Summary
Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).
Abstract
Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.
Introduction
Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von 1 verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV 4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative Inzidenz von VZV-Erkrankung VZV Krankheit nach 3 Jahren postUCBT 46% 2. Bei diesen Patienten ist die de novo-Infektion oder Reaktivierung von VZV oft mit viszeralen Verbreitung des zentralen Nervensystems, der Lunge und der Leber 5-7 verbunden. Als ein Ergebnis, Aciclovir, Valaciclovir oder Famciclovir Prophylaxe wird allgemein UB verwaltetCT-Empfänger 8,9. Allerdings ist diese Behandlungsstrategie berücksichtigt nicht das Schutzpotential von VZV-spezifischen T-Lymphozyten oder die Kinetik der Wiederherstellung der VZV-spezifischen T-Zellreaktionen. Mögliche Probleme mit der expandierenden Verwendung von langfristigen Prophylaxe antiherpetischen verbunden sind, umfassen: a) Patientenübertherapie; b) die Entwicklung von antiviralen Medikamentenresistenz 10,11; und c) Wertminderung von VZV-spezifische Immun Rekonstitution 12,13. Weil Erkennung von Funktions VZV-spezifischen T-Lymphozyten korreliert mit der Anwesenheit von langfristigen Schutz von VZV-Infektion und verbesserte klinische Ergebnis 4,14,15, Monitoring-Zell-vermittelten Immunantwort gegen VZV gerichteten während der Posttransplantationsphase könnte in einer rationelleren Verwendung von antiviralen führen Behandlung, indem Ärzte, Patienten, die von VZV-Prophylaxe profitieren würden, unterscheiden sich von denen, deren Immunsystem ist in der Lage zu kontrollieren VZV-Replikation 4,13.
Die IFN-γ ELISPOT-Assay wird häufig für die Überwachung zellvermittelte Immunreaktionen in einer Vielzahl von experimentellen Systemen und klinischen Bedingungen verwendet. Punkte werden durch die Spaltung eines chromogenen Substrat erzeugt, wodurch ein sichtbarer Niederschlag und stabil an der Stelle der Reaktion. Jeder Spot stellt damit den Platzbedarf eines einzelnen Zytokin-produzierenden Zelle. IFN-γ ELISPOT misst nicht nur die Fähigkeit der einzelnen Zellen ex vivo IFN-γ in Antwort auf in vitro-Stimulation mit verwandten Antigen produzieren, sondern es stellt auch eine Abschätzung der Frequenz des reagierenden Zellen in einer gegebenen Zellpopulation 16,17. Zusätzlich zu seiner hohen Empfindlichkeit, IFN-γ ist ELISpot unkompliziert durchzuführen, wodurch ihre Anwendung im Rahmen der personalisierten klinische Protokolle zu lenken Beginn oder nach Absetzen der antiviralen Behandlung richtet möglich. Das Verfahren unter describ detailliertes ein ELISpot Assay, der speziell entwickelt wurde, um durch periphere mononukleare Blutzellen erkennen und messen die Produktion von IFN-γ nach in vitro Stimulation mit VZV-Antigenen abgeleitet.
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Protocol
Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethik Institutional Review Board von CHU Sainte-Justine in Montreal, Quebec, Kanada, wo die Studie durchgeführt wurde genehmigt. Informierte Zustimmung wurde gesucht und von allen Studienteilnehmern, deren Eltern oder Erziehungsberechtigten erhalten. Alle Verfahren durchgeführt an den Tagen 1 und 2 müssen unter sterilen Bedingungen (dh unter einem Abzug mit laminarer Strömung) durchgeführt werden. Standard-Sicherheitsvorkehrungen im Umgang mit menschlichem Blut sollte unbedingt beachtet werden.
1. Beschichtung der Platten
- Permeabilisieren Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen an der Unterseite 96 sowie IP-Multiscreen-Platten weiße ELISpot, indem zu jedem Well 20 &mgr; l 35% Ethanol für 1 min. Membranen sollten leicht durchscheinend geworden.
- Sofort die Wells 3-mal mit 200 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) mit einem mulChannel-Pipette oder einer ähnlichen Einrichtung. Dieser Schritt ist wichtig, dass Ethanol gegeben Rückstände können die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen und Bindung von Capture-Antikörper. ELISpot Platten sind empfindlich und sollte sorgfältig behandelt werden: die Verwendung eines automatisierten Plattenwasch wird nicht empfohlen.
