Summary
Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).
Abstract
Varicela zoster (VZV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante de sangre de cordón umbilical (UCBT). Por esta razón, la profilaxis antiherpético se administra sistemáticamente a los destinatarios UCBT pediátricos para prevenir complicaciones asociadas con la infección por VZV, pero no existe un consenso fuerte, basada en la evidencia que define su duración óptima. Debido a inmunidad mediada por células T es responsable para el control de la infección por VZV, la evaluación de la reconstitución de respuestas de células T específicas de VZV siguiente UCBT podría proporcionar indicaciones en cuanto a si la profilaxis deben ser mantenidas o pueden ser interrumpidos. Para este fin, un interferón gamma específica de VZV (IFN-γ) inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) ensayo fue desarrollado para caracterizar la producción de IFN-γ por los linfocitos T en respuesta a la estimulación in vitro con la vacuna de VZV viva atenuada irradiado. Este ensayo proporciona una medición rápida, reproducible y sensible de VZV C específicaELL inmunidad adecuada para el seguimiento de la reconstitución de la inmunidad específica de VZV en un entorno clínico y la evaluación de la respuesta inmune a los antígenos de VZV mediada.
Introduction
Por primera vez en 1989, UCBT se utiliza cada vez más como parte del tratamiento de diversos trastornos de la sangre neoplásicas y no neoplásicas en niños 1. VZV es un herpesvirus alfa humana citopático que hace que dos enfermedades diferentes de la varicela, (después de la infección primaria) y el herpes zóster (después de la reactivación). Después de la infección primaria, el VZV persiste durante toda la vida del huésped protegida dentro de los nervios sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. Una de las complicaciones infecciosas más amenazantes siguientes UCBT se asocia con VZV 2-4. En nuestro centro clínico, en ausencia de profilaxis VZV, la incidencia acumulada de la enfermedad por VZV enfermedad VZV a los 3 años fue del 46% postUCBT 2. En estos pacientes, la infección de novo con o reactivación de VZV se asocia a menudo con la difusión visceral al sistema nervioso central, pulmones y el hígado 5-7. Como profilaxis resultado, aciclovir, valaciclovir o famciclovir se administra comúnmente UBDestinatarios CT 8,9. Sin embargo, esta estrategia de tratamiento no tiene en cuenta el potencial de protección de VZV linfocitos T específicos o la cinética de la reconstitución de las respuestas de células T específicas para VZV. Los problemas potenciales asociados con la expansión del uso de la profilaxis a largo plazo incluyen antiherpéticos a) sobretratamiento paciente; b) el desarrollo de resistencia a los medicamentos antivirales 10,11; y c) el deterioro de VZV reconstitución inmune específica 12,13. Dado que la detección de linfocitos T funcionales específicos de VZV se correlaciona con la presencia de la protección a largo plazo de la infección por VZV y el resultado clínico mejorado 4,14,15, el seguimiento de células mediada por las respuestas inmunes dirigidas contra VZV durante el período después del trasplante podría dar lugar a un uso más racional de antivirales tratamiento al permitir a los médicos a distinguir a los pacientes que se beneficiarían de VZV profilaxis de aquellos cuyo sistema inmunológico es capaz de controlar la replicación del VZV 4,13.
El ensayo ELISPOT de IFN-γ se utiliza ampliamente para las respuestas inmunes mediadas por células de vigilancia en una variedad de sistemas experimentales y las condiciones clínicas. Las manchas se generan después de la escisión de un sustrato cromogénico, la generación de un precipitado visible y estable en el sitio de la reacción. Cada foco de ese modo representa la huella de una célula productoras de citoquinas individuales. IFN-γ ELISPOT no sólo mide la capacidad de las células individuales ex vivo para producir IFN-γ en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno afín, sino que también proporciona una estimación de la frecuencia de responder las células en una población de células dada 16,17. Además de su alta sensibilidad, IFN-γ ELISPOT es sencillo de realizar, haciendo su uso posible en el contexto de protocolos clínicos personalizados destinados a guiar la iniciación o el cese del tratamiento antiviral. El procedimiento se detalla a continuación describiendoES un ensayo ELISPOT que está diseñado específicamente para detectar y medir la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica después de la estimulación in vitro con antígenos de VZV derivados.
