Summary
أجيال جديدة من المقايسات وظيفية مثل انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) ELISPOT، الذي كشف عن إنتاج السيتوكينات على مستوى خلية واحدة وتقديم كل من توصيف الكمي والنوعي للاستجابات الخلايا التائية يمكن استخدامها لتقييم الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد الحماق النطاقي فيروس (جدري الماء).
Abstract
الفيروس النطاقي الحماقي (VZV) هو سبب كبير من المراضة والوفيات التالية السري زرع دم الحبل السري (UCBT). لهذا السبب، يتم إدارتها بشكل منهجي الوقاية antiherpetic إلى المستلمين UCBT الأطفال لمنع المضاعفات المرتبطة عدوى جدري الماء، ولكن ليس هناك والتوافق على أساس أدلة قوية على أن يحدد مدته الأمثل. لأن الخلايا التائية الحصانة بوساطة هي المسؤولة عن السيطرة على العدوى الفيروس النطاقي الحماقي، وتقييم إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV المحددة التالية UCBT يمكن أن توفر مؤشرات حول ما إذا كان ينبغي الحفاظ على الوقاية أو يمكن وقفها. تحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير انترفيرون غاما VZV محددة (الإنترفيرون γ) انزيم مرتبط immunospot (ELISPOT) مقايسة لتوصيف إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا اللمفية تي ردا على التحفيز في المختبر مع المشع الحية الموهنة لقاح جدري الماء. ويوفر هذا الاختبار قياس السريع، واستنساخه وحساسة من VZV ج محددةالذراع بوساطة الحصانة مناسبة لرصد إعادة تشكيل VZV الحصانة محددة في عملية إعداد سريرية وتقييم الاستجابة المناعية لمستضدات الفيروس النطاقي الحماقي.
Introduction
أجريت لأول مرة في عام 1989، ويستخدم UCBT متزايد كجزء من علاج مختلف اضطرابات الدم والأورام لدى الأطفال nonneoplastic 1. جدري الماء هو alphaherpesvirus الإنسان والذي يسبب الاعتلال الخلوي اثنين من أمراض مختلفة، الحماق (بعد العدوى الأولية) والهربس النطاقي (بعد إعادة تنشيط). بعد الإصابة الأولية، VZV استمرت طوال حياة المضيف محمية داخل الأعصاب الحسية من العقد الجذرية الظهرية. واحد من المضاعفات المعدية الأكثر تهديدا التالية UCBT يرتبط مع VZV 2-4. في مركز السريرية لدينا، في غياب VZV الاتقاء، وكان معدل التراكمي للمرض جدري الماء مرض جدري الماء في 3 سنوات postUCBT 46٪ 2. في هؤلاء المرضى، وغالبا ما يترافق مع الإصابة من جديد أو تنشيط VZV مع نشر الحشوية إلى الجهاز العصبي المركزي والرئتين والكبد 5-7. كما يتم إدارتها نتيجة لذلك، الأسيكلوفير، valacyclovir أو famciclovir الوقاية عادة لUBالمتلقين CT 8،9. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية العلاج لا تأخذ بعين الاعتبار إمكانات واقية من الفيروس النطاقي الحماقي الخلايا الليمفاوية T معينة أو حركية إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV محددة. المشاكل المحتملة المرتبطة التوسع في استخدام العلاج الوقائي antiherpetic المدى الطويل وتشمل أ) overtreatment المريض؛ ب) تطوير فيروسات مقاومة للأدوية 10،11؛ وج) ضعف المناعة من الفيروس النطاقي الحماقي إعادة محددة 12،13. لأن الكشف عن الفيروس النطاقي الحماقي وظيفية محددة الخلايا اللمفية تي يرتبط مع وجود حماية على المدى الطويل من عدوى جدري الماء وتحسين النتائج السريرية 4،14،15، ورصد الخلية بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد الفيروس النطاقي الحماقي خلال الفترة posttransplant قد يؤدي إلى استخدام أكثر عقلانية من فيروسات العلاج عن طريق تمكين الأطباء الممارسين للتمييز المرضى الذين سيستفيدون من العلاج الوقائي VZV من أولئك الذين قادرة على السيطرة على تكرار VZV 4،13 الجهاز المناعي.