- Beschichtung der Vertiefungen mit 10 &mgr; l gereinigtem Maus-Anti-Human-IFN-γ-Capture-Antikörper in 1 × PBS auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml verdünnt. Decken Sie die Platten mit regelmäßigen Plastikfolie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C
2. Sperrplatten
- Leeren Sie den Brunnen, tippen sie trocken, und waschen Platten 5 mal mit 200 ul 1x PBS.
- Füllen der Vertiefungen mit 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium und Inkubation Platten für 2 Stunden bei 37 ° C (Blockbildungsschritt).
- Waschen Sie die Platten 5x mit 200 ul 1x PBS und halten die Brunnen voller 1x PBS, bis die Zellen bereit sind, beschichtet werden.
3. Überzug und Zellstimulation
- Bereiten peripheral mononukleare Blutzellen (PBMC) aus menschlichen Blutproben durch Zentrifugation auf Ficoll-Paque-Gradienten unter Verwendung von Standardverfahren. Alternativ kann unter Verwendung von Standardverfahren, auftauen Aliquots von PBMC unter flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach der letzten Zentrifugation Die Zellen in einer Endkonzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml beimpft und über Nacht bei 37 ° C unter einer 5% CO 2-Atmosphäre in einem Wassermantel-Inkubator.
- Entfernen PBMC aus dem Inkubator und resuspendieren sie in einem Endvolumen von 5 ml vollständigem RPMI-1640-Medium.
- Inkubieren PBMC in Gegenwart von 10 ul gentechnisch Endonuklease aus Serratia marcescens für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie ein 50 ul Aliquot PBMC und mit 50 ul Trypanblau mischen. Zählen von Zellen und schätzen% Lebensfähigkeit mit einem Hämocytometers und mikroskopische Untersuchung (Farbausschlussmethode). Verschiedene automatisierte Verfahren zur Zellzählung und Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen kann also verwendet werden. PBMC sollte> 95% lebensfähig. Entsorgen Probe, wenn die Lebensfähigkeit unter 95% liegt.
- PBMC Zentrifuge bei 700 × g für 5 Minuten, Verwerfen Standes und Resuspension Zellen in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (HIS) ergänzt war, bei einer Endkonzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml. Halten bei 37 ° C bis zur Stimulation Mischungen werden auf die Platte gegeben.
- In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul der geeigneten Stimulations Mischung. Drei Stimulations Mischungen verwendet, wie unten beschrieben:
- Verwendung AIM-V-Medium mit 2% (v / v) inaktiviertes Humanserum (IHS) als Negativkontrolle ergänzt.
- Verwenden monoklonalen Anti-CD3-Antikörper (Klon OKT3) in AIM-V-Medium verdünnt, mit 2% (v / v) ergänzt IHS zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml als positive Kontrolle).
- VZV-Antigen zu verwenden, in der Form von entweder γ-bestrahlten (10.000 Gy, 30 min Belichtungszeit) attenuierte VZV-Impfstoff (1.350 Plaque-bildende Einheiten [pfu] / ml) Verdünnungsted 1:200 in AIM-V-Medium mit 2% (v / v) IHS) oder 1 &mgr; g einer äquimolaren Mischung von 67 Peptiden (15 Aminosäurereste), synthetisiert auf Basis der Sequenz des VZV unmittelbar frühen (IE63) ergänzt Phosphoprotein . Steuerung Bestrahlung durch Überwachen der Wirksamkeit ohne sichtbare Anzeichen von zytopathischen Wirkungen nach 4 Tagen in PBMC-Kulturen.
- Bereiten Sie alle Brunnen in zweifacher Ausfertigung.
- In den Vertiefungen, ein Tropfen auf einmal 100 ul Zellen in Schritt 5.4 in die entsprechenden Vertiefungen hergestellt. Zwei Brunnen sollte ohne Zellen (Negativkontrolle) überlassen werden. Inkubation für 20 Stunden bei 37 º C unter einer 5% CO 2-Atmosphäre in einem Wassermantel-Inkubator. Nicht schütteln, verschieben oder stapeln Sie die Platten auf einander während der Inkubation.
