Summary
דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).
Abstract
נגיף אבעבועות רוח זוסטר (VZV) הוא גורם משמעותי לתחלואה ותמותה לאחר השתלת דם טבורי (UCBT). מסיבה זו, טיפול מונע antiherpetic מנוהל באופן שיטתי לנמעני UCBT ילדים כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום VZV, אבל אין הסכמה שמגדירה את משך הזמן האופטימלי שלו חזקה, המבוסס על ראיות. בגלל חסינות תא בתיווך T היא אחראית על הבקרה של זיהום VZV, הערכה מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV הבא UCBT יכול לספק אינדיקציות באשר לשאלה האם יש לשמור טיפול מונע או יכול להיות שהופסק. לשם כך, assay אינטרפרון גמא הספציפי VZV (IFN-γ) Immunospot צמוד אנזים (ELISPOT) פותח כדי לאפיין ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מסוג T בתגובה לגירוי במבחנה עם חיסון VZV מוקרן חי מוחלש. assay זה מספק מדידה מהירה, לשחזור ורגישה של ג הספציפי VZVell תיווך חסינות מתאימה לניטור הכינון מחדש של חסינות ספציפית VZV בסביבה קלינית והערכת תגובה חיסונית לאנטיגנים VZV.
Introduction
בוצע לראשונה בשנת 1989, UCBT משמש יותר ויותר כחלק מהטיפול בהפרעות דם neoplastic וnonneoplastic שונות בילדים 1. VZV הוא alphaherpesvirus אדם cytopathic אשר גורם לשתי מחלות שונות, אבעבועות רוח (לאחר הדבקה ראשונית) והרפס זוסטר (לאחר הפעלה מחדש). בעקבות זיהום ראשוני, VZV נמשך לאורך כל חייו של המארח המוגן בתוך עצבי תחושה של גרעיני שורש הגבי. אחד הסיבוכים זיהומיות המאיימים ביותר הבאים UCBT קשור VZV 2-4. במרכז הקליני שלנו, בהעדר טיפול מונע VZV, ההיארעות המצטברת של מחלת VZV מחלה VZV לאחר 3 שנות postUCBT הייתה 46% 2. בחולים אלה, דה זיהום נובו עם או הפעלתו מחדש של VZV קשור לעתים קרובות עם הפצה קרביים למערכת העצבים המרכזית, ריאות וכבד 5-7. כטיפול מונע תוצאה מכך, acyclovir, valacyclovir או famciclovir מנוהל בדרך כלל UBמקבלי CT 8,9. עם זאת, אסטרטגיית טיפול זו אינה מביאה בחשבון את הפוטנציאל ההגנתי של לימפוציטים מסוג T או VZV ספציפי קינטיקה של הכינון מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV. בעיות פוטנציאליות הקשורים לשימוש המתרחב של טיפול מונע antiherpetic לטווח ארוך כוללות טיפול יתר) מטופל; ב) ההתפתחות של עמידות לתרופות אנטי 10,11; וג) ירידת ערך הכינון מחדש חיסוניים הספציפי VZV 12,13. בגלל זיהוי של לימפוציטים מסוג T הפונקציונלי VZV הספציפי בקורלציה עם הנוכחות של הגנה לטווח ארוך מפני זיהום VZV ותוצאה קלינית משופר 4,14,15, ניטור תגובות חיסוניים תא בתיווך המכוון נגד VZV במהלך התקופה לאחר ההשתלה עלול לגרום לשימוש מושכל יותר של נגיפים טיפול על ידי המאפשר רופאים כדי להבחין בין חולים שיפיקו תועלת מהטיפול מונע VZV מאלו שמערכת החיסון מסוגל לשלוט שכפול VZV 4,13.