ويستخدم على نطاق واسع ELISPOT مقايسة-γ IFN للخلية الرصد بوساطة الاستجابات المناعية في مجموعة متنوعة من النظم التجريبية والحالات السريرية. يتم إنشاؤها البقع عقب انشقاق من ركيزة مولد اللون، وتوليد راسب وضوحا واستقرارا في موقع رد الفعل. كل بقعة الفردية مما يمثل البصمة خلية المنتجة للخلوى الفردية. الإنترفيرون γ ELISPOT يقيس ليس فقط قدرة الخلايا الفردية فيفو السابقين لإنتاج الإنترفيرون γ ردا على التحفيز في المختبر مع مستضد وما شابه ذلك، ولكنه يوفر أيضا تقديرا من وتيرة الاستجابة الخلايا في السكان خلية معينة 16،17. بالإضافة إلى حساسية عالية، والإنترفيرون γ ELISPOT واضح ومباشر على القيام بها، مما يجعل من الممكن استخدامه في سياق بروتوكولات سريرية شخصية تهدف إلى بدء أو وقف العلاج المضاد للفيروسات التوجيهية. الإجراء المفصلة أدناه describوفاق مقايسة ELISPOT التي تم تصميمها خصيصا لكشف وقياس إنتاج الإنترفيرون γ من قبل خلايا الدم المحيطية التالية في المختبر التحفيز مع مستضدات الفيروس النطاقي الحماقي مشتقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس البحوث المؤسسية أخلاقيات استعراض CHU سانت جوستين في مونتريال، كندا، حيث أجريت الدراسة. وطلب الموافقة المسبقة والتي تم الحصول عليها من جميع المشاركين في الدراسة، والديهم أو الأوصياء القانونيين. كافة الإجراءات التي أجريت على أيام 1 و 2 يجب أن تتم تحت ظروف معقمة (أي تحت غطاء تدفق الصفحي). ينبغي مراعاة إجراءات السلامة القياسية للتعامل مع الدم البشري بدقة.
1. طلاء لوحات
- Permeabilize في difluoride البولي فينيل (PVDF) الأغشية في الجزء السفلي من 96 جيدا لوحات متعددة الشاشات IP ELISPOT الأبيض بإضافة إلى كل بئر 20 ميكرولتر من 35٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. ينبغي أن تصبح الأغشية شفافة قليلا.
- يغسل فورا الآبار 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام مولtichannel ماصة أو جهاز مماثل. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية بالنظر إلى أن مخلفات الإيثانول يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية وملزمة من التقاط الأجسام المضادة. لوحات ELISPOT هشة ويجب التعامل معها بعناية: لا ينصح استخدام لوحة غسالة آلية.
- معطف الآبار مع 10 ميكرولتر من الماوس المنقى مكافحة الإنسان الإنترفيرون γ التقاط الأجسام المضادة المخفف في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية لوحات مع الاغطية البلاستيكية العادية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. حجب لوحات
- إفراغ الآبار، والتنصت لهم الجافة، وغسل الأطباق 5 مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
- ملء الآبار مع 200 ميكرولتر من اكتمال المتوسط 1640 RPMI واحتضان لوحات لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية (عرقلة الخطوة).
- تغسل الصحون 5X مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X والحفاظ على آبار كاملة من برنامج تلفزيوني 1X حتى الخلايا جاهزة للمطلي.
3. تصفيح الخليوي وتحفيز
- إعداد عخلايا الدم وحيدات النوى eripheral (PBMC) من الإنسان عينات الدم الوريدي بواسطة الطرد المركزي على التدرجات Ficoll-Paque باستخدام الإجراءات القياسية. بدلا من ذلك، وذلك باستخدام الأساليب القياسية، ذوبان الجليد مأخوذة من PBMC المجمدة تحت النيتروجين السائل. بعد مشاركة الطرد المركزي، Resuspend الخلايا بتركيز نهائي من 2 × 10 6 خلية / مل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي في حاضنة سترة المياه.
- إزالة PBMC من الحاضنة و resuspend لهم في الحجم النهائي من 5 مل من المتوسط 1640 RPMI كاملة.
- احتضان PBMC بحضور 10 ميكرولتر من نوكلياز داخلية وراثيا من السراتية الذابلة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة قسامة 50 ميكرولتر من PBMC وتخلط مع 50 ميكرولتر من صبغة زرقاء التريبان. عد الخلايا وتقدير الجدوى٪ باستخدام haemocytometer والفحص المجهري (صبغ طريقة الاستبعاد). طرق مختلفة لالعد الآلي المحمولة وتقييم بقاء الخلية يمكن آللذلك يمكن استخدامها. PBMC ينبغي أن تكون> 95٪ قابلة للحياة. تجاهل عينة عندما الجدوى أقل من 95٪.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج PBMC لمدة 5 دقائق، طاف تجاهل، والخلايا resuspend في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (V / V) مصل الإنسان المعطل (HIS) بتركيز نهائي من 2 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على 37 درجة مئوية حتى يتم إضافة خليط من التحفيز لوحة.
- إضافة إلى الآبار، وقطرة واحدة في وقت واحد، و 100 ميكرولتر من خليط التحفيز المناسب. وينبغي استخدام ثلاثة مخاليط التحفيز كما هو موضح أدناه:
- استخدام AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (V / V) مصل الإنسان المعطل (IHS) سيطرة سلبية.