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Protocol
Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canadá, donde se realizó el estudio. El consentimiento informado se solicitó y obtuvo de todos los participantes en el estudio, sus padres o tutores legales. Todos los procedimientos realizados en los días 1 y 2 deberán llevarse a cabo en condiciones estériles (es decir, bajo una campana de flujo laminar). Procedimientos de seguridad estándar para la manipulación de sangre humana deben ser estrictamente observados.
1. Recubrimiento de las placas
- Permeabilizar las difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en la parte inferior de 96 y placas de ELISPOT blanco MultiScreen IP mediante la adición a cada pocillo 20 l de etanol 35% durante 1 min. Las membranas deben hacerse ligeramente translúcida.
- Inmediatamente lavar los pocillos 3 veces con 200 l de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando un multichannel pipeta o un dispositivo similar. Este paso es fundamental, dado que los residuos de etanol pueden afectar la viabilidad celular y la unión del anticuerpo de captura. Placas ELISpot son frágiles y deben manejarse con cuidado: no se recomienda el uso de un lavador de placas automatizado.
- Recubrir los pocillos con 10 l de ratón purificada anticuerpo de captura de IFN-γ anti-humano diluido en 1x PBS a una concentración final de 10 mg / ml. Se cubren las placas con una envoltura de plástico normal y se incuba durante la noche a 4 ° C.
2. Placas de bloqueo
- Vaciar los pocillos, tocándolos seco, y lavar las placas 5 veces con 200 l de PBS 1x.
- Llenar los pocillos con 200 l de medio completo RPMI 1640 y se incuban las placas durante 2 horas a 37 ° C (el bloqueo de paso).
- Lavar las placas 5x con 200 l de 1x PBS y se mantienen los pozos llenos de 1x PBS hasta que las células están listas para ser chapada.
3. Plating celular y estimulación
- Preparar pcélulas mononucleares de sangre eripheral (PBMC) a partir de muestras de sangre venosa humana por centrifugación en gradientes de Ficoll-Paque utilizando procedimientos estándar. Por otra parte, el uso de métodos estándar, descongelar alícuotas de PBMC congelados en nitrógeno líquido. Después de los últimos centrifugación, las células se resuspenden a una concentración final de 2 x 10 6 células / ml y se incuba durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua.
- Eliminar PBMC de la incubadora y resuspender en un volumen final de 5 ml de medio RPMI 1640 completo.
- Incubar las PBMC en presencia de 10 l de endonucleasa de ingeniería genética a partir de Serratia marcescens durante 5 min a temperatura ambiente.
- Quitar una alícuota de 50 l de PBMC y mezclar con 50 l de colorante azul de tripano. Contar las células y estimar% de viabilidad usando un hemocitómetro y el examen microscópico (método de exclusión del colorante). Varios métodos automatizados para el recuento de células y la evaluación de la viabilidad celular puede colpor lo que se utilizará. PBMC debe ser> 95% viables. Desechar la muestra cuando la viabilidad es más baja que 95%.
- Centrífuga de PBMC a 700 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y volver a suspender las células en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (SU) a una concentración final de 2 x 10 6 células / ml. Mantener a 37 ° C hasta que se agreguen las mezclas de estimulación a la placa.
- Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de la mezcla de la estimulación apropiada. Tres mezclas de estimulación deben ser utilizados como se describe a continuación:
- Uso medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (IHS) como control negativo.
- Use anticuerpo anti-CD3 monoclonal (clon OKT3) diluido en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS a una concentración final de 0,5 mg / ml como control positivo).