Assay ELISPOT γ-IFN נעשה שימוש נרחב לתגובות החיסונית בתיווך תא ניטור במגוון רחב של מערכות ניסיוניות ומצבים רפואיים. כתמים נוצרים בעקבות המחשוף של מצע chromogenic, שהניבו משקע נראה לעין ויציב באתר של התגובה. כל נקודה בודדת ובכך מייצגת את טביעת הרגל של תא לייצור ציטוקינים בודד. IFN-γ ELISPOT מודד לא רק את היכולת של תאים בודדים vivo לשעבר לייצר IFN-γ בתגובה לגירוי במבחנה עם אנטיגן מאותו המקור, אבל זה גם מספק הערכה של התדירות מגיב תאים באוכלוסיית תא נתון 16,17. בנוסף לרגישות הגבוהה שלו, IFN-γ ELISPOT הוא פשוט לביצוע, מה שהופך את השימוש בו אפשרי בהקשר של פרוטוקולים קליניים אישית שמטרה מנחה ייזום או הפסקה של טיפול אנטי. המפורטים להלן ההליך describes assay ELISPOT כי היא תוכננה במיוחד כדי לזהות ולמדוד את ייצור IFN-γ על ידי תאי הדם היקפיים mononuclear בעקבות גירוי במבחנה עם אנטיגנים VZV נגזרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת המנהלים המוסדית אתיקה סקירה של CHU Sainte-ג'סטין, מונטריאול, קוויבק, קנדה, שבה נערך המחקר. הסכמה מדעת שבקשה וקיבלה מכל משתתפי המחקר, הוריהם או אפוטרופוסים חוקיים. כל ההליכים שבוצעו בימים 1 ו 2 חייבת להתבצע בתנאים סטריליים (כלומר תחת הזרימה למינרית). נהלי בטיחות סטנדרטיים לטיפול בדם אדם צריכים להקפיד.
1. ציפוי צלחות
- Permeabilize difluoride polyvinylidene קרומים (PVDF) בחלק התחתון של 96 גם צלחות ELISPOT הלבן Multiscreen IP על ידי הוספה היטב כל אחד 20 μl של 35% אתנול דקות 1. ממברנות צריכה להיות מעט שקופות.
- מייד לשטוף את הבארות 3 פעמים עם 200 μl של בופר פוספט 1x (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 HPO 4, 2 מ"מ KH 2 PO 4, pH 7.4) באמצעות מולtichannel פיפטה או מכשיר דומה. שלב זה הוא קריטי בהתחשב בכך ששאריות אתנול יכולות להשפיע על כדאיות תא והקשירה של נוגדן ללכוד. צלחות ELISPOT הן שבירות וצריכים להיות מטופל בזהירות: השימוש במכונת כביסה צלחת אוטומטית אינו מומלצת.
- מעיל הבארות עם 10 μl של נוגדן ללכוד IFN-γ אנטי אנושי בעכבר מטוהר בדילול מלא ב1x PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה את הצלחות עם ניילון נצמד רגיל ודגירת הלילה בשעה 4 ° C.
2. חסימת צלחות
- רוקן את הבארות, הקשה עליהם יבשים, ולשטוף צלחות 5 פעמים עם 200 μl של 1x PBS.
- מלא את הבארות עם 200 μl של מדיום RPMI 1640 מלא ודגירת צלחות לשעה 2 ב 37 ° C (חסימת צעד).
- שטוף את צלחות 5x עם 200 μl של 1x PBS ולשמור על הבארות מלאה של 1x PBS עד תאים מוכנים להיות מצופה.
3. נייד ציפוי וגירוי
- הכן pתאי eripheral מונונוקלארים דם (PBMC) מדגימות דם ורידי אדם על ידי צנטריפוגה במילויי Ficoll-Paque באמצעות נהלים סטנדרטיים. לחלופין, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות, להפשיר aliquots של PBMC קפוא תחת חנקן נוזלי. לאחר צנטריפוגה, תאי resuspend האחרונים בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ו דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 באטמוספרת חממת מעיל מים.
- הסר PBMC מן החממה וresuspend אותם בנפח סופי של 5 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא.
- דגירה PBMC בנוכחות 10 μl של endonuclease מהונדסת גנטי מmarcescens Serratia במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסרת aliquot 50 μl של PBMC ולערבב עם 50 μl של צבע הכחול trypan. ספירת תאים ולהעריך את הכדאיות% באמצעות haemocytometer ובדיקה מיקרוסקופית (שיטת הדרת צבע). שיטות אוטומטיות שונות לספירת תאים והערכה של אל פחית כדאיות תאכך לשמש. PBMC צריך להיות> 95% קיימא. בטל מדגם כאשר הכדאיות נמוכה מ95%.
- צנטריפוגה PBMC ב700 XG במשך 5 דקות, supernatant קלפים שנזרקו, ותאי resuspend במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (שלו) בריכוז סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. שמור על 37 ° C עד תערובות גירוי נוספות לצלחת.
- הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, מתערובת הגירוי המתאימה 100 μl. יש להשתמש בשלוש תערובות גירוי כמפורט להלן:
- בינוני השימוש AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (IHS) שליטה שלילית.
- השתמש בנוגדן אנטי CD3 חד שבטי (OKT3 שיבוט) בדילול מלא במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר שליטה חיובית).