- استخدام الألغام المضادة للCD3 الأضداد وحيدة النسيلة (استنساخ OKT3) المخفف في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل مراقبة إيجابية ع).
- استخدام مستضد الفيروس النطاقي الحماقي، في شكل إما المشع γ (10،000 جراى و 30 دقيقة زمن التعرض) يعيش لقاح جدري الماء الموهن (وحدات تشكيل البلاك 1،350 [PFU] / مل) diluتيد 1:200 في AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS) أو 1 ميكروغرام من خليط متساوي المولية من 67 الببتيدات (15 مخلفات الأحماض الأمينية) توليفها على أساس تسلسل VZV المبكر على الفور (IE63) بروتين فسفوري؛ فسوبروتين . السيطرة فعالية التشعيع عن طريق رصد غياب علامات واضحة للآثار الاعتلال الخلوي بعد 4 أيام في الثقافات PBMC.
- إعداد جميع الآبار في مكررة.
- إضافة إلى الآبار، وقطرة واحدة في وقت واحد، و 100 ميكرولتر من الخلايا التي أعدت في الخطوة 5.4 إلى الآبار المناسبة. ينبغي أن يترك بئرين دون الخلايا (مراقبة سلبية). احتضان لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 الغلاف الجوي في حاضنة سترة المياه. لا يهز، نقل، أو كومة لوحات على رأس واحد آخر أثناء الحضانة.
4. تنمية بقعة وكشف
- تجاهل الخلايا وتغسل الصحون 10X مع برنامج تلفزيوني 1X تستكمل مع 0.05٪ (V / V) توين 20 (PBST). توين 20 يساعد فصل الخلايا التي انضمت إلى PVDF ليmbrane التالية الحضانة بين عشية وضحاها.
- باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 100 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل البيوتين مترافق الأضداد وحيدة النسيلة المضادة للالإنترفيرون γ (4S.B3 استنساخ) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.5٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA). احتضان لوحات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الآبار مع PBST 6X وإضافة كل بئر 100 ميكرولتر من streptavidin conjugatd مع الفوسفاتيز القلوية المخففة 1:1،000 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.5٪ (ث / ت) BSA. تغطية لوحات واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الصحون 3x أخرى مع PBST و 3X مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 100 ميكرولتر من الفوسفات 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl (BCIP) / نيترو الأزرق كلوريد نتروبلو (NBT) حل الركيزة واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الصحون تحت الماء الجاري المقطر. إزالة القسم السفلي من لوحة ELISPOT وغسل جانبي الغشاء مع الماء المقطر. الهواء الجاف لوحات.
- دراسة الآبار وتعداد البقع باستخدام د مجسمةالمجهر issection أو تفحص لوحات باستخدام عداد بقعة الآلي. الحفاظ على لوحات بعيدا عن الضوء إذا لم يتمكنوا من دراستها في نفس اليوم.
- متوسط عدد البقع تحسب في الآبار مكررة المقابلة وطرح عدد من النقاط المحتسبة في آبار المراقبة السلبية (أي الخلايا) من عدد من البقع تحسب في آبار الاختبار.
- التعبير عن إنتاج الإنترفيرون γ حيث بلغ عدد الوحدات المكونة للبقعة (SFU) في 10 6 PBMC.
- نعتبر أن عينات الاختبار إيجابية إذا كان عدد SFU هو> 50 في 10 6 PBMC و 2 الانحرافات المعيارية (SD) فوق سيطرة سلبية (خلايا + AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS).
- استخدام قيمة 400 SFU لكل بئر عند بقع عديدة جدا بحيث لا يمكن عدها.