4. Spot-Entwicklung und-Erkennung
- Entsorgen Sie die Zellen und waschen die Platten 10x mit 1x PBS, ergänzt mit 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hilft lösen Zellen, die PVDF mir anhaftenmbrane folgenden Inkubation über Nacht.
- Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit 100 ul 0,5 mg / ml Biotin-konjugiertem Anti-IFN-γ monoklonalen Antikörper (Klon 4S.B3) in 1x PBS, enthaltend 0,5% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA). Inkubation erfolgt für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Vertiefungen 6x mit PBST und fügen Sie jedem gut 100 ul Streptavidin conjugatd mit alkalischer Phosphatase 1:1000 verdünnt in 1x PBS mit 0,5% (w / v) BSA. Die Platten abdecken und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Platten 3x mit PBST und 3x mit 1x PBS. 100 l einer 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) / Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)-Substrat-Lösung, Inkubation 5 min bei Raumtemperatur.
- Unter fließendem destilliertem Wasser waschen die Teller. Entfernen Sie den unteren Teil des ELISpot Platte und waschen Sie beide Seiten der Membran mit destilliertem Wasser. Luft trocknen die Platten.
- Untersuchen Sie die Brunnen und die Punkte aufzählen, mit einem stereoskopischen dissection Mikroskop oder scannen die Platten mit Hilfe eines automatisierten Punktzähler. Halten Sie die Platten weg vom Licht, wenn sie nicht am selben Tag untersucht werden.
- Der Mittelwert der Anzahl von Flecken in entsprechenden doppelten Vertiefungen gezählt und subtrahiert die Anzahl von Punkten in der negativen Kontrollvertiefungen gezählt (keine Zellen) von der Anzahl der Punkte in den Testvertiefungen gezählt.
- IFN-γ Express Produktion wie die Anzahl der spot-bildenden Einheiten (SFU) pro 10 6 PBMC.
- Bedenken Sie, dass Proben sind positiv, wenn die Anzahl der SFU> 50 pro 10 6 PBMC und 2 Standardabweichungen (SD) über der Negativkontrolle (Zellen + AIM-V-Medium mit 2% (v / v) ergänzt IHS).
- Verwenden Sie einen Wert von 400 pro SFU gut, wenn zu viele Punkte zu zählen sind.
- Testen Sie, ob ELISpot Daten normal verteilt sind oder nicht mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen statistische Vergleiche mit Student-t-test (2 Gruppen) oder ANOVA und der Bonferroni Post-Test (multiple Vergleiche). Wenn die Daten nicht normalverteilt sind, verwenden Sie den Mann-Whitney-U-Test (2 Gruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test und Dunn Post-Test (multiple Vergleiche).
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Representative Results
Die IFN-γ ELISPOT-Protokoll oben beschrieben entwickelt wurde und in unserem Labor optimiert, um das Ausmaß und die Qualität der zellvermittelten Immunreaktionen gegen VZV 4 gerichtet messen. Verschiedenen Quellen der VZV-Antigen zur Stimulation Schritt verwendet werden. Dazu gehören: a) im Handel erhältlich Waschmittel inaktiviert Auszüge aus VZV-infizierten Vero-Zellen 18; b) Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die aus spezifischen VZV kodierten Proteine, einschließlich IE63 15 und ORF4 19; c) lebende, abgeschwächte Varicella-Zoster-Impfstoff 20; und d) UV-inaktivierten Präparationen von VZV-Antigene aus dem Überstand gestört VZV-infizierten MRC-Zellen 14. In unserem Fall wurden Verdünnungen von abgeschwächten Lebendimpfstoff VZV bevorzugt über Zellkultur abgeleitet VZV, um die Einheitlichkeit in Antigenquelle und Vorbereitung zu versichern und Kultur und Manipulation von Live-Wildtyp-VZV-Stämme in einer klinischen Umgebung, wo nosokomiale Trans begrenzenn ist ein ernstes Problem 10. Zusätzlich wurde γ-Bestrahlung UV-Inaktivierung über 21 wegen der Genauigkeit, mit der Vergleichs Dosen von γ-Strahlung geliefert werden bevorzugt und weil, anders als UV, γ-Strahlen wirksam abgedichtet VZV enthält Fläschchen einzudringen. Bestrahlung der viralen Stamm führte durchweg höhere Schätzungen der Häufigkeit von VZV-spezifischen IFN-γ-produzierenden Zellen in PBMC-Proben von einem gesunden Spender bei allen Verdünnungen von VZV-Antigen getestet (Figur 1) erhalten. Dies ist möglicherweise das Ergebnis der Abschwächung der zytopathischen Wirkungen von lebenden abgeschwächten VZV in Zellkultur induziert.