- השתמש אנטיגן VZV, בצורה של שני מוקרן γ (10,000 Gy; זמן חשיפת 30 דקות) לחיות חיסון VZV מוחלש (יחידות 1,350 פלאק ויוצרים [PFU] / מיליליטר) diluטד 1:200 במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS) או 1 מיקרוגרם של תערובת equimolar של 67 פפטידים (15 שאריות חומצת אמינו) המסונתזת המבוסס על הרצף של VZV מייד מוקדם (phosphoprotein IE63) . לשלוט ביעילות על ידי ניטור קרינת העדר סימנים גלויים של תופעות cytopathic לאחר 4 ימים בתרבויות PBMC.
- הכן את כל הבארות בשני עותקים.
- הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, של תאים מוכנים בשלב 5.4 לבארות המתאימות 100 μl. יש להשאיר שתי בארות ללא תאים (בקרה שלילית). דגירה של 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 באטמוספרת חממת מעיל מים. אין לטלטל, להעביר, או ערימת הצלחות על גבי זו במהלך דגירה.
4. ספוט פיתוח ואיתור
- מחק את התאים ולשטוף את הצלחות 10x עם 1x PBS בתוספת 0.05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 מסייע לנתק את התאים שדבקו PVDFmbrane הבא דגירה הלילה.
- בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 0.5 מ"ג 100 μl / מיליליטר ביוטין מצומדות נוגדן חד שבטי אנטי IFN-γ (שיבוט 4S.B3) בדילול מלא ב1x PBS המכיל 0.5% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA). דגירה צלחות במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר.
- לשטוף את הבארות 6x עם PBST ולהוסיף גם כל conjugatd streptavidin 100 μl עם phosphatase אלקליין בדילול 1:1,000 ב 1x PBS המכיל 0.5% (w / v) ארגון ה-BSA. כסה את הצלחות ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- שטוף את הצלחות 3x עם PBST ו3x עם 1x PBS. הוספה של פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl (BCIP) / פתרון מצע כלוריד tetrazolium הכחול (NBT) ניטרו 100 μl ודגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- שטוף את הצלחות תחת זרם מים מזוקקים. הסר את החלק התחתון של צלחת ELISPOT ולשטוף את שני הצדדים של הקרום במים מזוקקים. אוויר יבש הצלחות.
- לבחון את הבארות ולמנות את הכתמים באמצעות ד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ issection או לסרוק את הצלחות באמצעות דלפק מקום אוטומטי. שמור על הצלחות במרחק של אור אם הם לא יכולים להיבחן באותו היום.
- ממוצע המספרים של כתמים נספרו בבארות כפולות מקבילה ולהחסיר את מספר הנקודות נספרו בבארות בקרה השליליות (אין תאים) ממספר הנקודות נספרו בבארות הבדיקה.
- להביע את ייצור IFN-γ כמו מספר היחידות להרכיב-spot (אוניברסיטת סן פרנסיסקו) לכל 10 6 PBMC.
- קח בחשבון שדגימות הבדיקה הן חיוביות, אם המספר של אוניברסיטת סן פרנסיסקו הוא> 50 ל10 PBMC 6 ו 2 סטיות תקן (SD) שמעל לפקד השלילי (בינוני + תאי AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS).
- השתמש בשווי של 400 אוניברסיטה סן פרנסיסקו לכל גם כאשר כתמים רבים מכדי לספור.
- בדוק אם נתוני ELISPOT מופצים בדרך כלל או לא באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב. כאשר נתונים בדרך כלל מופצים, לבצע השוואות סטטיסטיות באמצעות tes t של הסטודנטלא (2 קבוצות) או ניתוח שונה ולאחר בדיקת Bonferroni (השוואות מרובות). אם הנתונים אינם מתפלגים נורמלי, להשתמש במבחן מאן ויטני U (2 קבוצות) או במבחן קרוסקל-ארהב ולאחר המבחן של דאן (השוואות מרובות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול ELISPOT γ-IFN שפורט לעיל פותח ומותאם במעבדה שלנו כדי למדוד את הגודל והאיכות של תגובות תא בתיווך חיסונית המכוונות נגד VZV 4. מקורות שונים של אנטיגן VZV יכולים לשמש לשלב הגירוי. אלה כוללים: א) תמציות מומתים חומר ניקוי זמין מסחרי מVZV נגועים תאי Vero 18; ב) בריכות חופפות פפטידים סינטטיים מחלבונים ספציפיים VZV מקודד, כולל 15 IE63 וORF4 19; ג) חי חיסון אבעבועות רוח זוסטר מוחלש 20; וד) הכנות מומתים UV של VZV אנטיגנים מsupernatant של VZV שיבש נגועים תאי MRC 14. במקרה שלנו, דילולים של חיסון VZV נחלש לחיות הועדפו על תרבות תאים שמקורם בVZV כדי להבטיח אחידות במקור אנטיגן והכנה ולהגביל את התרבות ומניפולציה של זני VZV wildtype חיים בסביבה קלינית שבי transmissio nosocomialn הוא דאגה רצינית 10. בנוסף, קרינת γ הועדפה על איון UV 21 בגלל הדיוק ההשוואתי שבה מינוני קרינת γ יכול להיות מועבר וכי, שלא כמו UV, γ רנטגן ביעילות לחדור בקבוקונים אטומים VZV המכיל. הקרנה של מניות ויראלי הובילה להערכות באופן עקבי גבוהות יותר של התדרים של תאי VZV ספציפיים IFN-γ ייצור בדגימות PBMC המתקבלים מתורם בריא בכל דילולים של אנטיגן VZV נבדק (איור 1). זה אולי התוצאה של הפחתת השפעות cytopathic הנגרמות על ידי VZV נחלש לחיות בתרבית תאים.
