Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר

doi: 10.3791/51654 Published: June 20, 2014
* These authors contributed equally

Abstract

דלקת שריר הלב היא דלקת של שריר הלב, אבל רק ~ 10% מביטויים אלו שנפגעו מופע קליניים של המחלה. כדי לחקור את האירועים חיסוניים של פציעות בשריר הלב, מודלים עכבר שונים של שריר הלב היו בשימוש נרחב. מחקר זה כלל דלקת שריר הלב אוטואימוניות ניסיונית (EAM) מושרה עם שרשרת שרירן כבדה לב (Myhc)-α 334-352 בעכברים / י; בעלי החיים המושפעים לפתח דלקת שריר הלב לימפוציטית אך ללא סימנים קליניים ברורים. במודל זה, השירות של מיקרוסקופיה בתהודה מגנטית (MRM) כשיטה לא פולשנית כדי לקבוע את השינויים מבניים ותפקודיים של הלב בבעלי חיים שחוסנו עם Myhc-α 334-352 מוצג. EAM ועכברים בריאים שצלמו באמצעות 9.4 T (400 MHz) 89 מ"מ סורק נשא ליבה אנכית מצוידים בבדיקה מרבה רגליים 4 סנטימטר בתדר רדיו הדמיה ו100 / שיפועים משולשים סנטימטר G ציר. תמונות לב נרכשו מבעלי החיים הרדים באמצעות רצף דופק קולנוע המבוסס על שיפוע הד, והאנימהls היה במעקב על ידי נשימה והדופק oximetry. הניתוח חשף עלייה בעובי הקיר של החדר בעכברי EAM, עם ירידה מקבילה בקוטר הפנימי של חדרי לב, בהשוואה לעכברים בריאים. הנתונים מראים כי שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים בלבם הדלקתי יכולים להיות הלא פולשני במעקב על ידי MRM בבעלי חיים. לסיכום, MRM מציע את יתרון של הערכת ההתקדמות ונסיגה של פציעות בשריר הלב במחלות הנגרמות על ידי חומרים מזהמים, כמו גם תגובה לטיפולים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אי ספיקת לב הוא הגורם המוביל למוות, ודלקת שריר הלב היא סיבה העיקרית אחת של אי ספיקת לב בקרב מתבגרים צעירים 1. רוב החולים שנפגעו בשריר לב יישארו ללא תסמינים והמחלה באופן ספונטני נפתרה 2. עם זאת, 10-20% מאלה שנפגעו יכולים לפתח מחלה כרונית, מה שמוביל לcardiomyopathy מורחב (DCM) 3. מודלים של בעלי חיים שונים פותחו כדי לחקור את היווצרות המחלה החיסונית של שריר הלב. המחלה יכולה להיגרם בדלקת שריר הלב, רגישה / J ועכברי BALB / ג על ידי חיסון החיות עם שרשרת שרירן כבדה לב (Myhc)-α או שברי פפטיד immunodominant או על ידי הדבקה עם פתוגנים כמו B3 coxsackievirus 4-9. מחקר זה כרוך Myhc-α דלקת שריר הלב הנגרם 334-352 בעכברים / י. למרות מראה חדירות שריר הלב, החיות מושפעות דלקת שריר הלב מופיעות קליני רגילות; אבחנה מתבססת על הערכה היסטולוגית של לב ל7 דלקתnd אקו 10.

מיקרוסקופיה תהודה מגנטית (MRM) היא שיטה נפוץ לקבלת הדמיה לב וכלי דם עם מטוסים תלת ממדים ברזולוציה גבוהה, המאפשרת הערכה של פרטים פונקציונליים לרמה של כלי דם דק (עד 10 מיקרומטר קוטר), אבל זה ברמה של פתרון הכוח היא לא בר השגה עם ההדמיה השגרתית תהודה מגנטית הליך (MRI) סריקה, שבו, ההחלטה מתקבלת בדרך כלל עד 1 מ"מ 11-14. MRM מציע יתרון כפי שהוא מאפשר רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה וגם לגזור פרמטרים ביצועים בנקודות הזמן המוקדמות של תהליך המחלה 14. מבחינה קלינית, ההדמיה MRM כבר מיושמת באופן נרחב כדי ללמוד את הפרמטרים תפקודיים של לב חולה, ריאות או המוח 15-17. במחקר זה, השימוש בטכניקת MRM ככלי לא פולשנית כדי לברר מומים לב בעכברים / J מושפעים עם דלקת שריר הלב אוטואימוניות מוצגת. באופן ספציפי, לאהוא ההדמיה MRM מאפשרת כימות של פרמטרים תפקודיים כגון חדר השמאלי (LV) קצה דיאסטולי מקטע פליטה של נפח ו( EF) עם דיוק סביר 18. ההגדרות של פרמטרים המתאימים הן: נפח סוף דיאסטולי LV, נפח דם בחדר השמאלי בסוף מחזור דיאסטולי, ומקטע פליטה, נפח פעימה / סוף דיאסטולי נפח. ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת המגזר זמינה באופן חופשי שפותחה עבור עיבוד תמונות DICOM תואם לב וכלי דם שנרכשו על ידי סורקי תהודה מגנטיים 19. נתוני המחקר מראה עלייה בעובי קיר LV בבעלי החיים myocarditic, המקביל לירידה בLV סוף דיאסטולי נפח, נפח פעימה ומקטע פליטה, בהשוואה לפרמטרים תפקודיים אלה בעכברים בריאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מסר של אתיקה:

נהלי כל החיה שנערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי אוניברסיטת נברסקה לינקולן, לינקולן, NE.