Um festzustellen, welche Verdünnung VZV-Antigen ergab maximal Anzeigen in Bezug auf die Anzahl der SFU pro 10 6 PBMC wurde IFN-γ ELISpot unter Verwendung von zwei-fach Verdünnungen von γ bestrahlt attenuierten VZV-Impfstoff und PBMC-Proben aus einer Gruppe von immunkompetenten Kindern im Alter erhalten von 9 Monaten bis 12 years, die eine dokumentierte Varizellen-Anamnese und / oder eine positive Serologie für VZV (n = 50) hatten. . Studienteilnehmer wurden zu den Infektionskrankheiten Klinik und Immunologie Spezialklinik CHU Sainte-Justine zwischen Juni 2007 und September 2009 eingeschrieben wurden statistisch signifikante Unterschiede zwischen Median-Frequenzen von IFN-γ produzierenden Zellen, die mit dem 1:200, 1 erhalten wurden beobachtet: 400 und 1:800 Verdünnungen von VZV-Antigen (p <0,0001, Kruskal-Wallis-Test) (Fig. 2). Diese Unterschiede wurden von der Differenz zwischen dem 1:200-Verdünnung entfielen (Median = 115,0 SFU pro 10 6 PBMC; Interquartilbereich [IQR] = 75,0 bis 232,5 SFU pro 10 6 PBMC) und der Verdünnung 1:800 (Median = 50,0 SFU pro 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU pro 10 6 PBMC) und zwischen der 1:400 Verdünnung (Median = 92,5 SFU pro 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU pro 10 6 PBMC) und 1:800 Verdünnung (p <0,001 und p (Abbildung 2). Aus diesem Grund wird der 1:200-Verdünnung von γ bestrahlt lebendes abgeschwächtes VZV-Impfstoff wurde für den Einsatz in der Routine-Messungen der VZV-spezifischen zellvermittelten Immunreaktionen ausgewählt.
Zu bestimmen, ob IFN-γ Produktion liegt in CD4 + und / oder CD8 +-T-Lymphozyten-Untergruppen wurden PBMC-Proben von einem gesunden Spender erhalten werden, um Depletion von CD4 + oder CD8 +-Zellen unter Verwendung von Anti-CD4 oder Anti-CD8-Antikörper gekoppelte Magnetkügelchen unterworfen gemäß den Anweisungen des Herstellers. In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Berichten 22,23, Erschöpfung der CD4 +-Zellen führte zu einer markanten Reduktion der Frequenzen von IFN-γ produzierenden Zellen, die mit den 1:100, 1:200 und 1:400 Verdünnungen von VZV-Antigen erhalten wurden, während Depletion von CD8 +-Zellen nicht auf eine solche Reduzierung und der positiven Kontrolle führens (Stimulation mit Anti-CD3 monoklonaler Antikörper) wurden in ähnlicher Weise betroffen (Fig. 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Mehrzahl der Zellen, die IFN-γ produzieren in Antwort auf die Stimulation mit VZV-Antigene CD4 + T-Zellen. Alternativ könnten diese Ergebnisse von der Depletion von CD4 +-Antigen-präsentierenden Zellen (z. B. Monozyten, dendritische Zellen) aus der PBMC-Pool stammen, was zu verringerten Niveaus der Darstellung der VZV-Antigene auf CD8 +-T-Lymphozyten-Responder. Die Verwendung von bestrahlten VZV ist unwahrscheinlich, dass die Schrägstellung der Antwort auf CD4 Dominanz beigetragen haben, wurden ähnliche Ergebnisse von anderen Gruppen mit verschiedenen Techniken und Antigenquellen 14,21,22 erhalten. Ein niedriger Vergrößerung Aufnahme von repräsentativen ELISpot Brunnen ist in Abbildung 4 dargestellt.