כדי לקבוע איזו אנטיגן VZV הדילול הניב קריאות מקסימליים במונחים של מספרים של אוניברסיטת סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC, ELISPOT IFN-γ בוצע באמצעות דילולים כפול של γ מוקרן חיסון VZV-נחלש לחיות ודגימות PBMC המתקבלות מקבוצה של ילדים עם מערכת חיסון בגיל בין 9 חודשים ואתם 12ערס שהיה לו היסטוריה מתועדת של אבעבועות רוח ו / או סרולוגיה חיובית עבור VZV (n = 50). . משתתפי מחקר נרשמו במחלות זיהומיות קליניקה ומיוחדת אימונולוגיה קליניקה של CHU Sainte-Justine בין יוני 2007 וספטמבר 2009 הבדלים מובהקים נצפו בין תדרי חציון של תאים המייצרים IFN-γ שהתקבלו באמצעות 1:200, 1: 400 ו1:800 דילולים של אנטיגן VZV (p <0.0001, מבחן קרוסקל-ארהב) (איור 2). פערים אלו מוסברים על ידי ההבדל בין 1:200 הדילול (החציון = 115.0 אוניברסיטה סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC; רבעוני טווח [IQR] = 75.0-232.5 אוניברסיטה סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC) והדילול 1:800 (חציון = 50.0 אוניברסיטה סן פרנסיסקו לכל 10 6 PBMC; IQR = 20.0-105.0 האוניברסיטה סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC), ובין 1:400 הדילול (החציון = 92.5 אוניברסיטה סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC; IQR = 52.5-177.5 אוניברסיטת סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC) ו1:800 דילול (p <0.001 ו-p (איור 2). מסיבה זו, הדילול 1:200 של γ מוקרן חי מוחלש חיסון VZV נבחר לשימוש במדידות שגרתיות של מערכת החיסונית בתיווך תא הספציפי VZV.
כדי לקבוע אם ייצור IFN-γ מתגורר מסוג CD4 + ו / או CD8 + T תת הלימפוציטים, דגימות PBMC המתקבלות מתורם בריא היו נתונים לדלדול של CD4 + או CD8 + תאים באמצעות אנטי CD4 או חרוזים מגנטיים נוגדן בשילוב אנטי CD8 על פי הוראות היצרן. הקונקורדנציה עם דיווחים שפורסמו בעבר 22,23, דלדול של תאי CD4 + הביא לירידה בולטת בתדרים של תאים המייצרים IFN-γ שהתקבלו באמצעות 1:100, 1:200 ו1:400 דילולים של אנטיגן VZV, תוך דלדול של תאי CD8 + לא הוביל לכאלה צמצום ובקרה חיוביתs (גירוי עם נוגדנים חד שבטיים אנטי CD3) לא דומה מושפעת (איור 3). תוצאות אלו מצביעות על כך שהרוב המכריע של תאים המייצרים IFN-γ בתגובה לגירוי עם אנטיגנים VZV הם תאים מסוג CD4 + T. לחלופין, תוצאות אלו יכולה לנבוע מדלדול של תאים מסוג CD4 + הצגת אנטיגן (כלומר מונוציטים, תאים דנדריטיים) מבריכת PBMC, מה שמוביל לרמות נמוכות של מצגת של VZV אנטיגנים למגיב ימפוציטים CD8 + T. השימוש בVZV המוקרן לא סביר שתרם להטיה של התגובה לדומיננטיות מסוג CD4, תוצאות דומות התקבלו על ידי קבוצות אחרות תוך שימוש בטכניקות שונות ומקורות אנטיגן 14,21,22. מיקרוסקופ בהגדלה נמוך של בארות ELISPOT נציג מוצג באיור 4.
