Summary
Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).
Abstract
A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.
Introduction
Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças 1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV 2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT 2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado 5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT 8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral 10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica 12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica 4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV 4,13.
O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular 16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.
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Protocol
Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estritamente observados.
1. O revestimento das placas
- Permeabilizar o difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membranas na parte inferior de 96 poços placas ELISpot branco MultiScreen IP, adicionando a cada poço 20 ul de etanol a 35% durante 1 min. Membranas deve tornar-se um pouco translúcido.
- Imediatamente lavar os poços 3 vezes com 200 ul de 1x tampão fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma multichannel pipeta ou dispositivo semelhante. Esta etapa é fundamental, uma vez que os resíduos de álcool pode afetar a viabilidade celular e ligação do anticorpo de captura. Placas ELISpot são frágeis e devem ser manuseados com cuidado: não é recomendado o uso de uma placa de lavadora automática.
- O revestimento das cavidades com 10 pi de rato purificada anticorpo anti-humano de captura de IFN-γ diluída em 1x PBS para uma concentração final de 10 ug / ml. Cubra as placas com filme plástico regular e incubar durante a noite a 4 ° C.
2. Bloqueio placas
- Esvaziar os poços, batendo-os secar e lavar placas 5 vezes com 200 mL de PBS 1x.
- Encha as cavidades com 200 ul de meio completo RPMI 1640 e incubar as placas durante 2 horas a 37 ° C (passo de bloqueio).
- Lavar as placas 5 vezes com 200 ul de PBS 1x e manter os poços cheios de PBS 1x até que as células estão prontas a ser revestida.
3. Celular chapeamento e Estimulação
- Prepare pAs células mononucleares do sangue eripheral (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso humano por centrifugação em gradientes de Ficoll-Paque, utilizando procedimentos padrão. Alternativamente, usando métodos padrão, descongelar alíquotas de PBMC congelados em azoto líquido. Após centrifugação os últimos, ressuspender as células em uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml e incubar durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água.
- Retirar CMSP da incubadora e ressuspender-los em um volume final de 5 ml de meio completo de RPMI 1640.
- Incubar de PBMC na presença de 10 ul de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens, durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Retirar uma aliquota de 50 ul de PBMC e misturar-se com 50 ul de corante azul de tripano. Contar as células e avaliar a viabilidade% utilizando um hemocitómetro e exame microscópico (método de exclusão de corante). Vários métodos automatizados para contagem de células e avaliação da viabilidade celular pode alentão ser utilizado. PBMC deve ser> 95% viáveis. Descartar amostra quando a viabilidade for inferior a 95%.
- Centrífuga PBMC a 700 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (HIS) a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Manter a 37 ° C até que as misturas de estimulação são adicionados à placa.
- Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, 100 uL da mistura de estimulação adequado. Três misturas de estimulação devem ser utilizados como descrito abaixo:
- Utilização meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (IHS) como controlo negativo.
- Use anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), diluída em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS para uma concentração final de 0,5 ug / ml como controlo positivo).
- Use antigénio VZV, sob a forma de um ou outro irradiadas-γ (10.000 Gy, 30 min de tempo de exposição) vivo atenuado da vacina de VZV (unidades formadoras de placa 1350 UFP [] / ml) diluiçãoted a 1:200 em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS) ou 1 ug de uma mistura equimolar de 67 péptidos (15 resíduos de aminoácidos) sintetizados com base na sequência do VZV imediatamente precoce (IE63) fosfoproteína . Controlar a eficácia da irradiação por monitorização da ausência de sinais visíveis de efeitos citopáticos após 4 dias em culturas de CMSP.
- Prepare todos os poços em duplicado.
- Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, a 100 ul de células preparado no passo 5.4 aos poços apropriados. Dois poços devem ser deixados sem células (controle negativo). Incubar durante 20 horas a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. Não agite, mover ou empilhar as placas em cima uns dos outros durante a incubação.
4. Ponto de Desenvolvimento e Detecção
- Descartar as células e lava-se as placas 10 vezes com 1x de PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ajuda a separar as células que aderiram ao PVDF membrane após incubação durante a noite.
- Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de 0,5 mg / ml biotina conjugado anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (clone 4S.B3) diluído em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA). Incubar as placas durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Lavar os poços 6x com PBST e adiciona cada poço 100 ul de estreptavidina conjugatd com fosfatase alcalina diluído 1:1000 em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de BSA. Cobrir as placas e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Lavar as placas 3x com PBST e 3x com PBS 1x. Adicionar 100 ul de um fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) nitro solução de substrato / azul de cloreto de tetrazólio (NBT) e incuba-se 5 minutos à temperatura ambiente.
- Lavar as placas com água corrente destilada. Retirar a parte inferior da placa de ELISpot e lavar ambos os lados da membrana, com água destilada. Air secar os pratos.
- Examinar os poços e enumerar os pontos usando um d estereoscópicomicroscópio issection ou digitalizar as placas utilizando um contador local automatizado. Mantenha as placas ao abrigo da luz, se não podem ser examinados no mesmo dia.
- Calcule a média dos números de pontos contados em poços em duplicado correspondentes e subtrai o número de manchas contadas nos poços de controlo negativo (ausência de células) a partir do número de pontos contados em poços de teste.
- Expressar a produção de IFN-γ como o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 10 6 PBMC.
- Considere-se que as amostras de teste é positivo se o número de SFU é> 50 por 10 6 PBMC e dois desvios padrão (DP) acima do controlo negativo (meio de células + AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS).
- Use um valor de 400 SFU por bem quando os pontos são numerosas demais para serem contados.
- Teste se os dados ELISpot são normalmente distribuídos ou não pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando os dados são normalmente distribuídos, realizar comparações estatísticas utilizando tes t de Studentt (2 grupos) ou ANOVA e pós-teste de Bonferroni (comparações múltiplas). Se os dados não são normalmente distribuídos, use o teste de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (comparações múltiplas).
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Representative Results
O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV 4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero 18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específicos, incluindo IE63 15 e ORF4 19; c) vivo atenuado da vacina contra a varicela zoster 20; e d) as preparações inativadas UV do VZV antígenos a partir do sobrenadante de células infectadas interrompido VZV MRC 14. No nosso caso, as diluições da vacina viva atenuada VZV foram preferência sobre cultura de células derivadas VZV, a fim de garantir a uniformidade na fonte antígeno e preparação e limitar cultura e manipulação de cepas vivas VZV tipo selvagem em um ambiente clínico onde transmissio nosocomialn é uma preocupação séria 10. Além disso, a irradiação γ foi preferido ao longo de inactivação de UV 21, devido à precisão comparativa com que as doses de radiação γ pode ser entregue e porque, ao contrário dos raios UV, raios γ penetrar eficientemente frascos selados contendo VZV. A irradiação de reservas virais conduziu a estimativas mais elevados de a frequência de células de VZV IFN-γ produtoras específicas em amostras de PBMC obtidas a partir de um dador saudável para todas as diluições de antigénio VZV testados (Figura 1). Este é, possivelmente, o resultado da mitigação dos efeitos citopáticos induzidos pelo vivo atenuado VZV em cultura de células.
Para determinar qual o antigénio VZV diluição produziu leituras máximas em termos de números de SFU por 10 6 PBMC, IFN-γ ELISpot foi realizada utilizando diluições de duas vezes de γ irradiados vacina viva atenuada de VZV e amostras de PBMC obtidas a partir de um grupo de crianças com idades compreendidas entre imunocompetentes entre 9 meses e 12 years que tinham um histórico documentado de varicela e / ou sorologia positiva para VZV (n = 50). . Os sujeitos do estudo foram inscritos em Doenças Infecciosas Clínica e Imunologia Clínica Especial de CHU Sainte-Justine, entre junho de 2007 e setembro de 2009, foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as freqüências médias de células produtoras de IFN-γ que foram obtidos usando o 1:200, 1: 1:800 400 e diluições de antigénio VZV (p <0,0001, teste de Kruskal-Wallis) (Figura 2). Estas disparidades foram contabilizadas pela diferença entre a diluição 1:200 (mediana = 115,0 SFU por 10 6 PBMC; intervalo interquartil [IQR] = 75,0-232,5 SFU por 10 6 PBMC) ea diluição 1:800 (mediana = 50,0 SFU por 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU por 10 6 PBMC), e entre a diluição 1:400 (mediana = 92,5 SFU por 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU por 10 6 PBMC) ea 1:800 diluição (p <0,001 e p (Figura 2). Por esta razão, a diluição de 1:200 γ irradiados vacina de VZV vivo atenuado foi seleccionado para o uso em medições de rotina de respostas imunes mediadas por células específica de VZV.
