av VZV antigener å responder CD8 + T-lymfocytter. Bruken av bestrålt VZV er usannsynlig å ha bidratt til den forvrenger av responsen mot CD4 dominans, ble så lignende resultater oppnås ved andre grupper som bruker ulike teknikker og antigen kilder 14,21,22. En lav forstørrelse mikrografi av representative ELISPOT brønner er presentert i figur 4..
| Problem / hefte | Mulige årsaker | Utbedring / løsning </ Td> |
| Høy bakgrunn / dårlig definerte eller konfluente flekker | Høyt antall døde celler. | Vurdere celleviabilitet før kultur set-up og stimulering. |
| Utilstrekkelig membran Forhåndsvæting trinn. | Sørg for å respektere Forhåndsvæting tid og at membranen bli grått etter 1 min. 35% etanol bør fremstilles umiddelbart før bruk. | |
| Platene beveges i løpet av inkubasjonsperioden. | Ikke flytt plater for å unngå dårlig definerte sneglen trail flekker. | |
| Vask trinn. | Manuell vask er mer effektiv enn tallerkenskiver. | |
| Dannelse av protein aggregater. | Filtrere både fangst-og deteksjons antistoffer for å redusere bakgrunns og falske positive flekker. | |
| Sekundær og deteksjon antistoff konsentrasjon. | Juster biotinylated secondary / deteksjon-antistoff-konsentrasjon for å redusere bakgrunnen. | |
| Kalde utviklingsreagenser. | Bringe substratet til romtemperatur for å unngå underutvikling. | |
| Ingen flekker / Blank brønner | Dårlig definert flekker. | Ikke stable platene under inkubasjonsperioden for å ha en homogen temperatur i de forskjellige brønner. |
| Stimulering underlaget ikke godt forberedt. | Bring peptidblandingen aliquot til romtemperatur i 15 min for å unngå krystalldannelse. | |
| Celle klumper. | Suspender cellene i encellede suspensjon for å unngå undervurdering av spot-forming units. | |
| Cellene ikke stimulert på riktig måte. | Bruk en polyklonal aktivator som en positiv kontroll. | |
| Inhibering av enzymreaksjon ved mellom-20. | Varh plater med PBS før du legger BCIP / NBT substrat løsning. | |
| Feil antistoff parene. | Sørg for at fangst og deteksjons antistoffene reagerer med ulike antigene epitoper. |
Tabell 1. Ytterligere feilsøking.
Figur 1. Effekt av γ-bestråling av levende inaktivert VZV-vaksine på frekvensen av IFN-γ produserende celler som bestemt ved å bruke IFN-γ ELISPOT. VZV spesifikke IFN-γ ELISPOT ble utført som beskrevet i protokollen tekst ved hjelp av PBMC fra en kontroll-og frivillig serielle fortynninger av γ bestrålt (10 000 Gy) levende svekket VZV vaksine som antigen. Dataene representerer gjennomsnittet av duplikat measuremeNTS og feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet. PBMC: perifere mononukleære blodceller; SFU: spot dannende enheter; VZV: varicella zoster virus.
Figur 2. Kvantifisering av VZV bestemt celle mediert immunrespons hos barn med dokumentert bevis på tidligere infeksjon med VZV. VZV spesifikk IFN-γ ELISPOT ble utført som beskrevet under protokoll Tekst hjelp PBMC isolert fra pasienter med en historie med varicella (n = 50) og serielle fortynninger av γ bestrålt (10 000 Gy) levende svekket VZV vaksine som antigen. Horisontale linjene representerer medianen, bokser representerer interkvartile området (IQR), og værhår representerer verdiområdet. PBMC: perifere mononukleære blodceller; SFU: spot dannende enheter; VZV: varicella zoster virus .