| בעיה / נושא | סיבות אפשריות | תרופה / פתרון </ Td> |
| רקע גבוה כתמים / גרוע מוגדרים או מחוברות | מספרים גבוהים של תאים מתים. | להעריך כדאיות תא לפני הגדרת התרבות וגירוי. |
| קרום לקוי צעדים מראש הרטבה. | הקפד לכבד את הזמן שלפני הרטבה ושתורו קרום לאפור לאחר דקות 1. 35% אתנול צריך להיות מוכן מייד לפני השימוש. | |
| צלחות עברו בתקופת הדגירה. | אל תזיזו צלחות, כדי למנוע כתמים גרועים מוגדרי שובל חילזון. | |
| שטוף את צעדים. | שטיפה ידנית היא יעילה יותר מאשר מנקי צלחת. | |
| כינונה של אגרגטים חלבון. | סנן גם נוגדני הלכידה וזיהוי כדי להפחית את הרקע ואת הנקודות חיוביות כוזבות. | |
| ריכוז נוגדנים משני וזיהוי. | התאם biotinylated seריכוז נוגדן condary / זיהוי כדי להפחית את הרקע. | |
| ריאגנטים פיתוח קרים. | להביא מצע לטמפרטורת חדר, כדי למנוע נחשלות. | |
| אין כתמים / בארות בלנק | מוגדר גרוע כתמים. | אל לערום צלחות במהלך תקופת דגירה יש טמפרטורה הומוגנית בבארות השונות. |
| מצע גירוי לא מוכן היטב. | להביא את aliquot תערובת פפטיד לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, כדי למנוע היווצרות גבישים. | |
| תא clumping. | Resuspend תאים לתוך השעיה תא בודד כדי להימנע מהערכה נמוכה מדי של יחידות יוצרים-spot. | |
| תאים לא מגורה כראוי. | השתמש activator polyclonal כביקורת חיובית. | |
| עיכוב של אנזים תגובה על ידי 20-טווין. | היהצלחות שעות עם PBS לפני הוספת פתרון מצע BCIP / NBT. | |
| זוגות נוגדנים הלא נכונים. | לוודא כי נוגדני הלכידה וזיהוי מגיבים עם אפיטופים אנטיגני שונים. |
טבלת 1. פתרון בעיות נוספות.
איור 1. השפעת γ-ההקרנה של חיסון VZV מומת בשידור חי בתדר של תאים המייצרים IFN-γ כפי שנקבעו באמצעות IFN-γ ELISPOT. VZV ספציפי ELISPOT γ-IFN בוצע כפי שתואר בטקסט באמצעות פרוטוקול PBMC מהתנדבות ושליטה דילולים סדרתי של γ מוקרן (10,000 Gy) לחיות חיסון VZV מוחלש כמו אנטיגן. הנתונים מייצגים את הממוצע של measureme הכפולNTS וברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. PBMC: תאי הדם היקפיים mononuclear; האוניברסיטה סן פרנסיסקו: במקום להרכיב יחידות; VZV: נגיף אבעבועות רוח זוסטר.
תא ספציפי איור 2. כימות של VZV בתיווך תגובות חיסוניים בילדים עם ראיות מתועדות של זיהום קודם עם VZV. VZV ספציפי ELISPOT γ-IFN בוצע כפי שתואר בטקסט באמצעות פרוטוקול PBMC מבודד מנבדקים עם היסטוריה של אבעבועות רוח (n = 50) ודילולי סדרתי של γ מוקרן (10,000 Gy) לחיות חיסון VZV מוחלש כמו אנטיגן. קווים אופקי מייצגים את החציון, תיבות מייצגות מגוון רבעוני (IQR), ושפם מייצג את טווח ערכים. PBMC: תאי הדם היקפיים mononuclear; האוניברסיטה סן פרנסיסקו: במקום להרכיב יחידות; VZV: נגיף אבעבועות רוח זוסטר .
איור 3. השפעת דלדול של CD4 + או CD8 + תאים בתדירות של תאים המייצרים IFN-γ, כפי שנמדד באמצעות IFN-γ ELISPOT. דלדול של CD4 + או CD8 + תאים וELISPOT γ-IFN הספציפי VZV בוצע כמתואר תחת טקסט פרוטוקול באמצעות PBMC מהתנדבות שליטה ודילולי סדרתי של γ מוקרן (10,000 Gy) לחיות חיסון VZV מוחלש כמו אנטיגן. הנתונים מייצגים את הממוצע של מדידות כפולות וברים שגיאה מייצג את שגיאת התקן של הממוצע. PBMC: תאי הדם היקפיים mononuclear; האוניברסיטה סן פרנסיסקו: במקום להרכיב יחידות; VZV: נגיף אבעבועות רוח זוסטר.