- اختبار ما إذا كان يتم توزيع البيانات ELISPOT عادة أو باستخدام اختبار كولموجوروف-سميرنوف لا. عندما يتم توزيع البيانات عادة، نفذ المقارنات الإحصائية باستخدام ر الاحصائيين الطالبر (2 مجموعات) أو ANOVA وBonferroni بعد اختبار (مقارنات متعددة). إذا لم يتم توزيع البيانات عادة، استخدام اختبار مان ويتني U (2 مجموعات) أو اختبار كروسكال واليس وآخر اختبار دان (مقارنات متعددة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تطوير بروتوكول ELISPOT-γ IFN المفصلة أعلاه والأمثل في مختبرنا لقياس حجم ونوعية الخلية بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد جدري الماء 4. مصادر متنوعة من VZV المستضد يمكن استخدامها للخطوة التحفيز. وتشمل هذه: أ) المنظفات متوفرة تجاريا مقتطفات المعطل من VZV الخلايا المصابة فيرو 18؛ ب) برك من تداخل الببتيدات الاصطناعية من البروتينات المشفرة VZV محددة، بما في ذلك IE63 15 و 19 ORF4؛ ج) يعيش الموهن لقاح الحماق النطاقي 20؛ ود) والأشعة فوق البنفسجية الاستعدادات المعطل من VZV المستضدات من طاف من تعطيل الفيروس النطاقي الحماقي الخلايا المصابة لجنة نهر الميكونج 14. في حالتنا، ويفضل من التخفيفات الحية الموهنة لقاح جدري الماء على زراعة الخلايا المشتقة VZV من أجل ضمان الاتساق في مصدر المستضد وإعداد والثقافة للحد من التلاعب وسلالات الفيروس النطاقي الحماقي wildtype الحية في عملية إعداد سريرية حيث transmissio المستشفياتn هو مصدر قلق خطير 10. بالإضافة إلى ذلك، كان يفضل أشعة γ على تعطيل الأشعة فوق البنفسجية 21 بسبب الدقة النسبية التي جرعات الإشعاع γ يمكن تسليمها وأنه، على عكس الأشعة فوق البنفسجية، الأشعة γ اختراق بكفاءة مختومة تحتوي على الفيروس النطاقي الحماقي قارورة. تشعيع الأسهم الفيروسية أدى إلى تقديرات أعلى باستمرار من تواتر VZV الخلايا الإنترفيرون γ إنتاج محددة في عينات PBMC الحصول عليها من متبرع سليم على جميع التخفيفات من VZV مستضد اختبار (الشكل 1). ربما هذا هو نتيجة للتخفيف من الآثار الناجمة عن الاعتلال الخلوي الحية الموهنة VZV في خلية ثقافة.
لتحديد أي أسفرت عن تخفيف VZV مستضد قراءات القصوى من حيث أعداد SFU في 10 6 PBMC، تم إجراء الإنترفيرون γ ELISPOT باستخدام التخفيفات شقين من γ المشع لقاح جدري الماء حية موهنة وعينات تم الحصول عليها من PBMC مجموعة من الأطفال الذين تتراوح أعمارهم بين مناعيا بين 9 أشهر و 12 انتمARS الذين لديهم تاريخ وثقت من الحماق و / أو الأمصال إيجابية لجدري الماء (ن = 50). . تم تسجيل المواد الدراسية في عيادة الأمراض المعدية وعيادة المناعة الخاص CHU سانت جوستين بين يونيو 2007 وسبتمبر 2009 لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية بين متوسط الترددات من الخلايا المنتجة الإنترفيرون γ التي تم الحصول عليها باستخدام 1:200، 1: 400 و 1:800 التخفيفات من مستضد الفيروس النطاقي الحماقي (ع <0.0001، كروسكال واليس اختبار) (الشكل 2). وقد شكلت هذه الفوارق لمن قبل الفرق بين 1:200 التخفيف (متوسط = 115.0 SFU في 10 6 PBMC؛ الربيعي النطاق [الربعية] = 75،0-232،5 SFU في 10 6 PBMC) والتخفيف 1:800 (متوسط = 50.0 SFU في 10 6 PBMC؛ الربعية = 20،0-105،0 SFU في 10 6 PBMC)، وبين 1:400 التخفيف (متوسط = 92.5 SFU في 10 6 PBMC؛ الربعية = 52،5-177،5 SFU في 10 6 PBMC) و1:800 التخفيف (ع <0.001 و p (الشكل 2). لهذا السبب، والتخفيف من 1:200 γ المشع تم اختيار الحية الموهن لقاح جدري الماء للاستخدام في القياسات الروتينية لخلية معينة VZV بوساطة الاستجابات المناعية.
لتحديد ما إذا كان إنتاج الإنترفيرون γ يقيم في CD4 + و / أو CD8 + T مجموعات فرعية لمفاوية، وتعرض عينات PBMC الحصول عليها من متبرع سليم لنضوب CD4 + أو CD8 + الخلايا استخدام الألغام المضادة للCD4 أو CD8 الأضداد المضادة للجانب حبات مغناطيسية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. في التوافق مع التقارير المنشورة سابقا 22،23، أدى استنزاف CD4 + الخلايا في الحد من اللافت للنظر في الترددات من الخلايا المنتجة الإنترفيرون γ التي تم الحصول عليها باستخدام 1:100، 1:200 1:400 والتخفيفات من مستضد الفيروس النطاقي الحماقي، في حين استنفاد CD8 + الخلايا لم تؤد إلى مثل هذا الحد والسيطرة الإيجابيةق (التحفيز مع مكافحة CD3 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة) لم تتأثر بالمثل (الشكل 3). هذه النتائج تشير إلى أن الغالبية العظمى من الخلايا التي تنتج الإنترفيرون γ ردا على التحفيز مع مستضدات الفيروس النطاقي الحماقي هي خلايا CD4 + T. بدلا من ذلك، يمكن لهذه النتائج تنبع من استنزاف مستضد تقديم الخلايا CD4 + (أي وحيدات، والخلايا الجذعية) من تجمع PBMC، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات عرض VZV المستضدات إلى الرد CD8 + الخلايا اللمفية تي. من غير المرجح أن ساهمت في انحراف الاستجابة نحو CD4 هيمنة استخدام المشع VZV، تم الحصول على نتائج مماثلة من جانب الفئات الأخرى باستخدام تقنيات مختلفة ومصادر مستضد 14،21،22. ويرد مجهرية التكبير المنخفض الآبار ELISPOT ممثل في الشكل 4.