| Problem / Frage | Mögliche Ursachen | Abhilfe / Lösung </ Td> |
| Hohe Hintergrund / Schlecht definierte oder konfluierende Flecken | Hohe Zahl von toten Zellen. | Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen vor Kultur-Set-up und Stimulation. |
| Unzureichende Membran vor, eine Benetzung Schritte. | Achten Sie darauf, vor der Benetzungszeit und dass die Membran wiederum zu respektieren, nach 1 min grau. 35% Ethanol sollte unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden. | |
| Platten bewegt während der Inkubationszeit. | Platten bewegen Sie nicht, schlecht definierten Schneckenspur Stellen zu vermeiden. | |
| Schritte waschen. | Handwäsche ist effizienter als Platte Unterlegscheiben. | |
| Bildung von Proteinaggregaten. | Beide Filter Erfassung und Erkennung von Antikörpern gegen Hintergrund und falsch-positive Flecken zu reduzieren. | |
| Sekundär-und Nachweis-Antikörper-Konzentration. | Stellen biotinylierten sedäre / Detektions-Antikörper-Konzentration in den Hintergrund zu reduzieren. | |
| Kalte Entwicklungs Reagenzien. | Bringen Substrat auf Raumtemperatur zu Unterentwicklung zu vermeiden. | |
| Keine Flecken / Blank Brunnen | Schlecht definierte Spots. | Während der Inkubationszeit Platten nicht stapeln, um eine homogene Temperatur in den verschiedenen Vertiefungen haben. |
| Stimulation Substrat nicht gut vorbereitet. | Bringt die Peptidmischung Aliquot auf Raumtemperatur für 15 min, um Kristallbildung zu vermeiden. | |
| Zelle verklumpen. | Die Zellen in Einzelzellsuspension zu einer Unterschätzung der spot-bildenden Einheiten zu vermeiden. | |
| Zellen nicht richtig stimuliert. | Verwenden Sie einen polyklonalen Aktivator als positive Kontrolle. | |
| Hemmung der Enzymreaktion durch Tween-20. | Warh Platten mit PBS, bevor BCIP / NBT-Substratlösung. | |
| Falsche Antikörperpaare. | Stellen Sie sicher, dass die Erfassung und Erkennung Antikörper mit verschiedenen antigenen Epitope reagieren. |
Tabelle 1. Zusätzliche Fehlersuche.
1. Wirkung von γ-Bestrahlung von lebenden VZV inaktiviert Impfstoff von der Frequenz des IFN-γ-produzierenden Zellen, wie unter Verwendung von IFN-γ ELISPOT. VZV-spezifische IFN-γ ELISPOT wurde gemäß Protokoll Text mit PBMC von einem Steuer Freiwilligen beschrieben durchgeführt und serielle Verdünnungen von γ bestrahlt (10.000 Gy) leben abgeschwächten VZV-Impfstoff-Antigen. Die Daten stellen den Mittelwert aus Doppel MeasureMents und Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. PBMC: periphere mononukleare Blutzellen; SFU: Spot-bildenden Einheiten; VZV: Varicella-Zoster-Virus.
Abbildung 2. Quantifizierung der VZV-spezifischen Zell-vermittelten Immunantwort bei Kindern mit dokumentierter Beweise für frühere Infektion mit VZV. VZV-spezifischen IFN-γ ELISpot wurde wie unter Protocol Text mit PBMC isoliert von Patienten mit einer Geschichte von Varizellen (n = 50) beschrieben durchgeführt und serielle Verdünnungen von γ bestrahlt (10.000 Gy) leben abgeschwächten VZV-Impfstoff-Antigen. Horizontale Linien stellen den Median, Boxen stellen Interquartilbereich (IQR) und Barthaare stellen den Wertebereich. PBMC: periphere mononukleare Blutzellen; SFU: Spot-bildenden Einheiten; VZV: Varicella-Zoster-Virus .
3. Wirkung der Depletion von CD4 + oder CD8 +-Zellen von der Frequenz des IFN-γ-produzierenden Zellen, wie unter Verwendung von IFN-γ ELISPOT. Depletion von CD4 + oder CD8 +-Zellen und VZV-spezifischen IFN-γ ELISPOT wurden wie unter beschrieben durchgeführt Protokoll Text mit PBMC von einem Steuer Freiwilligen und serielle Verdünnungen von γ bestrahlt (10.000 Gy) abgeschwächten Lebendimpfstoff als VZV-Antigen. Die Daten stellen den Mittelwert von zwei Messungen und Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. PBMC: periphere mononukleare Blutzellen; SFU: Spot-bildenden Einheiten; VZV: Varicella-Zoster-Virus.