- Utilice antígeno de VZV, en la forma de cualquiera de γ-irradiados (10.000 Gy; 30 min de tiempo de exposición) vivo atenuado de la vacuna de VZV (1350 unidades formadoras de placas [PFU] / ml) diluciónTed 1:200 en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS) o 1 g de una mezcla equimolar de 67 péptidos (15 residuos de aminoácidos) sintetizado basado en la secuencia de la VZV inmediatamente temprano (IE63) fosfoproteína . Controlar la eficacia de la irradiación mediante el control de la ausencia de signos visibles de efectos citopáticos después de 4 días en cultivos de PBMC.
- Preparar todos los pocillos por duplicado.
- Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de células preparadas en el paso 5.4 a los pocillos apropiados. Dos pozos deben dejarse sin células (control negativo). Incubar durante 20 horas a 37 º C en una atmósfera de CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua. No agitar, mover o colocar las placas en la parte superior de uno al otro durante la incubación.
4. Punto de Desarrollo y Detección
- Desechar las células y lavar las placas 10 veces con 1x PBS suplementado con 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ayuda a desprender las células que se han adherido a la PVDF mímbrane después de la incubación durante toda la noche.
- Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de 0,5 mg / ml de biotina conjugado anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ (clon 4S.B3) diluida en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA). Incubar las placas durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Lavar los pocillos 6x con PBST y añadir cada pocillo 100 l de conjugatd estreptavidina con fosfatasa alcalina diluido 1:1.000 en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de BSA. Cubrir las placas e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar las placas 3 veces con PBST y 3 veces con 1 × PBS. Añadir 100 l de un fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) solución de sustrato / cloruro de nitro azul tetrazolio (NBT) e incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Lave los platos bajo el chorro de agua destilada. Retire la sección inferior de la placa de ELISPOT y lavar ambos lados de la membrana con agua destilada. Secar las placas.
- Examinar los pozos y enumerar las manchas utilizando un d estereoscópicamicroscopio issection o escanear las placas utilizando un contador punto automatizada. Mantener las placas protegidas de la luz, si no pueden ser examinados en el mismo día.
- La media de los números de manchas contadas en pocillos duplicados correspondientes y restar el número de manchas contadas en los pocillos de control negativo (sin células) desde el número de manchas contadas en los pocillos de ensayo.
- Expresar la producción de IFN-γ como el número de unidades formadoras de puntos (SFU) por 10 6 PBMC.
- Tenga en cuenta que las muestras de la prueba son positivos si el número de SFU es> 50 por 10 6 PBMC y 2 desviaciones estándar (SD) por encima del control negativo (células + medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS).
- Utilice un valor de 400 SFU por pozo cuando las manchas son demasiado numerosos para ser contados.
- Comprobar si los datos ELISpot normalmente se distribuyen o no mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Cuando los datos se distribuyen normalmente, realizar comparaciones estadísticas mediante la t de Student test (2 grupos) o ANOVA y el post-test de Bonferroni (comparaciones múltiples). Si los datos no se distribuyen normalmente, utilice la prueba de Mann-Whitney U (2 grupos) o la prueba de Kruskal-Wallis y post-test de Dunn (comparaciones múltiples).