Para determinar se a produção de IFN-γ reside em células T CD4 + e / ou CD8 +, subconjuntos de linfócitos, amostras de PBMC obtidas a partir de um dador saudável foram sujeitos a depleção das células T CD8 + ou CD4 + utilizando anticorpos anti-CD4 ou anti-CD8 acoplado esferas magnéticas de acordo com as instruções do fabricante. Em concordância com relatórios publicados anteriormente 22,23, a depleção de células CD4 + resultou em uma redução marcante nas freqüências de células produtoras de IFN-γ, que eram obtidos utilizando 1:100, 1:200 e 1:400 diluições de antígeno VZV, enquanto que a depleção das células T CD8 + não conduzir a uma tal redução e controlo positivos (estimulação com anti-CD3, anticorpo monoclonal) não foram afectados de modo semelhante (Figura 3). Estes resultados sugerem que a maioria das células que produzem o IFN-γ em resposta à estimulação com antigénios de VZV são células T CD4 +. Alternativamente, esses resultados poderiam resultar de esgotamento das células apresentadoras de antígenos CD4 + (ou seja, monócitos, células dendríticas) da piscina PBMC, levando à redução dos níveis de apresentação de antígenos para VZV respondedor linfócitos T CD8 +. O uso do combustível irradiado do VZV é improvável que tenha contribuído para a inclinação da resposta para um domínio CD4, os resultados tão semelhantes foram obtidos por outros grupos que utilizam diferentes técnicas e fontes de antígenos 14,21,22. Um baixo micrografia ampliação de poços ELISpot representativas é apresentado na Figura 4.
| Problema / questão | Possíveis causas | Solução / solução </ Td> |
| Alta fundo / manchas mal-definidos ou confluentes | Números elevados de células mortas. | Avaliar a viabilidade celular antes de cultura set-up e estimulação. |
| Membrana inadequada etapas pré-umedecimento. | Certifique-se de respeitar o tempo de pré-molhagem e que por sua vez, membrana para cinza depois de 1 min. Etanol de 35% deve ser preparada imediatamente antes da utilização. | |
| Placas movido durante o período de incubação. | Não mova placas para evitar pontos de trilha caracol mal definidas. | |
| Lavar as etapas. | Lavagem manual é mais eficiente do que as anilhas de placa. | |
| A formação de agregados de proteína. | Filtrar ambas anticorpos de captura e de detecção para reduzir o fundo e falsos positivos manchas. | |
| Concentração de anticorpo secundário e a detecção. | Ajuste biotinilado seconcentração de anticorpos cundária / detecção para reduzir fundo. | |
| Reagentes em desenvolvimento frias. | Traga substrato à temperatura ambiente para evitar subdesenvolvimento. | |
| Sem manchas / poços em branco | Manchas mal definida. | Não coloque as placas durante o período de incubação para ter uma temperatura homogênea nos diferentes poços. |
| Substrato Estimulação não bem preparado. | Levar a mistura de péptidos de aliquota à temperatura ambiente durante 15 minutos para evitar a formação de cristais. | |
| Aglutinação celular. | Ressuspender as células em suspensão de uma única célula para evitar a subestimação de unidades formadoras de manchas. | |
| As células não estimuladas de forma adequada. | Usar um activador policlonal como um controlo positivo. | |
| A inibição da reacção da enzima por tween-20. | Foih placas com PBS antes de adicionar solução de substrato BCIP / NBT. | |
| Pares de anticorpos errada. | Certifique-se de que os anticorpos de captura e de detecção de reagir com diferentes epítopos antigênicos. |
Tabela 1. Solução de problemas adicionais.