"Src =" load/51643/51643fig4highres.jpg / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
איור 4. בארות הנציג ELISPOT. VZV ספציפי ELISPOT בוצע כפי שתואר בטקסט באמצעות פרוטוקול PBMC מחמש מתנדב שליטה ודילולי סדרתי של γ מוקרן (10,000 Gy) לחיות חיסון VZV מוחלש כמו אנטיגן γ-IFN. שורה הראשונה: בקרות שליליות (בינוני AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS); שורה שנייה: בקרות חיוביות (אנטי CD3 נוגדנים חד שבטיים); שורה שלישית: אנטיגן VZV. מספרים בפינות העליונות מייצגים אוניברסיטה סן פרנסיסקו לכל טוב, כפי שנמדד באמצעות דלפק מקום אוטומטי. PBMC: תאי הדם היקפיים mononuclear; האוניברסיטה סן פרנסיסקו: במקום להרכיב יחידות; VZV: נגיף אבעבועות רוח זוסטר; IHS: מומת בסרום אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים ופתרון בעיות: מבחני IFN-γ ELISPOT שימשו כדי לבחון תגובות חיסונית בתיווך תא המכוון נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגנים, כוללים סוג וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) 24,25, וירוס הפטיטיס C (HCV) 26, 27, ושחפת Mycobacterium 28,29, רק כדי שם כמה. כאן אנו תיארתי את ההתפתחות של assay ELISPOT γ-IFN למדוד חסינות תאית נגד, עם התקווה של הגדרת קושרת של הכינון מחדש חיסוניים ספציפי VZV במתאושש מקבלי UCBT ילדים.
מאפיינים מרכזיים של assay זה הם פי ארבעה. ראשית, היא אינה דורשת הרחבה קודמת במבחנה של תאי T, אשר זה זמן רב. שנית, זה יכול להתבצע באמצעות דגימות PBMC cryopreserved, שהוא הטוב ביותר כדי למזער את שונות interassay. בנוסף, שימור בהקפאה ועיבוד מקביל היטב מותאמים לlongitudiמחקרי nal, אשר דורשים כי דגימות להיות מעובד בקבוצות. שלישית, כדי למנוע התקבצות תא נתקלה במהלך הפשרת PBMC, טיפול עם ultrapure endonuclease מהונדסת גנטי מmarcescens Serratia היה בשימוש. תא clumping על PBMC ההפשרה מתרחש בתדירות גבוהה יותר בעת שימוש בדגימות דם שנשארו הלילה בטמפרטורת חדר לפני העיבוד. השילוב של endonuclease מהונדסת גנטי מmarcescens Serratia ידוע לא להשפיע על כדאיויות תא, ביטוי של סמנים פני תא ותגובה לגירוי עם אנטיגן מאותו המקור במונחים של אוניברסיטת סן פרנסיסקו שכן רמות נמוכות של nuclease משמשים ומשך חשיפה קצר 22. רביעית, γ מוקרן חיסון VZV נחלש לחיות שימש כדי לעורר PBMC. זה היה עדיף על VZV נגזר תרבית תאים על מנת להבטיח אחידות במינון האנטיגן והכנה וכדי להתגבר על הצורך במניפולציה VZV החי בסביבה שבי את שלומם של חולים וקליניתאנשי מעבדה הוא דאגה העיקרית. יחדיו, השינויים שהוכנסו בassay VZV-ELISPOT נועדו כדי לעשות את זה טוב יותר מותאם לשימוש בסביבה קלינית.