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Representative Results
El protocolo de ELISPOT de IFN-γ se detalla más arriba fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio para medir la magnitud y la calidad de las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra VZV 4. Diversas fuentes de antígeno de VZV se pueden utilizar para la etapa de estimulación. Estos incluyen: a) de detergente disponible comercialmente extractos inactivadas de VZV infectaron células Vero 18; b) piscinas de péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de VZV codificados específicos, incluyendo IE63 15 y el ORF4 19; c) la vacuna viva atenuada contra la varicela zoster 20; y d) las preparaciones inactivadas UV de VZV antígenos a partir del sobrenadante de células infectadas con VVZ interrumpido MRC 14. En nuestro caso, se prefieren las diluciones de vacuna viva atenuada de VZV sobre cultivo celular deriva de VZV con el fin de asegurar la uniformidad en la fuente de antígeno y la preparación y para limitar la cultura y la manipulación de las cepas de tipo salvaje de VZV vivos en un entorno clínico donde Transmissio nosocomialn es un problema grave 10. Además, se prefiere la irradiación γ sobre la inactivación UV 21 debido a la precisión comparativa con la que las dosis de radiación γ puede ser entregado y porque, a diferencia de los rayos UV, rayos γ penetrar eficazmente en viales sellados VVZ que contiene. La irradiación de las poblaciones virales llevó a estimaciones consistentemente más altos de la frecuencia de células específicas de VZV de IFN-γ que producen en muestras de PBMC obtenidas de un donante sano en todas las diluciones de antígeno de VZV probado (Figura 1). Esto es posiblemente el resultado de la mitigación de los efectos citopáticos inducidos por VZV viva atenuada en cultivo celular.
Para determinar qué antígeno de VZV dilución dio lecturas máximas en términos de números de SFU por 10 6 PBMC, IFN-γ ELISPOT se realizó utilizando diluciones de dos veces de γ-irradiado vacuna viva atenuada de VZV y muestras de PBMC obtiene a partir de un grupo de niños inmunocompetentes de edad entre 9 meses y 12 years, que tenía una historia documentada de varicela y / o serología positiva para VVZ (n = 50). . Los sujetos de estudio fueron matriculados en la Clínica de Enfermedades Infecciosas e Inmunología Clínica Especial del CHU Sainte-Justine entre junio de 2007 y septiembre de 2009 se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias medias de células productoras de IFN-γ que se obtuvieron mediante el 1:200, 1: 400 y 1:800 diluciones de antígeno VZV (p <0,0001, prueba de Kruskal-Wallis) (Figura 2). Estas disparidades se explican por la diferencia entre la dilución 1:200 (mediana = 115.0 SFU por 10 6 PBMC; rango intercuartil [IQR] = 75,0-232,5 SFU por 10 6 PBMC) y la dilución 1:800 (mediana = 50,0 SFU por 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU por 10 6 PBMC), y entre la dilución 1:400 (mediana = 92,5 SFU por 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU por 10 6 PBMC) y el 1:800 dilución (p <0,001 y p (Figura 2). Por esta razón, la dilución 1:200 de γ irradió vacuna viva atenuada de VZV fue seleccionado para su uso en las mediciones de rutina de células específicas de VZV respuestas inmunitarias mediadas.
Para determinar si la producción de IFN-γ reside en las células CD4 + y / o CD8 + T subconjuntos de linfocitos, muestras de PBMC obtenidas de un donante sano se sometieron a agotamiento de las células CD8 + CD4 + o utilizando anti-CD4 o anticuerpo acoplado perlas magnéticas anti-CD8 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En concordancia con los informes publicados previamente 22,23, el agotamiento de las células CD4 + se tradujo en una reducción notable en las frecuencias de células productoras de IFN-γ que se obtuvieron utilizando las 1:100, 1:200 y 1:400 diluciones de antígeno VZV, mientras que el agotamiento de las células CD8 + no condujo a una reducción tal y control positivos (de estimulación con anti-CD3 anticuerpo monoclonal) no se vieron afectados de manera similar (Figura 3). Estos resultados sugieren que la mayoría de las células que producen IFN-γ en respuesta a la estimulación con antígenos de VZV son las células T CD4 +. Alternativamente, estos resultados podrían derivarse de agotamiento de las células presentadoras de antígenos CD4 + (es decir, monocitos, células dendríticas) de la piscina de PBMC, que conduce a niveles reducidos de presentación de antígenos de VZV a respondedor linfocitos T CD8 +. Es poco probable que hayan contribuido a la inclinación de la respuesta hacia el dominio CD4 El uso de elementos combustibles irradiados VZV, resultados tan similares fueron obtenidos por otros grupos que utilizan diferentes técnicas y fuentes de antígenos 14,21,22. Un bajo micrografía ampliación de pozos ELISpot representativos se presenta en la Figura 4.