Figura 1. Efeito de γ-irradiação da vacina VZV inactivada vivo sobre a frequência de células produtoras de IFN-γ como determinado usando IFN-γ ELISpot. VZV específica foi realizada ELISpot de IFN-γ como descrito no protocolo de texto utilizando PBMC de um voluntário e controle diluições em série de γ irradiados (10.000 Gy) viver vacina VZV atenuado como antígeno. Os dados representam a média de duplicados MeasureMents e as barras de erro representam o erro padrão da média. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: vírus varicela zoster.
Figura 2. Quantificação de VZV célula específica mediada por respostas imunitárias em crianças com comprovação de infecção anterior com VZV. VZV específica foi realizada ELISpot de IFN-γ como descrito no protocolo de texto utilizando PBMC isolado a partir de indivíduos com uma história de varicela (n = 50) e diluições em série de γ irradiados (10.000 Gy) viver vacina VZV atenuado como antígeno. As linhas horizontais representam a mediana, as caixas representam intervalo interquartil (IQR), e bigodes representam o intervalo de valores. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: varicela zoster .
Figura 3. Efeito da depleção das células CD8 + CD4 +, ou na frequência de células produtoras de IFN-γ como medidos utilizando IFN-γ ELISpot. Depleção de células T CD4 + ou CD8 + e VZV γ IFN específico ELISpot foram realizados como descrito em Protocolo Texto usando PBMC de um voluntário de controle e diluições em série de γ irradiados (10.000 Gy) viver vacina VZV atenuado como antígeno. Os dados representam a média de medições em duplicado e as barras de erro representam o erro padrão da média. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: vírus varicela zoster.
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Figura 4. Poços representativas ELISpot. VZV específicos ELISpot foi realizada como descrito no protocolo de texto utilizando PBMC de cinco voluntários de controlo e as diluições em série de γ irradiados (10.000 Gy) a vacina viva atenuada de VZV como antigénio-γ IFN. Primeira linha: controlos negativos (meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS); segunda linha: controles positivos (anti-CD3 anticorpo monoclonal); terceira fileira: antígeno VZV. Números nos cantos superiores representam SFU por poço, medida utilizando um contador local automatizado. PBMC: células mononucleares do sangue periférico; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: varicela zoster; IHS: inativado soro humano.
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Discussion
Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) 24,25, vírus da hepatite C (HCV), 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contra, com a esperança de definir correlatos de VZV reconstituição imune específica na recuperação destinatários UCBT pediátricos.
As principais características deste ensaio são quatro vezes. Em primeiro lugar, que não requer a expansão in vitro, antes de as células T, o que é demorado. Em segundo lugar, pode ser realizada utilizando amostras criopreservadas PBMC, o que é melhor para minimizar a variabilidade inter-ensaios. Além disso, a criopreservação e processamento paralelo estão bem adaptadas para longitudiEstudos Nal, as quais requerem que as amostras sejam processadas em lotes. Em terceiro lugar, para evitar a aglomeração de células encontradas durante o descongelamento de CMSP, o tratamento com uma endonuclease de ultrapura geneticamente modificado a partir de Serratia marcescens foi usado. Aglutinação celular após descongelar PBMC ocorre com mais freqüência quando se utiliza amostras de sangue que são deixados durante a noite à temperatura ambiente antes do processamento. A incorporação de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens não é conhecida a afectar a viabilidade celular, expressão de marcadores de superfície celular e a resposta à estimulação com antigénio relacionado, em termos de SFU desde níveis baixos de nucleases são utilizadas e a duração da exposição for curto 22. Em quarto lugar, γ irradiados vacina de VZV vivo atenuado foi usado para estimular PBMC. Preferiu foi sobre cultura de células derivadas VZV, a fim de garantir a uniformidade na dose de antígeno e preparação e superar a necessidade de manipular ao vivo VZV em um ambiente clínico, onde a segurança dos pacientes epessoal de laboratório é uma grande preocupação. Tomadas em conjunto, as modificações que foram introduzidas no ensaio VZV ELISpot tinham a intenção de torná-la melhor adaptada para uso em um ambiente clínico.