מגבלות של טכניקת המשמעות ביחס לשיטות קיימות: שיטות פשוטה, רגישות ולשעתק נדרשות על מנת למדוד את תגובות תא מארח בתיווך חיסונית מכוונות נגד אנטיגנים של חיידקים בהקשר של מעקב קליני. IFN-γ ELISPOT הוא assay חזק, לשחזור ואינפורמטיבי שיכול להתבצע על דגימות דם ורידים תוך שימוש בציוד נמוך יחסית טק (צנטריפוגות, אינקובטורים, מיקרוסקופ לנתיחה). עם זאת, זה לא בקלות יאפשר זיהוי בו זמני של ציטוקינים מרובים וסמנים פני תא. מבחני חוץ גופייה מסורתיים T התפשטות תאים, אשר באופן קלאסי שימשו במשך הספירה של CD4 + ו CD8 + ספציפי אנטיגןתגובות תא ג T, הן עבודה אינטנסיבית, חסרות רגישות ונוטות לסבול מרמה גבוהה של 30,31 השתנות interassay. מצד השני, מבחני הלימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) המבוססים על תמוגה של מטרות עצמיים עמוסות 51 Cr וניתוח דילול מגביל נוטה לסמוך על הזמן רב במבחנה צעדי התרחבות לכמת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפיים שנמצאים ב מבשר נמוך תדרי 32,33. לזרום מבחני מבוססים cytometry המודדים הפרשת ציטוקינים בעקבות גירוי אנטיגני (מכתים תאיים ציטוקינים [ICS]) גם 34,35 יכולים לשמש כדי לאפיין את תגובה חיסונית לאנטיגן ספציפי. ICS מאפשר זיהוי בו זמני של ייצור ציטוקינים וביטוי בתא שטח של סמנים פנוטיפי בתאים בודדים. הרגישות של ICS משווה לזה של ELISPOT, אבל זה דורש מספר גדול יותר של תאים 36,37. שיטות שעושות שימוש בכיתת אני ניאון או בכיתה השנייה פפטיד-maמורכב histocompatibility יור oligomers (pMHC) (tetramers pMHC) 38-40 הם מדויקים ומאפשר אפיון של תת multiparametric הלימפוציטים המבוססים על ביטוי של סמנים פני תא. עם זאת, מכתים tetramer pMHC דורש ידע מוקדם של אנטיגן של החולים האנושיים ויקוציטים הסוג (HLA), אשר יכול להיות מסורבלת ומגביל את גיוס החולים למחקר נתון. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שמכתים tetramer pMHC בעיקר מאפשר זיהוי של תאי T מבטאים בינוני עד גבוהה זיקה קולטני תא T (TCR) 41. מצד השני, תאי CD8 + T להביע TCRs זיקה הנמוך שאינם מוכתמים על ידי tetramers pMHC ניתן לאתר בקלות באמצעות IFN-γ ELISPOT 41. בנוסף, tetramers pMHC יכול להיקשר שנקרא לימפוציטים מסוג CD8 + T מותשת הרווחות בזיהומים נגיפיים כרוניים 42,43, ובכך גרם להטיה בהערכה התפקודית של מערכת החיסונית בתיווך תא הספציפי אנטיגן. פינהlly, מכתים tetramer pMHC וICS בדרך כלל דורשים כוח אדם מיומן, ריאגנטים יקרים יחסית, מכשירים מתוחכמים, ומתקנים ייעודיים, מה שהופך את הטכניקות הללו ידועים לשמצה קשה ליישם בהגדרת מעקב קלינית.
יישומים עתידיים: צבע כפול מבחני ELISPOT מסוגלים בו זמנית גילוי הייצור של שני IFN-γ ו-IL-2 44 ושיטות fluorospot כפולה ומשולש בצבע 45 יצרו עניין משמעותי, מאחר שהם מאפשרים ההערכה של polyfunctionality של אנטיגן T הספציפי לימפוציטים, שהוא תכונה חשובה של מערכת החיסונית בתיווך תא יעיל 46.
שלבים קריטיים בפרוטוקול: בעיות טכניות נוספות יש לתת שיקול דעת מעמיק. בגלל משתנים רבים עשויים להשפיע על איכות מקום (גודל כלומר צפיפות) וחסר תחושהאה, דבקות בפרוטוקול הכרחית כדי להשיג תוצאות רגישות ושחזור. השימוש העקבי של מותגים ספציפיים של נוגדנים חד שבטיים (לכידה וזיהוי), צלחות ELISPOT עם ממברנות PVDF, ואתנול 35% לטיפול בקרום לפני הציפוי הוא בעל חשיבות גבוהה. לדוגמא, טיפול יתר עם אתנול יכול להשפיע על הביצועים של assay ואיכות מקום. כדי למנוע קבלת בארות אינפורמטיבי (כלומר> 300 כתמים), מומלץ להשתמש בלא יותר מ -2 x 10 5 PBMC לכל טוב. 38 כאשר הוא מתמודד עם תדרים נמוכים של תאי T ספציפיים לאנטיגן, רגישות assay יכולה להיות מוגברת על ידי תאי prestimulating במבחנה עם אנטיגן מאותו המקור או להרחיב אותם עם מפעילי polyclonal כגון phytohemagglutinin (PHA) לתקופה מוגדרת של זמן (בדרך כלל 3-7 ימים) . עם זאת, ההליך מותאם הסופי עבור assay VZV ELISPOT המוצג כאן אינו כולל בprestimulation מבחנה ו / או צעדי התרחבות. המספר וquality של נקודות היו דומה מעל טווח דגירה של 16-21 לשעה. מעבר 21 שעות של דגירה, כתמים היו לעתים קרובות יותר מפוזר ולעתים חופפים, מה שהופך לפקידתם קשה יותר. יתר על כן, העברת הצלחות תוך תאי דוגרים יכול להוביל לכתמי שובל חילזון מוגדרים היטב, כי הם גם יותר קשים לספור. רמזים נוספים לפתרון בעיות ניתנים בטבלה 1.