| Problema / cuestión | Las causas posibles | Remedy / solución </ Td> |
| Alto fondo / manchas mal definidas o confluentes | Los altos números de células muertas. | Evaluar la viabilidad de células antes del cultivo puesta a punto y la estimulación. |
| Membrana inadecuada pasos pre-humectación. | Asegúrese de respetar el tiempo de pre-humectación y que a su vez la membrana a gris después de 1 min. Etanol 35% debe prepararse inmediatamente antes de su uso. | |
| Las placas se movieron durante el período de incubación. | No mueva las placas para evitar puntos rastro del caracol mal definidos. | |
| Lavar pasos. | Manual de lavado es más eficiente que la lavadores de placas. | |
| Formación de agregados de proteínas. | Filtrar ambos anticuerpos de captura y detección para reducir el fondo y los puntos positivos falsos. | |
| Concentración de anticuerpo secundaria y detección. | Ajuste biotinilado síconcentración de anticuerpo cundaria / detección para reducir el fondo. | |
| Reactivos de desarrollar herpes. | Traiga sustrato a temperatura ambiente para evitar el subdesarrollo. | |
| No hay manchas / pozos en blanco | Manchas mal definidas. | No apile los platos durante el período de incubación para tener una temperatura homogénea en los diferentes pozos. |
| Estimulación sustrato no está bien preparado. | Llevar la alícuota de mezcla de péptido a temperatura ambiente durante 15 min para evitar la formación de cristales. | |
| Aglutinación celular. | Resuspender las células en suspensión de células individuales para evitar la subestimación de las unidades formadoras de puntos. | |
| Las células no estimuladas adecuadamente. | Utilice un activador policlonal como control positivo. | |
| La inhibición de la reacción de la enzima por el Tween-20. | Fueplacas h con PBS antes de la adición de la solución de sustrato BCIP / NBT. | |
| Pares de anticuerpos erróneos. | Asegúrese de que los anticuerpos de captura y detección reaccionan con diferentes epítopos antigénicos. |
Tabla 1. Solución de problemas adicionales.
Figura 1. Efecto de γ-irradiación de la vacuna de VZV inactivado en vivo en la frecuencia de células productoras de IFN-γ como se determina usando el IFN-γ ELISPOT. VVZ específica se realizó de IFN-γ ELISPOT como se describe en el Protocolo de texto usando PBMC de un voluntario de control y diluciones seriadas de γ irradiados (10.000 Gy) vacuna viva atenuada VZV como antígeno. Los datos representan la media de MeasureMe duplicadoNTS y las barras de error representan el error estándar de la media. PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: virus de la varicela zóster.
Figura 2. Cuantificación del VZV celular específica mediada respuestas inmunes en niños con evidencia documentada de la infección anterior con VVZ. VVZ específica se realizó de IFN-γ ELISPOT como se describe en el Protocolo de texto usando PBMC aislados de pacientes con una historia de varicela (n = 50) y diluciones seriadas de γ irradiados (10.000 Gy) vacuna viva atenuada VZV como antígeno. Las líneas horizontales representan la mediana, cajas representan rango intercuartil (IQR), con bigotes representan el rango de valores. PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SFU: detectar unidades formadoras; VVZ: virus de la varicela zoster .
Figura 3. Efecto de la depleción de células CD8 + CD4 + o en la frecuencia de células productoras de IFN-γ como se mide utilizando el IFN-γ ELISPOT. El agotamiento de células CD4 + o CD8 + células y de IFN-γ específica de VZV ELISPOT se realizaron como se describe en Protocolo de texto usando PBMC de un voluntario de control y diluciones seriadas de γ irradiados (10.000 Gy) vacuna viva atenuada VZV como antígeno. Los datos representan la media de mediciones por duplicado y las barras de error representan el error estándar de la media. PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SFU: detectar unidades formadoras; VZV: virus de la varicela zóster.