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Abbildung 4. Vertreter ELISpot Brunnen. VZV-spezifischen IFN-γ ELISpot wurde wie unter Protocol Text mit PBMC von fünf Steuer Freiwilligen und serielle Verdünnungen von γ bestrahlt (10.000 Gy) leben abgeschwächten VZV-Impfstoff als Antigen beschrieben durchgeführt. Erste Reihe: Negativkontrollen (AIM-V-Medium mit 2% (v / v) ergänzt IHS); zweite Reihe: Positivkontrollen (anti-CD3 monoklonalen Antikörper); dritte Reihe: VZV-Antigen. Die Zahlen in den oberen Ecken repräsentieren SFU pro Vertiefung, gemessen unter Verwendung eines automatisierten Punktzähler. PBMC: periphere mononukleare Blutzellen; SFU: Spot-bildenden Einheiten; VZV: Varicella-Zoster-Virus; IHS: inaktiviertes Humanserum.
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Discussion
Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), 24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) 26 gerichtet zu untersuchen, 27, 28,29 und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffnung auf die Definition Korrelate der VZV-spezifischen Immunrekonstitution bei der Wiederherstellung der pädiatrischen UCBT Empfänger.
Wesentliche Merkmale dieses Tests sind vier-fache. Erstens ist es nicht Stand der Technik in vitro Expansion von T-Zellen, was zeitaufwendig ist erforderlich. Zweitens kann es unter Verwendung von kryokonservierten PBMC-Proben, die am besten ist es, Interassay-Variabilität zu minimieren. Außerdem Kryokonservierung und parallele Verarbeitung sind gut geeignet, um Längsnen Studien, die die Proben in Chargen verarbeitet zu werden. Drittens, Zellverklumpung beim Auftauen von PBMC, die Behandlung mit einem hochreinen gentechnisch Endonuklease aus Serratia marcescens verwendet aufgetreten verhindern. Zellklumpenbildung beim Auftauen PBMC tritt häufiger bei Verwendung von Blutproben, die über Nacht bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung übrig sind. Der Einbau von gentechnisch Endonuklease aus Serratia marcescens bekanntermaßen nicht die Lebensfähigkeit der Zellen die Expression von Zelloberflächenmarker und Reaktion auf Stimulation mit verwandten Antigen in Form von SFU seit niedrige Nuklease beeinflusst werden und die Dauer der Exposition ist kurz 22. Viertens, γ bestrahlt attenuierten VZV-Impfstoff wurde verwendet, um PBMC stimulieren. Es wurde über Zellkultur abgeleitet VZV, um die Einheitlichkeit in Antigendosis und Vorbereitung zu gewährleisten und die Notwendigkeit für die Manipulation von Live-VZV in einer klinischen Umgebung, wo die Sicherheit der Patienten und zu überwinden bevorzugtLaborpersonal ist ein wichtiges Anliegen. Zusammengenommen wurden die Änderungen, die in dem VZV-ELISPOT-Assay bestimmt wurden eingeführt, um es für die Verwendung in einer klinischen Umgebung besser geeignet.
Grenzen der Technik Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden: Einfache, empfindliche und reproduzierbare Methoden, um Host-Zell-vermittelten Immunantwort gegen mikrobielle Antigene im Rahmen der klinischen Follow gerichtet Messung erforderlich. IFN-γ ELISpot ist eine robuste, reproduzierbare und informativen Test, die mit relativ niedrigen Tech-Ausrüstung (Zentrifugen, Inkubatoren, Dissektionsmikroskop) an Blutproben durchgeführt werden können. Allerdings ist es nicht ohne weiteres erlauben den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Zytokine und Zelloberflächenmarker. Traditionelle in vitro T-Zell-Proliferationsassays, die klassisch für die Auszählung von CD4 + und CD8 +-Antigen spezifisch verwendet wurdenc T-Zell-Antworten, arbeitsintensiv sind, fehlt die Empfindlichkeit und neigen dazu, von einem hohen Grad an Variabilität zwischen 30,31 leiden. Auf der anderen Seite, zytotoxische T-Lymphozyten-Assays (CTL) auf der Grundlage der Lyse von autologen Targets mit 51 Cr und Grenzverdünnungsanalyse geladen eher auf zeitaufwendig in vitro Expansion Schritte zur antigenspezifischen CD8 +-T-Zellen, die an ein vorliegen quantifizieren hängen