בעת השימוש בדלפק אוטומטי נקודה, רגישות וgating גודל נקודה נקבעים באמצעות בקרה חיובית (נוגדנים חד שבטיים אנטי CD3) ובקרה שלילית (בינוני AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS). המאפיינים חשובים להביא בחשבון בעת ספירת נקודה הם גודל וצורה (איור 4). לשעבר מאפשר להבחין כתמי תא T נגזרו ציטוקינים מכתמי רקע שצריך להתעלם ממנו. מספר ספוט מספק אומדן של התדירות של תאי T הספציפיים VZV הווה בPB נתןמדגם MC, בעוד גודל נקודה משקף כמה IFN-γ מופק על ידי כל תאים בודדים.
למיטב ידיעתנו, זוהי שיטת γ-IFN רק ELISPOT שעושה שימוש בγ מוקרן חי מוחלש חיסון VZV כאנטיגן 4. פנלים של פפטידים סינטטיים חופפים (15 מרס-) יש גם שימשו כאנטיגן, כולל תערובת של פפטידים המבוססים על רצף חומצות האמינו של phosphoprotein VZV IE63. IE63 הוא immunogenic 47 מאוד ונראה חיוני לinfectivity הנגיפי והקמת 48 חביון. תאי T ספציפיים IE63 זוהו בתורמים בריאים VZV נושא את ה HIV 15, אשר טוען כי IE63 הוא יעד חשוב של חסינות תא בתיווך המכוונת נגד VZV. עם זאת, תאים מגיבים נמצאו במידה רבה תאים מסוג CD4 + T 15.
Assay VZV IFN-γ ELISPOT שימש בעבר על ידי oקבוצת ur כדי להעריך את תגובות תא T הספציפיות VZV ב28 ילדים שעברו UCBT לטיפול בהפרעות בדם neoplastic או בירושה 4. תוצאות שהתקבלו במהלך מחקר זה הציעו כי הן מסוג CD4 + ותת תא CD8 + T היו מעורבות בייצור IFN-γ וכינון מחדש של תא תא CD8 + T הנאיבי הובילו לתגובות חיסונית בתיווך תא הספציפי VZV חזק יותר ב מונחים של ייצור IFN-γ. חשוב מכך, את התוצאות הללו גם הראו כי הגילוי של יותר מ 150 אוניברסיטה סן פרנסיסקו ל10 6 PBMC היה עולה בקנה אחד עם הגנה בתיווך תא T נגד זיהום VZV או הפעלתו מחדש 4. עם זאת, ערך סף זה לחסינות VZV תאים ספציפית בתיווך בהקשר של UCBT וכינון מחדש חיסוניים שהתפתח או היעדרה יצטרך להיות מאומת במחקרים רב מרכזיים פוטנציאליים גדולים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות משתתפי מחקר והוריהם. אנחנו רוצים גם להודות לד"ר Réjean לפוינט (צ'אם נוטרדאם, מונטריאול, קנדה) לגישה לקורא ELISPOT, ד"ר Lubo אלכסנדרוב לניתוח סטטיסטי, ודניס בלה, סנדרה קארון, סילבי ולואה ומרטין Caty למומחה טכני סיוע. נתמך על ידי מענקים ממבצע ד 'le Fonds לשפוך les projets דה המשוכלל ונדירות קליניק et d'évalution des טכנולוגיות (CHU Sainte-Justine) לHS וPO, על ידי la Fondation מרכז דה Cancerologie צ'ארלס-רונו, ועל ידי האגודה לוקמיה & לימפומה של קנדה. ISF נתמכה על ידי מלגות מla Fondation CHU Sainte-ג'סטין וle Fonds דה לה המשוכללת והנדירה du Québec-סנטה (FRQS). AJG היה זוכה במלגות מהמחלקה למיקרוביולוגיה, Infectiology ואימונולוגיה, אוניברסיטת מונטריאול (מלגת גבריאל-מרקיז), FRQS, והמכון הקנדי לבריאות המחקרesearch (CIHR). NM נתמכה על ידי la Fondation CHU Sainte-ג'סטין, קרן קול, וFRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