| المشكلة / القضية | الأسباب المحتملة | علاج / حل </ الدفتيريا> |
| عالية الخلفية / بقع محددة بشكل سيئ أو متموجة | أعداد كبيرة من الخلايا الميتة. | تقييم بقاء الخلية قبل الثقافة مجموعة المتابعة والتحفيز. |
| الغشاء عدم كفاية الخطوات قبل التبول. | للتأكد من احترام الوقت قبل التبول والتي بدورها الغشاء إلى الرمادي بعد 1 دقيقة. وينبغي إعداد 35٪ من الإيثانول مباشرة قبل الاستخدام. | |
| انتقل لوحات أثناء فترة الحضانة. | لا تتحرك لوحات لتجنب ضعف تحديد البقع الحلزون درب. | |
| غسل الخطوات. | دليل غسل هو أكثر كفاءة من لوحة غسالات. | |
| تشكيل المجاميع البروتين. | تحديد كل من التقاط وكشف الأجسام المضادة للحد من الخلفية والبقع إيجابية كاذبة. | |
| تركيز الأجسام المضادة الثانوية والكشف. | ضبط البيروكسيديز حد ذاتهcondary / كشف تركيز الأجسام المضادة للحد من الخلفية. | |
| الكواشف النامية الباردة. | جلب الركيزة إلى درجة حرارة الغرفة لتجنب التخلف. | |
| لا بقع / آبار فارغة | ضعف تحديد المواقع. | لا كومة لوحات أثناء فترة الحضانة لديها درجة حرارة متجانسة في الآبار المختلفة. |
| التحفيز الركيزة ليست مستعدة جيدا. | جعل قسامة خليط الببتيد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتجنب تشكيل الكريستال. | |
| التثاقل الخلية. | الخلايا resuspend في تعليق خلية واحدة لتجنب التقليل من الوحدات المكونة للبقعة. | |
| الخلايا لا تحفز بشكل مناسب. | استخدام المنشط بولكلونل كعنصر تحكم إيجابية. | |
| تثبيط انزيم رد فعل من قبل توين-20. | كانح لوحات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة BCIP / NBT حل الركيزة. | |
| أزواج الأضداد خاطئ. | تأكد من أن القبض والكشف عن الأجسام المضادة تتفاعل مع الحواتم مستضدي مختلفة. |
الجدول 1. المشاكل إضافية.
الشكل 1. تأثير γ-تشعيع الحية المعطل لقاح جدري الماء على وتيرة الإنترفيرون γ الخلايا المنتجة على النحو الذي تحدده باستخدام الإنترفيرون γ ELISPOT. VZV محددة تم تنفيذ ELISPOT-γ IFN كما هو موضح في إطار البروتوكول نص باستخدام PBMC من المتطوعين السيطرة و التخفيفات التسلسلي للγ المشع (10،000 غراي) يعيش لقاح جدري الماء موهن كما مستضد. تمثل بيانات متوسط قياس الأبعاد مكررةاليلة وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. PBMC: خلايا الدم المحيطية؛ SFU: بقعة تشكيل وحدات؛ VZV: فيروس الحماق النطاقي.
خلية معينة الشكل 2. الكمي لجدري الماء بوساطة الاستجابات المناعية عند الأطفال مع أدلة موثقة الإصابة السابقة مع الفيروس النطاقي الحماقي. VZV محددة تم تنفيذ ELISPOT-γ IFN كما هو موضح في إطار البروتوكول نص باستخدام PBMC معزولة عن المواضيع التي لها تاريخ في الحماق (ن = 50) والتخفيفات التسلسلي للγ المشع (10،000 غراي) يعيش لقاح جدري الماء موهن كما مستضد. خطوط أفقية تمثل الوسيط، وصناديق تمثل مجموعة الشرائح الربعية (الربعية)، وشعيرات تمثل مجموعة من القيم. PBMC: خلايا الدم المحيطية؛ SFU: بقعة تشكيل وحدات؛ VZV: الحماق النطاقي الفيروس .