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Figura 4. Representante pozos ELISPOT. VVZ IFN-γ ELISPOT se realizó como se describe en el Protocolo de texto usando PBMC de cinco voluntarios de control y diluciones en serie de γ irradiados (10.000 Gy) vivo atenuado de la vacuna de VZV como antígeno específico. Primera fila: controles negativos (medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS); segunda fila: controles positivos (anti-CD3 anticuerpo monoclonal); tercera fila: antígeno VZV. Los números en las esquinas superiores representan SFU por pocillo como se mide utilizando un contador de punto automatizado. PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SFU: detectar unidades formadoras; VVZ: virus de la varicela zoster; IHS: suero humano inactivado.
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Discussion
Modificaciones y solución de problemas: los ensayos de IFN-γ ELISPOT se han utilizado para examinar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra una variedad de patógenos microbianos, incluyendo virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) 24,25, virus de la hepatitis C (VHC) 26, 27, y Mycobacterium tuberculosis 28,29, sólo para nombrar unos pocos. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo ELISPOT IFN-γ para medir la inmunidad celular contra, con la esperanza de definir correlatos de VZV reconstitución inmune específica en la recuperación de los beneficiarios UCBT pediátricos.
Las características principales de este ensayo son cuatro veces. En primer lugar, que no requiere la expansión previa in vitro de las células T, lo que consume tiempo. En segundo lugar, puede ser realizado usando muestras de PBMC criopreservados, que es mejor para minimizar la variabilidad interensayo. Además, la crioconservación y el procesamiento en paralelo están bien adaptados a longitudinalesestudios Nal, que requieren que las muestras se procesan en lotes. En tercer lugar, para evitar la aglutinación de células encontradas durante la descongelación de las PBMC, tratamiento con un ultrapura endonucleasa de ingeniería genética a partir de Serratia marcescens fue utilizado. Aglutinación celular tras la descongelación PBMC se produce con más frecuencia cuando se utilizan muestras de sangre que se quedan toda la noche a temperatura ambiente antes de su procesamiento. La incorporación de endonucleasa de ingeniería genética a partir de Serratia marcescens se conoce no afectar a la viabilidad celular, la expresión de marcadores de superficie celular y la respuesta a la estimulación con el antígeno cognado en términos de SFU desde los bajos niveles de nucleasa se utilizan y la duración de la exposición es corto 22. Vacuna de VZV viva atenuada En cuarto lugar, γ irradiado se utiliza para estimular PBMC. Se prefiere sobre cultivo de células de VZV derivado con el fin de asegurar la uniformidad en la dosis de antígeno y la preparación y para superar la necesidad de la manipulación de VZV vivo en un entorno clínico en el que la seguridad de los pacientes ypersonal de laboratorio es una preocupación importante. En su conjunto, las modificaciones que se introdujeron en el ensayo VZV-ELISpot pretendían hacerlo mejor adaptado para su uso en un entorno clínico.