niedrigen Frequenzen Vorläufer 32,33. Durchflusszytometrie basierenden Assays messen die Zytokinsekretion nach Antigenstimulation (intrazelluläre Cytokin-Färbung [ICS]) 34,35 können auch verwendet werden, um Antigen-spezifische Immunantworten zu charakterisieren. ICS ermöglicht die gleichzeitige Detektion von Cytokin-Produktion und Zelloberflächenexpression von phänotypischen Markern in einzelnen Zellen. Die Empfindlichkeit des ICS vergleicht der von ELISpot, aber eine größere Anzahl von Zellen 36,37 erfordert. Methoden, die Verwendung von fluoreszierenden Klasse I oder Klasse-II-Peptid-ma machenjor Histocompatibility Complex (pMHC) Oligomere (pMHC Tetramere) 38-40 sind präzise und ermöglichen multi Charakterisierung von Lymphozytenuntergruppen basierend auf der Expression von Zelloberflächenmarkern. , Erfordert pMHC Tetramerfärbung jedoch Vorwissen der Patienten "Human-Leukozyten-Antigen (HLA)-Typ, der mühsam sein und die Patientenaufnahme zu begrenzen, in einem gegebenen Studie kann. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist, dass pMHC Tetramerfärbung ermöglicht vor allem den Nachweis von T-Zellen, die mittel-bis hochaffine T-Zell-Rezeptoren (TCR) 41. Andererseits können CD8 + T-Zellen, die mit geringer Affinität TCRs, die nicht durch pMHC Tetrameren gefärbt werden leicht unter Verwendung von IFN-γ ELISPOT 41 detektiert werden. Zusätzlich kann pMHC Tetramere sogenannten erschöpften CD8 + T-Lymphozyten, die weit verbreitet sind chronische virale Infektionen 42,43 binden, wodurch die Funktionsbeurteilung der Antigen-spezifischen zellvermittelten Immunreaktionen Schräg. Finally, pMHC Tetramerfärbung ICS und erfordern in der Regel gut ausgebildete Personal, vergleichsweise teure Reagenzien, ausgefeilte Instrumente und spezielle Einrichtungen, so dass diese Techniken notorisch schwierig, in einer klinischen Follow-up-Einstellung umzusetzen.
Zukünftige Anwendungen: Dual Farbe ELISpot-Assays, der gleichzeitig Erfassung der Produktion von IFN-γ sowohl und IL-2-44 und Dual-und Triple-Farbe FLUOROSPOT Methoden 45 haben großes Interesse erzeugt, wie sie erlauben die Beurteilung der Polyfunktionalität von Antigen-spezifischen T- Lymphozyten, was ein wichtiges Merkmal effizienter Zell-vermittelten Immunantworten 46 ist.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls: Zusätzliche technische Fragen müssen sorgfältig geprüft werden. Da viele Variablen könnten Spot-Qualität (dh Größe und Dichte) und taub beeinflussenäh, ist die Einhaltung des Protokolls wichtig, empfindliche und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Der konsequente Einsatz von bestimmten Marken von monoklonalen Antikörpern (Erfassung und Erkennung), ELISpot-Platten mit PVDF-Membranen und 35% Ethanol für Membranbehandlung vor der Beschichtung ist von großer Bedeutung. Zum Beispiel können Übertherapie mit Ethanol die Leistung des Assays und Spotqualität beeinträchtigen. Um den Erhalt uninformative Brunnen (dh> 300 Punkte) zu vermeiden, empfehlen wir die Verwendung von nicht mehr als 2 x 10 5 PBMC pro Vertiefung. Wenn sie mit niedrigen Frequenzen von Antigen-spezifischen T-Zellen gegenüber, können die Empfindlichkeit des Assays durch Vorstimulierer Zellen in vitro mit verwandten Antigen verbessert oder erweitert sie mit polyklonalen Aktivatoren, wie Phytohämagglutinin (PHA) für einen definierten Zeitraum (üblicherweise 3-7 Tage) 38 . Allerdings ist die endgültige optimierte Verfahren für die VZV-ELISPOT-Assay hier aufgeführten in vitro Vorstimulation und / oder Expansionsschritten umfassen. Anzahl und quality von Flecken waren ähnlich über einer Inkubationszeit von 16-21 h Bereich. Über 21 h Inkubation wurden die Flecken oft diffuser und manchmal überlappenden, die ihre Zählung schwieriger. Darüber hinaus bewegen die Platten, während die Zellen Inkubation kann schlecht definiert Schneckenspur Flecken, die ebenfalls mehr schwer zu zählen sind zu führen. Weitere Hinweise zur Fehlerbehebung sind in Tabelle 1 angegeben.