أجريت الرقم 3. تأثير نضوب CD4 + أو CD8 + الخلايا على وتيرة الخلايا المنتجة الإنترفيرون γ مقاسا باستخدام الإنترفيرون γ ELISPOT. نضوب CD4 + أو CD8 + الخلايا وVZV محددة γ IFN ELISPOT كما هو موضح تحت نص البروتوكول باستخدام PBMC من المتطوعين السيطرة والتخفيفات التسلسلي للγ المشع (10،000 غراي) يعيش لقاح جدري الماء موهن كما مستضد. تمثل البيانات يعني القياسات المكررة وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. PBMC: خلايا الدم المحيطية؛ SFU: بقعة تشكيل وحدات؛ VZV: فيروس الحماق النطاقي.
load/51643/51643fig4highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
الشكل 4. الممثل الآبار ELISPOT. VZV محددة تم تنفيذ ELISPOT كما هو موضح في إطار البروتوكول نص باستخدام PBMC من خمسة متطوعين السيطرة والتخفيفات التسلسلي للγ المشع (10،000 غراي) يعيش لقاح جدري الماء موهن كما مستضد γ IFN. الصف الأول: ضوابط السلبية (AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS)؛ الصف الثاني: الضوابط الإيجابية (مكافحة CD3 الأجسام المضادة أحادية المنشأ)؛ الصف الثالث: VZV مستضد. الأرقام في الزوايا العليا تمثل في SFU كذلك قياسها باستخدام عداد بقعة الآلي. PBMC: خلايا الدم المحيطية؛ SFU: بقعة تشكيل وحدات؛ VZV: الحماق النطاقي الفيروس؛ IHS: المعطل مصل الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها: قد استخدمت المقايسات الإنترفيرون γ ELISPOT لدراسة الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الميكروبية، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) 24،25، فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) 26، 27، والمتفطرة السلية 28،29، وهذا غيض من فيض. نحن هنا وصف وضع ELISPOT مقايسة-γ IFN لقياس المناعة الخلوية ضد، على أمل تحديد يرتبط من VZV إعادة المناعي محددة في استعادة المتلقين UCBT الأطفال.
الخصائص الرئيسية لهذا الاختبار هي أربعة أضعاف. الأولى، أنها لا تتطلب التوسع في المختبر قبل الخلايا T، التي تستغرق وقتا طويلا. الثاني، فإنه لا يمكن أن يؤديها باستخدام عينات PBMC cryopreserved، الذي هو أفضل للحد من تقلب interassay. بالإضافة إلى ذلك، الحفظ بالتبريد والمعالجة المتوازية يتم تكييفها بشكل جيد لlongitudiنال الدراسات، والتي تتطلب أن العينات سيتم تجهيزها على دفعات. الثالثة، لمنع تراكمها الخلية التي واجهتها خلال ذوبان PBMC والعلاج مع نوكلياز داخلية عالى النقاء وراثيا من السراتية الذابلة تم استخدامه. التثاقل الخلية على الذوبان PBMC تحدث بشكل متكرر أكثر عند استخدام عينات الدم التي تم تركها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة قبل تجهيزها. ومن المعروف إدماج نوكلياز داخلية وراثيا من السراتية الذابلة لا تؤثر على بقاء الخلية، التعبير عن علامات سطح الخلية وردا على التحفيز مع مستضد وما شابه ذلك من حيث SFU منذ مستويات منخفضة من نوكلياز تستخدم ومدة التعرض قصيرة 22. وقد استخدم الرابع، γ المشع اللقاح الحي الموهن VZV لتحفيز PBMC. وكان يفضل على زراعة الخلايا المشتقة VZV من أجل ضمان الاتساق في جرعة المستضد وإعداد وللتغلب على الحاجة لمعالجة الحية VZV في وضع حيث سلامة المرضى والسريريةالعاملين في المختبرات هو مصدر قلق كبير. أخذت معا، وكان القصد من التعديلات التي أدخلت في فحص VZV-ELISPOT لجعله أكثر ملاءمة للاستخدام في بيئة السريرية.