Se requieren métodos directos, sensible y reproducible con el fin de medir las respuestas inmunes mediadas por la célula huésped dirigidos contra antígenos microbianos en el contexto de seguimiento clínico: Limitaciones de la importancia técnica con respecto a los métodos existentes. IFN-γ ELISPOT es un ensayo robusto, reproducible e informativo que se puede realizar en muestras de sangre venosa utilizando equipo relativamente baja tecnología (centrífugas, incubadoras, microscopio de disección). Sin embargo, no permite fácilmente la detección simultánea de múltiples citocinas y marcadores de la superficie celular. T in vitro ensayos tradicionales en la proliferación celular, que clásicamente se han utilizado para el recuento de CD4 + y CD8 + antígeno específicamenterespuestas de las células T c, son mano de obra intensiva, carecen de sensibilidad y tienden a sufrir de un alto grado de variabilidad interensayo 30,31. Por otro lado, los ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) basan en la lisis de dianas autólogas cargadas con 51Cr y análisis de dilución limitante tienden a depender de tiempo in vitro pasos de expansión para cuantificar las células T CD8 + específicas de antígeno que están presentes en una bajo precursor frecuencias 32,33. Ensayos basados en citometría de flujo que miden la secreción de citocinas después de la estimulación antigénica (la tinción intracelular de citoquinas [ICS]) 34,35 también se puede utilizar para caracterizar las respuestas inmunes específicas de antígeno. ICS permite la detección simultánea de la producción de citoquinas y la expresión de la superficie celular de marcadores fenotípicos en células individuales. La sensibilidad del ICS se compara con la de ELISPOT, pero requiere un mayor número de células 36,37. Los métodos que hacen uso de la clase I o de clase II fluorescente péptido-major complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) oligómeros (tetrámeros pMHC) 38-40 son precisos y permiten la caracterización multiparamétrico de subgrupos de linfocitos basado en la expresión de marcadores de superficie celular. Sin embargo, la tinción de tetrámero pMHC requiere conocimiento previo de antígeno leucocitario humano de los pacientes (HLA) tipo, que puede ser engorroso y limitar la inscripción de pacientes en un estudio dado. Otra limitación de esta técnica es que la tinción de tetrámeros de pMHC permite principalmente la detección de células T que expresan media-alta afinidad receptores de células T (TCR) 41. Por otro lado, las células T CD8 + que expresan TCR de baja afinidad que no están manchados por tetrámeros de pMHC se pueden detectar fácilmente usando IFN-γ ELISPOT 41. Además, tetrámeros pMHC se pueden unir a los llamados agotados linfocitos T CD8 + que son frecuentes en las infecciones virales crónicas 42,43, sesgando así la evaluación funcional de las células específicas de antígeno de las respuestas inmunes mediadas. Finally, la tinción de tetrámero pMHC e ICS típicamente requieren personal altamente capacitado, reactivos comparativamente caros, sofisticados instrumentos, y las instalaciones dedicadas, haciendo que estas técnicas muy difíciles de implementar en un seguimiento a la clínica.
Las aplicaciones futuras: ELISPOT de color dual capaces de detectar simultáneamente la producción de IFN-γ tanto e IL-2 44 y métodos FLUOROSPOT doble y triple de color 45 han generado un gran interés, ya que permiten la evaluación de la polifuncionalidad de antígeno específico de la T linfocitos, que es una característica importante de los teléfonos eficiente respuestas inmunes mediadas 46.
Los pasos críticos dentro del protocolo: cuestiones técnicas adicionales deben recibir una consideración cuidadosa. Debido a que muchas variables pueden afectar a la calidad del terreno (es decir, tamaño y densidad) y entumecidaer, el cumplimiento del protocolo es esencial para lograr resultados sensibles y reproducibles. El uso consistente de marcas específicas de anticuerpos monoclonales (de captura y de detección), placas de ELISPOT con membranas de PVDF, y etanol 35% para el tratamiento de la membrana antes del recubrimiento es de gran importancia. Por ejemplo, el tratamiento excesivo con etanol puede afectar al rendimiento del ensayo y la calidad del terreno. Para evitar que la obtención de los pozos poco informativos (es decir,> 300 puntos), se recomienda utilizar no más de 2 x 10 5 PBMC por pocillo. Cuando se enfrentan con bajas frecuencias de las células T específicas de antígeno, la sensibilidad del ensayo puede ser mejorada por las células prestimulating in vitro con antígeno afín o ampliar con activadores policlonales como fitohemaglutinina (PHA) por un período de tiempo determinado (normalmente 3-7 días) 38 . Sin embargo, el procedimiento optimizado final para el ensayo VZV ELISpot presenta en este documento no incluye en preestimulación vitro y / o etapas de expansión. Número y quality de las manchas fueron similares en un rango de incubación de 16 a 21 h. Más allá de 21 horas de incubación, las manchas eran a menudo más difusa ya veces se superponen, por lo que su enumeración sea más difícil. Por otra parte, moviendo las placas, mientras que las células están incubando puede resultar en puntos rastro del caracol mal definidos que son asimismo más difíciles de contar. Señales adicionales de solución de problemas se proporcionan en la Tabla 1.