Fig. 3. Effekt av utarming av CD4 + eller CD8 +-celler på frekvensen av IFN-γ produserende celler som målt ved hjelp av IFN-γ ELISPOT. Nedbryting av CD4 + eller CD8 +-celler, og VZV spesifikke IFN-γ ELISPOT ble utført som beskrevet i avsnittet Protokoll tekst ved hjelp av PBMC fra en kontroll frivillig og serielle fortynninger av γ bestrålt (10 000 Gy) levende svekket VZV vaksine som antigen. Dataene representerer gjennomsnittet av duplikate målinger og feil søylene representerer standardfeil av gjennomsnittet. PBMC: perifere mononukleære blodceller; SFU: spot dannende enheter; VZV: varicella zoster virus.
load/51643/51643fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Fig. 4. Representative ELISPOT brønner. VZV spesifikke IFN-γ ELISPOT ble utført som beskrevet i protokollen tekst ved hjelp av PBMC fra fem kontroll frivillige og serielle fortynninger av γ bestrålte (10.000 Gy) live attenuated VZV-vaksine som antigen. Første rekke: negative kontroller (AIM-V medium supplert med 2% (v / v) IHS); andre rad: positiv kontroll (anti-CD3 monoklonalt antistoff); tredje rad: VZV antigen. Tallene i de øvre hjørner representerer SFU per brønn som målt ved hjelp av en automatisert flekk mot. PBMC: perifere mononukleære blodceller; SFU: spot dannende enheter; VZV: varicella zoster virus; IHS: inaktivert human serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifikasjoner og feilsøking: IFN-γ ELISPOT-analyser er blitt brukt til å undersøke celle-mediert immunrespons rettet mot en rekke mikrobielle patogener, inkludert humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitt C virus (HCV) 26, 27, og Mycobacterium tuberculosis 28,29, bare for å nevne noen. Her har vi beskrevet utviklingen av en IFN-γ ELISPOT analyse for å måle cellulær immunitet mot, med håp om å definere korrelerer av VZV spesifikk immun rekonstituering i å utvinne pediatriske UCBT mottakere.
Viktige egenskaper ved denne analysen er firedoblet. For det første krever det ikke før in vitro ekspansjon av T-celler, noe som er tidkrevende. For det andre kan den utføres ved hjelp cryopreserved PBMC prøver, noe som er viktig å minimalisere interassay variabilitet. I tillegg er nedfrysing og parallell prosessering godt tilpasset langsnale studier, som krever at prøvene behandles i grupper. For det tredje, for å forebygge celle klumper oppdaget under tining av PBMC, behandling med en ultra genetisk konstruert endonuklease fra Serratia marcescens ble brukt. Cell klumper ved tining PBMC forekommer oftere ved bruk av blodprøver som er igjen over natten i romtemperatur før behandling. Inkorporering av genetisk konstruert endonuklease fra Serratia marcescens er kjent for ikke å påvirke cellenes levedyktighet, ekspresjonen av celleoverflatemarkører og respons til stimulering med beslektet antigen i form av SFU siden lave nivåer av nuklease anvendes og varigheten av eksponeringen er kort 22.. For det fjerde, γ bestrålt levende, svekket VZV-vaksine ble anvendt til å stimulere PBMC. Det ble foretrukket over cellekultur avledet VZV for å sikre ensartethet i antigen dose og fremstilling og for å overvinne behovet for å manipulere levende VZV i et klinisk miljø hvor sikkerheten til pasienter, oglaboratoriepersonell er et stort problem. Til sammen ble de modifikasjoner som ble innført i den VZV-ELISPOT analyse beregnet for å gjøre det bedre tilpasset for bruk i et klinisk miljø.