ويلزم أساليب مباشرة، حساسة وقابلة للتكرار من أجل قياس الخلية المضيفة بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد المستضدات الجرثومية في سياق متابعة السريرية: القيود المفروضة على أهمية تقنية فيما يتعلق بأساليب القائمة. الإنترفيرون γ ELISPOT هو مقايسة قوية، واستنساخه وغنية بالمعلومات التي يمكن القيام بها على عينات الدم الوريدي باستخدام معدات منخفضة نسبيا التكنولوجيا (أجهزة الطرد المركزي، وحاضنات، مجهر تشريح). ومع ذلك، فإنه لا يسمح بسهولة كشف في وقت واحد من السيتوكينات متعددة وعلامات سطح الخلية. في المختبر فحوصات تكاثر الخلايا T التقليدية، التي استخدمت تقليديا لتعداد CD4 + و CD8 + مستضد specifiج استجابات الخلايا T، هي عمالة كثيفة، تفتقر إلى الحساسية وتميل إلى يعانون من درجة عالية من التباين interassay 30،31. من ناحية أخرى، اللمفاويات التائية السامة المقايسات (CTL) استنادا إلى تحلل الأهداف ذاتي محملة 51 ساعة معتمدة والحد من تحليل التخفيف تميل إلى الاعتماد على تستغرق وقتا طويلا في المختبر لتحديد الخطوات التوسع خلايا CD8 + T محددة مستضد التي تكون موجودة في انخفاض السلائف ترددات 32،33. تدفق المقايسات مقرها الخلوي التي تقيس إفراز السيتوكينات التالية التحفيز الأنتيجين (الخلايا تلطيخ خلوى [ICS]) ويمكن أيضا أن تستخدم ل34،35 تميز الاستجابات المناعية محددة مستضد. ICS تسمح بالكشف المتزامن لإنتاج السيتوكينات والتعبير سطح الخلية علامات المظهري في الخلايا واحد. حساسية ICS يقارن إلى أن من ELISPOT، ولكنه يتطلب أعداد أكبر من الخلايا 36،37. الأساليب التي تستخدم الصف الأول الفلورسنت أو الدرجة الثانية الببتيد أماهJOR معقدة التوافق النسيجي (PMHC) الأوليغومرات (tetramers PMHC) 38-40 هي دقيقة وتمكين توصيف multiparametric من اللمفاويات فرعية على أساس التعبير عن علامات سطح الخلية. ومع ذلك، PMHC tetramer تلطيخ يتطلب معرفة مسبقة من المرضى الكريات البيض البشرية مستضد (HLA) نوع، والتي يمكن أن تكون مرهقة وتحد من التحاق المريض في دراسة معينة. قيود أخرى من هذه التقنية هو أن PMHC tetramer تلطيخ يسمح المقام الأول الكشف عن خلايا T معربا متوسطة إلى عالية تقارب مستقبلات الخلايا التائية (TCR) 41. من ناحية أخرى، وخلايا CD8 + T معربا عن TCRS تقارب المنخفضة التي لم يتم الملون بواسطة tetramers PMHC يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام الإنترفيرون γ ELISPOT 41. بالإضافة إلى ذلك، يمكن tetramers PMHC ربط ما يسمى الخلايا الليمفاوية CD8 + استنفدت T التي تنتشر في الالتهابات الفيروسية المزمنة 42،43، وبالتالي انحراف التقييم الوظيفي للخلية معينة المستضد بوساطة الاستجابات المناعية. الاتحاد الدولي للسباحةLLY، PMHC tetramer تلطيخ وICS عادة ما تتطلب موظفين مدربين تدريبا عاليا والكواشف مكلفة نسبيا، وأدوات متطورة، ومرافق مخصصة، مما يجعل هذه التقنيات المعروف أن من الصعب تنفيذها في متابعة إعداد سريرية.
التطبيقات المستقبلية: لون ثنائي ELISPOT المقايسات قادرة على اكتشاف وقت واحد إنتاج كل من الإنترفيرون γ و IL-2 44 وأساليب fluorospot المزدوج والثلاثي الألوان 45 قد ولدت اهتماما كبيرا، لأنها تسمح بتقييم polyfunctionality من المستضد محددة T الخلايا الليمفاوية، التي هي سمة هامة من الخلايا كفاءة بوساطة الاستجابات المناعية 46.
يجب أن تعطى قضايا فنية إضافية دراسة متأنية: الخطوات الحاسمة في البروتوكول. لأن العديد من المتغيرات قد تؤثر على نوعية بقعة (أي حجم وكثافة) وخدرإيه، والانضمام إلى البروتوكول هو ضروري لتحقيق نتائج حساسة وقابلة للتكرار. استخدام ثابت من العلامات التجارية المحددة الاجسام المضادة (التقاط وكشف)، لوحات ELISPOT مع الأغشية PVDF، والايثانول 35٪ للعلاج غشاء قبل طلاء ذو أهمية عالية. على سبيل المثال، يمكن overtreatment مع الايثانول يؤثر على أداء الفحص والجودة الفور. لمنع الحصول على آبار مبهمة (أي> 300 البقع)، ونحن نوصي باستخدام ما لا يزيد عن 2 × 10 5 PBMC لكل بئر. عندما تواجه مع الترددات المنخفضة من خلايا تي محددة مستضد، ويمكن تعزيز حساسية الفحص من قبل prestimulating الخلايا في المختبر مع مستضد وما شابه ذلك أو توسيعها مع تفعيل بولكلونل مثل راصة دموية نباتية (PHA) لفترة محددة من الزمن (عادة 3-7 أيام) 38 . ومع ذلك، لا يتضمن الإجراء الأمثل النهائية للفحص VZV ELISPOT الواردة في هذه الوثيقة في prestimulation المختبر و / أو خطوات التوسع. عدد والنوعيهكان ذ بقع مماثلة على مجموعة من الحضانة 16-21 ساعة. بعد 21 ساعة من الحضانة، وكانت البقع غالبا ما تكون أكثر انتشارا والمتراكبة في بعض الأحيان، مما يجعل التعداد أكثر صعوبة. علاوة على ذلك، تتحرك الصفائح في حين أن الخلايا احتضان يمكن أن يؤدي إلى ضعف تحديد المواقع درب الحلزون التي هي أيضا أكثر صعوبة في العد. وتقدم العظة إضافية استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1.