Cuando se utiliza un contador de punto automatizado, sensibilidad y tamaño del punto de activación periódica se establecen utilizando control positivo (anticuerpo anti-CD3 monoclonal) y control negativo (medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS). Las características importantes a considerar durante la enumeración lugar son de tamaño y forma (Figura 4). El primero permite distinguir células T derivadas citocinas manchas de manchas de fondo que deben ser ignorados. Número contado proporciona una estimación de la frecuencia de células T específicas para VZV presentes en una determinada PBMuestra de MC, mientras que el tamaño del punto refleja la cantidad de IFN-γ producido por cada célula individual.
Hasta donde sabemos, este es el único método de IFN-γ ELISPOT que hace uso de γ irradiado vivos atenuados de la vacuna VZV como antígeno 4. Paneles de péptidos sintéticos solapantes (15-meros) también se han utilizado como antígeno, incluyendo mezcla de péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de la fosfoproteína de VZV IE63. IE63 es altamente inmunogénica 47 y parece ser crucial para la infectividad viral y el establecimiento de latencia 48. Células T específicas IE63 se han detectado en sanos seropositivos VZV donantes 15, lo que sugiere que IE63 es un objetivo importante de la inmunidad mediada por células dirigida contra el VZV. Sin embargo, se encontraron células reactivas a ser en gran medida las células T CD4 + 15.
El ensayo de VZV de IFN-γ ELISPOT fue utilizado anteriormente por Our grupo para evaluar las respuestas de células T específicas para VZV en 28 niños que se sometieron a UCBT para tratar trastornos de la sangre o neoplásicos hereditarios 4. Los resultados que se han obtenido durante el curso de este estudio sugieren que tanto CD4 + y subconjuntos de células T CD8 + estaban implicados en la producción de IFN-γ y que la reconstitución del compartimento de células T CD8 + vírgenes conducido a respuestas inmunes mediadas más robusto células específicas de VZV en términos de la producción de IFN-γ. Es importante destacar que estos resultados también mostraron que la detección de más de 150 SFU por 10 6 PBMC fue consistente con la protección mediada por células T contra la infección por VZV o reactivación 4. Sin embargo, este valor umbral para VZV celular inmunidad específica mediada por en el contexto de UCBT y la subsiguiente reconstitución inmune o la falta del mismo tendrá que ser validado en estudios prospectivos multicéntricos más grandes.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los participantes del estudio y sus padres. También nos gustaría dar las gracias a la Dra. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para el acceso a su lector ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para el análisis estadístico, y Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois y Martine Caty como experto técnico ayuda. Con el apoyo de subvenciones de Le Fonds d'opération pour les projets de recherche clinique et d'Evalution des tecnologías (CHU Sainte-Justine) a HS y PO, por la Fundación Centro de cancérologie Charles-Bruneau, y por la Sociedad de Leucemia y Linfoma de Canadá. ISF fue apoyado por becas de la Fundación CHU Sainte-Justine y le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG fue el destinatario de becas del Departamento de Microbiología, Infectología e Inmunología, Universidad de Montreal (Gabriel-Marqués de Becas), FRQS, y los Institutos Canadienses de Salud Iesearch (CIHR). NM fue apoyado por la Fundación CHU Sainte-Justine, la Fundación Cole y FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
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