Begrensninger av teknikken betydning med hensyn til eksisterende metoder: Oversiktlig, sensitive og reproduserbare metoder er nødvendig for å måle vertscelle medierte immunresponser rettet mot mikrobielle antigener i sammenheng med klinisk oppfølging. IFN-γ ELISPOT er en robust, reproduserbar og informativ analyse som kan utføres på venøse blodprøver ved hjelp av relativt lav tech utstyr (sentrifuger, inkubatorer, disseksjon mikroskop). Men det betyr ikke på grunnlag av den samtidig påvisning av flere cytokiner og celleoverflatemarkører. Tradisjonelle in vitro T celleproliferasjon assays, som har klassisk blitt brukt til telling av CD4 + og CD8 + antigen spesifisitetc T-celle-responser, er arbeidskrevende, de mangler sensitivitet og har en tendens til å lide av en høy grad av variabilitet interassay 30,31. På den annen side, cytotoksiske T-lymfocytt-assays (CTL) basert på lysis av autologe mål lastet med 51 Cr og begrensende fortynning analyse har en tendens til å være avhengig av tidskrevende in vitro ekspansjon fremgangsmåte for å kvantifisere antigen-spesifikke CD8 + T-celler som er til stede ved en lav forløper frekvenser 32,33. Strømningscytometri baserte assays som måler cytokin sekresjon etter antigen stimulering (intracellulær cytokin farging [ICS]) 34,35 kan også brukes til å karakterisere antigen-spesifikke immunresponser. ICS tillater samtidig påvisning av cytokin produksjon, og celleoverflate-ekspresjon av fenotypiske markører i enkeltceller. Sensitiviteten av ICS sammenlignet med ELISPOT, men den krever et større antall celler 36,37. Metoder som gjør bruk av fluoriserende klasse I eller klasse II peptid-maJor histocompatibility kompleks (pMHC) oligomerene (pMHC tetramers) 38-40 er presise og aktiver multiparametric karakterisering av lymfocytt undergrupper basert på uttrykk av celleoverflatemarkører. Men pMHC tetramer flekker krever forkunnskaper i pasientenes human leukocytt antigen (HLA) type, som kan være tungvint og begrense pasienten påmelding til en gitt studie. En annen begrensning med denne teknikken er at pMHC tetramer farging tillater hovedsakelig påvisning av T-celler som uttrykker middels til høy affinitet T-celle-reseptorer (TCR) 41. På den annen side kan CD8 + T-celler uttrykker lave affinitet TCR som ikke er farget av pMHC tetramerer lett kan påvises ved hjelp av IFN-γ ELISPOT 41.. I tillegg kan pMHC tetramerer binde seg til såkalte utbrukte CD8 + T-lymfocytter som er utbredt i kroniske virusinfeksjoner 42,43, og derved forskyver den funksjonelle vurderingen av antigen-spesifikk celle-medierte immunresponser. Finally, pMHC tetramer flekker og ICS vanligvis krever høyt utdannet personell, forholdsvis dyre reagenser, avanserte instrumenter, og dedikerte fasiliteter, noe som gjør disse teknikkene notorisk vanskelig å gjennomføre i en klinisk oppfølging setting.
Fremtidige søknader: Tofargede ELISPOT-analysene i stand til samtidig å påvise produksjon av både IFN-γ og IL-2 44 og dual-og trippel-farge fluorospot metoder 45 har generert betydelig interesse, som de tillater vurdering av polyfunksjonalitet av antigen spesifikke T lymfocytter, som er en viktig funksjon i effektiv celle medierte immunresponser 46.
Må gis ytterligere tekniske problemer nøye vurderes: Kritiske trinnene i protokollen. Fordi mange variabler kan påvirke flekk kvalitet (dvs. størrelse og tetthet) og nummeneh, er tilslutning til protokollen viktig for å oppnå sensitive og reproduserbare resultater. Konsekvent bruk av bestemte merker av monoklonale antistoffer (fangst og gjenkjenning), ELISPOT plater med PVDF membraner, og 35% etanol for membran behandling før belegget er av høy viktighet. For eksempel kan overbehandling med etanol påvirke ytelsen til analysen og punktkvalitet. For å hindre innhenting uninformative brønner (dvs.> 300 flekker), anbefaler vi at du bruker ikke mer enn 2 x 10 5 PBMC per brønn. Når man står overfor lave frekvenser av antigen-spesifikke T-celler, kan analysefølsomheten forbedres ved prestimulating celler in vitro med beslektet antigen eller utvide dem med polyklonale aktivatorer slik som fytohemagglutinin (PHA) i et definert tidsrom (vanligvis 3-7 dager) 38 . Men den endelige optimalisert prosedyre for VZV ELISPOT analysen som presenteres her inkluderer ikke in vitro forstimulering og / eller ekspansjonstrinn. Antall og quality av stedene var lik over en inkubasjonstid spekter av 16-21 timer. Utover 21 hr av inkubasjon, flekker var ofte mer diffuse, og noen ganger overlappende, noe som gjør deres oppregning vanskeligere. Videre kan bevege platene mens cellene er inkubere føre til dårlig definerte sneglen sti flekker som er likeledes vanskeligere å telle. Ytterligere feilsøking signaler er gitt i tabell 1.