عند استخدام عداد بقعة الآلي والحساسية وحجم البقعة النابضة يتم تعيين باستخدام السيطرة الايجابية (مكافحة CD3 الأجسام المضادة أحادية المنشأ) والسيطرة السلبية (AIM-V المتوسطة تستكمل مع 2٪ (ت / ت) IHS). الخصائص الهامة التي يجب مراعاتها أثناء التعداد هي بقعة حجم وشكل (الشكل 4). يسمح السابق واحد للتمييز T الخلية المستمدة من البقع خلوى من البقع الخلفية التي يجب أن يتم تجاهل. تقدم عدد بقعة وتقدير للتواتر VZV خلايا T معينة موجودة في PB نظراعينة MC، بينما حجم البقعة يعكس مدى الإنترفيرون γ التي تنتجها كل الخلايا الفردية.
على حد علمنا، وهذا هو الإنترفيرون γ-فقط طريقة ELISPOT الذي يجعل من استخدام γ المشع الحية الموهن لقاح جدري الماء كما مستضد 4. كما استخدمت لوحات من الببتيدات الاصطناعية متداخلة (15 السائدة) كما مستضد، بما في ذلك مزيج من الببتيدات على أساس تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين فسفوري؛ فسوبروتين VZV IE63. IE63 هو مناعة عالية 47 ويبدو أن العدوى الفيروسية حاسمة لوإنشاء الكمون 48. تم الكشف عن IE63 خلايا تي محددة في VZV صحية المانحين مصليا 15، مما يوحي بأن IE63 هو هدف هام من الخلية بوساطة الحصانة ضد الفيروس النطاقي الحماقي. ومع ذلك، تم العثور على الخلايا رد الفعل إلى حد كبير خلايا CD4 + T 15.
مقايسة VZV الإنترفيرون γ ELISPOT كانت تستخدم سابقا من قبل سمجموعة اور لتقييم استجابات الخلايا T محددة VZV في 28 طفلا خضعوا لعلاج اضطرابات UCBT الدم الأورام أو الموروثة 4. اقترح النتائج التي تم الحصول عليها خلال هذه الدراسة أن كلا من CD4 + و CD8 + T مجموعات فرعية الخلية متورطون في إنتاج الإنترفيرون γ وأن إعادة تشكيل السذاجة CD8 + الخلايا التائية مقصورة أدى إلى خلية معينة أكثر قوة VZV بوساطة الاستجابات المناعية في حيث الإنتاج الإنترفيرون γ. الأهم من ذلك، أظهرت هذه النتائج أيضا أن الكشف عن أكثر من 150 SFU في 10 6 PBMC كان يتفق مع T الخلية بوساطة الحماية ضد العدوى VZV أو تنشيط 4. ومع ذلك، هذه القيمة عتبة محددة VZV الخلية بوساطة الحصانة في سياق UCBT والتي تلت إعادة المناعي أو عدم وجودها لا بد من التحقق من صحتها في دراسات متعددة المراكز المحتملين أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر المشاركين في الدراسة وأولياء أمورهم. نود أيضا أن نشكر الدكتور Réjean ابونت (CHUM نوتردام، مونتريال، كندا) من أجل الوصول إلى القارئ له ELISPOT الدكتور LUBO الكسندروف للتحليل الإحصائي، ودينيس بليس، ساندرا كارون، سيلفي فالوا ومارتين لكاتي الخبراء التقنيين المساعدة. بدعم من المنح المقدمة من لو فون كوت عملية صب ليه PROJETS للبحوث كلينيك آخرون كوت دي évalution التقنيات (CHU سانت جوستين) إلى HS وPO، التي كتبها la مؤسسة مركز دي cancérologie شارل Bruneau ل، وجمعية سرطان الدم والاورام الليمفاوية من كندا. وأيد قوى الأمن الداخلي من خلال منح دراسية من مؤسسة لا CHU سانت جوستين ولو فون دي لا بحوث كيبيك-صحة (FRQS). كان AJG المستفيدة من المنح الدراسية من قسم علم الأحياء الدقيقة، علم المناعة وInfectiology، جامعة مونتريال (غابرييل ماركيز-منحة)، FRQS، والمعاهد الكندية للصحة Research (CIHR). وأيد NM كتبها la مؤسسة CHU سانت جوستين، ومؤسسة كول، وFRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