Limitações da importância técnica no que diz respeito aos métodos existentes: métodos simples, sensíveis e reprodutíveis são necessários a fim de medir as respostas de células hospedeiras imunes mediadas dirigidos contra antigénios microbianos no contexto de acompanhamento clínico. IFN-γ ELISpot é um ensaio robusto, reprodutível e informativo que pode ser realizado em amostras de sangue venoso, utilizando um equipamento relativamente baixa tecnologia (centrífugas, incubadoras, dissecção microscópio). No entanto, não prontamente permitir a detecção simultânea de múltiplas citoquinas e os marcadores da superfície da célula. In vitro Os ensaios de proliferação de células T tradicionais, que têm sido classicamente utilizados para a enumeração das células T CD4 + e CD8 + antigénio especiAs respostas das células T c, são de trabalho intensivo, pouco sensíveis e tendem a sofrer de um elevado grau de variabilidade inter-ensaios 30,31. Por outro lado, os ensaios de linfócitos T citotóxicos (CTL), com base na lise de alvos autólogos carregados com 51 Cr e análise de diluição limitante tendem a depender demorado in vitro passos de expansão para quantificar as células de antigénios específicos de T CD8 +, que estão presentes numa baixo precursor freqüências 32,33. Ensaios baseados em citometria de fluxo para medir a secreção de citocinas após estimulação antigénica (citocina coloração intracelular [ICS]) 34,35 pode também ser utilizado para caracterizar as respostas imunitárias antigénio-específicas. ICS permite a detecção simultânea de produção de citocinas e a expressão da superfície celular de marcadores fenotípicos em células individuais. A sensibilidade do ICS compara com a de ELISpot, mas exige um maior número de células 36,37. Os métodos que fazem uso de classe fluorescente I ou classe II peptide-macomplexo de histocompatibilidade (jor pMHC) oligômeros (tetrâmeros pMHC) 38-40 são precisos e permitem a caracterização multiparamétrico de subconjuntos de linfócitos com base na expressão de marcadores de superfície celular. No entanto, a coloração tetrâmero pMHC requer conhecimento prévio de antigénio humano dos doentes de leucócitos (HLA) tipo, o que pode ser complicado e limita a inscrição do paciente para um dado estudo. Outra limitação desta técnica é que a coloração tetrâmero pMHC permite essencialmente a detecção de células T que expressam meio de receptores de células T de elevada afinidade (TCR) 41. Por outro lado, as células T CD8 + que expressam TCR de baixa afinidade que não são coradas pelo tetrâmeros pMHC pode ser facilmente detectada usando IFN-γ ELISpot 41. Além disso, tetrâmeros pMHC pode ligar-se aos chamados linfócitos T CD8 + exaustas que são predominantes nas infecções virais crónicas 42,43, distorcendo assim a avaliação funcional de respostas imunes mediadas por células específicas de antigénio. Finally, pMHC coloração tetrâmero e ICS normalmente requerem pessoal altamente treinado, reagentes comparativamente caros, sofisticados instrumentos e instalações dedicadas, tornando estas técnicas notoriamente difícil de implementar em um acompanhamento clínico.
As aplicações futuras: Dual cor ensaios ELISPOT capazes de detectar simultaneamente a produção de IFN-γ tanto e IL-2 44 e métodos de dupla e tripla cor fluorospot 45 geraram grande interesse, uma vez que permitem a avaliação do polyfunctionality de antígeno específico T linfócitos, o que é uma característica importante de célula eficiente respostas imunes mediadas por 46.