Ved bruk av en automatisert flekk mot, følsomhet og punktstørrelsen gating er innstilt ved hjelp av positiv kontroll (anti-CD3 monoklonalt antistoff) og den negative kontroll (AIM-V medium supplert med 2% (v / v) IHS). De viktigste egenskapene for å vurdere under flekk opplisting er størrelse og form (figur 4). Den tidligere gjør det mulig å skille T celle avledet cytokin flekker fra bakgrunns flekker som bør ignoreres. Spot nummer gir et estimat av frekvensen av VZV spesifikke T-celler til stede i et gitt PBMC prøven, mens punktstørrelse reflekterer hvor mye IFN-γ produseres av hver individuelle celler.
Så vidt vi vet, er dette den eneste IFN-γ ELISPOT metode som gjør bruk av γ bestrålt levende, svekket VZV vaksine som antigen 4. Paneler av overlappende syntetiske peptider (15-gjenerobret) har også vært brukt som antigen, inkludert blanding av peptider basert på aminosyre-sekvensen av den VZV IE63 fosfoprotein. IE63 er svært immunogent 47 og ser ut til å være avgjørende for viral smittsomhet og etablering av ventetid 48. IE63 spesifikke T-celler har blitt oppdaget hos friske VZV seropositive givere 15, noe som antyder at IE63 er et viktig mål for cellemediert immunitet rettet mot VZV. Imidlertid ble reaktive celler funnet å være i stor grad CD4 + T celler 15.
Den VZV IFN-γ ELISPOT analysen ble tidligere brukt av our gruppe for å vurdere de VZV spesifikke T celle responser i 28 barn som gjennomgikk UCBT å behandle neoplastiske eller arvet blodsykdommer fire. Resultatene som ble oppnådd i løpet av denne undersøkelse antydet at både CD4 + og CD8 + T-celle-undergrupper ble innblandet i IFN-γ produksjon og at rekonstituering av naive CD8 + T-cellerommet førte til en mer robust VZV spesifikk celle-medierte immunrespons hos form av IFN-γ produksjon. Viktigere, disse resultatene viste også at påvisning av mer enn 150 SFU per 10 6 PBMC var konsistent med T-celle-mediert beskyttelse mot VZV-infeksjon og-reaktive 4.. Men denne terskelverdi for VZV bestemt celle mediert immunitet i forbindelse med UCBT og påfølgende immun rekonstituering eller mangel derav vil måtte bli validert i større potensielle multisenter studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke deltagerne og deres foreldre. Vi vil også gjerne takke Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) for tilgang til hans ELISPOT leser, Dr. Lubo Alexandrov for statistisk analyse, og Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois og Martine Caty for ekspert teknisk assistanse. Støttet med tilskudd fra le Fonds d'opération pour les PROJETS de recherche Clinique et d 'evalution des teknologier (CHU Sainte-Justine) til HS og PO, etter la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, og ved leukemi og lymfom Society of Canada. ISF ble støttet av stipend fra la Fondation CHU Sainte-Justine og le Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG var mottaker av stipend fra Institutt for mikrobiologi, Infeksjologi & Immunology, Université de Montréal (Gabriel-Marquis stipend), FRQS, og den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR). NM ble støttet av la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Foundation, og FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