Bei der Verwendung eines automatisierten Punktzähler, Empfindlichkeit und Spotgröße Gating werden mit positiven Kontrolle (anti-CD3 monoklonaler Antikörper) und Negativkontrolle (AIM-V-Medium mit 2% (v / v) ergänzt IHS) eingestellt. Die wichtigsten Eigenschaften, um beim Punkt Aufzählung berücksichtigen sind Größe und Form (Abbildung 4). Der ehemalige ermöglicht es, T-Zell-Zytokine Spots abgeleitet von Hintergrund-Spots, die ignoriert werden sollte unterscheiden. Punktzahl liefert eine Schätzung der Frequenz des VZV-spezifischen T-Zellen in einem gegebenen PB vorhandenMC Probe, während die Punktgröße zeigt, wie viel IFN-γ wird von jeder einzelnen Zellen produziert.
Nach unserer Kenntnis ist dies die einzige IFN-γ ELISPOT-Methode, die Verwendung von γ Live bestrahlt abgeschwächten VZV als Vakzin-Antigen 4 ermöglicht. Platten überlappenden synthetischen Peptiden (15-mere) wurden als Antigen, einschließlich Gemisch von Peptiden auf der Basis der Aminosäure-Sequenz des VZV-IE63 Phosphoprotein verwendet. IE63 ist hoch immunogen 47 und scheint für die virale Infektiosität und die Einrichtung von Latenz 48 zu sein. IE63-spezifischen T-Zellen in gesunden VZV-seropositiven Spendern 15, was darauf hindeutet, dass IE63 ist ein wichtiges Ziel, die zellvermittelte Immunität gegen VZV gerichteten nachgewiesen. Jedoch wurden reaktiven Zellen gefunden weitgehend CD4 +-T-Zellen 15 sein.
Die IFN-γ VZV ELISpot Assay wurde zuvor von o verwendetur-Gruppe, um die spezifischen T-Zellantworten VZV in 28 Kinder, die UCBT unterzog neoplastische oder vererbten Blutkrankheiten behandeln 4 beurteilen. Ergebnisse, die im Verlauf dieser Studie erhalten wurden vorgeschlagen, dass sowohl CD4 + und CD8 + T-Zell-Untergruppen wurden in IFN-γ Produktion und daß Rekonstitution der naive CD8 + T-Zell-Kompartiment gebracht führte zu robusteren VZV-spezifische zellvermittelte Immunreaktionen in hinsichtlich der IFN-γ-Produktion. Wichtiger ist, zeigten diese Ergebnisse auch, dass der Nachweis von mehr als 150 SFU pro 10 6 PBMC war konsistent mit T-Zell-vermittelten Schutz gegen eine VZV-Infektion oder Reaktivierung 4. Doch dieser Schwellenwert für die VZV-spezifische zellvermittelte Immunität im Kontext der UCBT und die anschließende Wiederherstellung des Immunsystems oder deren Fehlen müssen in größeren prospektiven multizentrischen Studien validiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Studienteilnehmer und ihre Eltern zu danken. Wir möchten auch Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) für den Zugang zu seiner ELISpot-Leser, Dr. Lubo Alexandrov für die statistische Analyse danken und Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois und Martine Caty für technische Experten Unterstützung. Unterstützt durch Zuschüsse aus le Fonds d'Opération pour les Projets de recherche et d'Clinique EVAlution des Technologien (CHU Sainte-Justine) an HS und PO, von la Fondation Centre de Cancérologie Charles-Bruneau, und von der Leukemia & Lymphoma Society of Kanada. ISF wurde von Stipendien von la Fondation CHU Sainte-Justine und le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS) unterstützt. AJG war der Empfänger der Stipendien von der Abteilung für Mikrobiologie, Infektiologie und Immunologie, Université de Montréal (Gabriel Marquis-Stipendium), FRQS und die Canadian Institutes of Health Rorschung (CIHR). NM wurde von la Fondation CHU Sainte-Justine, der Cole-Stiftung und FRQS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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