As etapas críticas no âmbito do protocolo: questões técnicas adicionais devem ser dada uma consideração cuidadosa. Porque muitas variáveis podem afetar a qualidade de local (ou seja, tamanho e densidade) e entorpecidoer, a adesão ao protocolo é essencial para alcançar resultados sensíveis e reprodutíveis. O uso consistente dos tipos específicos de anticorpos monoclonais (de captura e de detecção), placas ELISpot com membranas de PVDF, e em etanol 35% para o tratamento da membrana antes do revestimento, é de grande importância. Por exemplo, excesso de tratamento com etanol pode afectar o desempenho do ensaio de mancha e qualidade. Para evitar a obtenção de poços uninformative (ie> 300 pontos), recomendamos o uso não mais do que 2 x 10 5 PBMC por poço. Quando confrontados com baixas freqüências de células T específicas de antígenos, a sensibilidade do ensaio pode ser reforçada por células prestimulating in vitro com antígeno cognato ou expandi-los com ativadores policlonais como fito-hemaglutinina (PHA), por um período definido de tempo (geralmente 3-7 dias) 38 . No entanto, o procedimento final optimizado para o ensaio de VZV ELISpot aqui apresentados não incluem a pré-estimulação in vitro e / ou etapas de expansão. Número e quality de manchas foram semelhantes ao longo de um intervalo de incubação de 16-21 horas. Além 21 horas de incubação, os pontos eram muitas vezes mais difusa e às vezes sobrepostas, tornando a sua enumeração mais difícil. Além disso, movendo-se as placas, enquanto as células são incubação pode levar a manchas fuga do caracol mal definidos que sejam também mais difícil de contar. Sugestões adicionais de solução de problemas são fornecidos na Tabela 1.
Quando se utiliza um contador local automatizado, a sensibilidade e o tamanho do ponto de propagação são definidas utilizando o controlo positivo (anticorpo monoclonal anti-CD3) e controlo negativo (meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS). As características importantes a considerar durante a enumeração local são de tamanho e forma (Figura 4). O primeiro permite distinguir células T manchas de citocinas derivadas de manchas de fundo que devem ser ignorados. Número natural proporciona uma estimativa da frequência de células T específicas de VZV presente num dado PBAmostra MC, enquanto que o tamanho do ponto reflecte a quantidade de IFN-γ é produzido por cada células individuais.
Para nosso conhecimento, este é o único método ELISpot-γ IFN que faz uso de γ irradiados vivo atenuado da vacina VZV como antígeno 4. Painéis de péptidos sintéticos que se sobrepõem (15-meros), também têm sido usados como antigénio, incluindo mistura de peptídeos baseados na sequência de aminoácidos da fosfoproteína VZV IE63. IE63 é altamente imunogênica 47 e parece ser crucial para a infectividade viral e do estabelecimento de latência 48. IE63 células T específicas foram detectadas em VZV saudáveis dadores seropositivos 15, o que sugere que IE63 é um alvo importante da imunidade celular contra o VZV. No entanto, as células reactivas foram encontrados para ser em grande parte, as células T CD4 + 15.
O ensaio de VZV IFN-γ ELISpot foi anteriormente utilizada por our grupo para avaliar as respostas das células T específicas VZV em 28 crianças que se submeteram UCBT para tratar doenças do sangue neoplásicas ou herdados 4. Os resultados que foram obtidos durante o decorrer deste estudo sugerem que ambos os subconjuntos de células T CD4 + e células T CD8 + foram implicados na produção de IFN-γ e que a reconstituição do compartimento de células T CD8 + naive levou a mais robusta de células específicas de VZV em respostas imunitárias mediadas termos de produção de IFN-γ. Mais importante, estes resultados também mostram que a detecção de mais do que 150 SFU por 10 6 PBMC era consistente com a de células T mediada protecção contra a infecção por VZV ou reactivação 4. No entanto, este valor limite para VZV imunidade celular específica no contexto de UCBT e consequente reconstituição imune ou a falta dela terá de ser validado em grandes estudos multicêntricos prospectivos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer os participantes do estudo e seus pais. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para o acesso ao seu leitor ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para análise estatística, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty para especialista técnico assistência. Apoiada por doações de le Fonds d'opération pour les Projets de Recherche et d'Clinique des evalution tecnologias (CHU Sainte-Justine) para HS e PO, por la Fondation Centre de Cancerologie Charles-Bruneau, e pelo Leukemia & Lymphoma Society of Canadá. ISF foi apoiado por bolsas de estudo de la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG foi o destinatário de bolsas de estudo do Departamento de Microbiologia, Imunologia & Infecciologia, Université de Montréal (Gabriel-Marquês de Bolsas de Estudo), FRQS, e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). NM foi apoiado por la Fondation CHU Sainte-Justine, a Fundação Cole, e FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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