1. אינדוקציה של ניסויי אוטואימוניות דלקת שריר לב

  1. הכן את פתרון פפטיד על ידי המסת Myhc-α 334-352 בפוספט שנאגרו מלוח 1x לריכוז סופי של 2 mg/1.5 מיליליטר.
  2. הכן את רעלן השעלת (PT) על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1x PBS סטרילי לבקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של PT lyophilized להשיג ריכוז מניות של 50 ng / μl. קח 20 μl של המניה לתוך צינור מיליליטר סטרילי 1.5 ולהוסיף 980 μl של סטרילית 1x PBS להשיג ריכוז עבודה של ng / μl 1.
  3. הכן adjuvant של פרוינד המלא (CFA), על ידי הוספת 40 מ"ג Mycobacterium החפת H37Rv (MTB) לחלץ עד 10 מיליליטר של CFA כדי לקבל ריכוז סופי5 מ"ג / מיליליטר.
  4. הכן את תחליב פפטיד-CFA. הערה: לאינדוקצית EAM, תחליב פפטיד-CFA היה מנוהלת ב150 μl מכיל של Myhc-α 334-352 לכל חיה 100 מיקרוגרם. לדוגמה, כדי לחסן את עשרה עכברים להשתמש 1.5 מיליליטר של תחליב פפטיד-CFA המכיל 1 מ"ג של Myhc-α 334-352.
    1. כדי להכין 1.5 מיליליטר של תחליב, aliquot 750 μl של Myhc-α פתרון פפטיד 334-352 בצינור 1.5 מיליליטר אחד, וCFA השלימו עם MTB לעוד צינור 1.5 מיליליטר. באמצעות מזרק luer-Lok 3 מיליליטר, לצייר פתרון פפטיד הראשון, ואחריו את תמצית CFA / MTB.
    2. צרף את המזרק לברזלי 3 כיוונים ולחבר את השקע האחר של ברזלים למ"ל במזרק ריק 3. התאם את patency של ברזלים כך תערובת פפטיד-CFA זורמת ממזרק אחד למשנהו עם עמידות טובה באופן סביר.
    3. מערבבים על ידי דוחף את התוכן ממזרק אחד למשנהו שוב ושוב ל~ 1 דקות ולאחר מכן למקם את המכלול השלם על קרח ~ 3 דקות. חזור על פעולה זוהליך מינימאלי של 10x.
    4. לקבוע את העקביות של התחליב על ידי הצבת טיפה זעירה בזהירות על עדיין מים בכוס זכוכית מיליליטר 100. אגל לא צפוי להתפזר במים. אם כן, ממשיך לערבב עד לקבלת המרקם הרצויה.
    5. העבר את התוכן של תחליב מ3 מיליליטר מזרקים לתוך 1 מיליליטר המזרקים luer-Lok על ידי החלפה אחת משני המזרקים 3 מ"ל מצורפים לברזלים עם מזרק 1 מ"ל, ולצרף מחט 27 ½ G למזרק 1 מיליליטר.
  5. הזרק 150 μl של תחליב פפטיד-CFA בתת עורית במינון מפוצל בשני האזורים מפשעתי של נקבה שש עד שמונה שבועות בן עכברים / J (~ 75 μl כל אחד).
  6. ניהול של ההשעיה PT (100 ng) 100 μl intraperitoneally לכל חיה ביום 0 ויום 2 postimmunization.
  7. חזור על תהליך החיסון ביום 7 על ידי מתן 150 μl של תחליב פפטיד-CFA במינונים מפוצלים מתחת לעור לתוך שני צדי tהוא עצם החזה (~ 75 μl כל אחד). הכן תחליב זה טרי כאמור לעיל. לאחר מכן, ביום 21, להכפיף את בעלי החיים להדמית MRM, ראה שלב 3.

2. טיפול בבעלי חיים

  1. מניחים כל עכבר בתא אינדוקציה הרדמה המכיל 2% תערובת isoflurane באוויר עם כרית חימום ממוקמת מתחת לשמירת חום, ולהעביר את בעלי החיים לבעל חיים שתוכנן במיוחד (איור 1).
  2. לשתק את החיה במצב נוטה על בעל החיים ולכן החוטם שלה משתלב בחרטומו כדי לשמור על הרדמה (איור 1). לאבטח את הראש של העכבר עם ביס בר צמודים לשיניים הקדמיות של העכבר.
  3. הדלק את תנור מכת אוויר עם הצינור לשקעה הוכנס לשעם האנכי של הסורק כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך הניסוי.
  4. לשמור על הרדמה בisoflurane .5-2% בקצב זרימה של 2 מיליליטר / דקה במשך כל פגישת ההדמיה. לאשרהרדמה בשיטת קמצוץ הבוהן, אין תנועה צפויה.
  5. הגדר את חיישן פנאומטי כרית, חיישן הדופק oximetry סיבים אופטי זנב / קרסול עכבר, ובדיקת טמפרטורה רקטלית כדי לפקח על נשימה, קצב לב וטמפרטורת גוף, בהתאמה (איור 1). הערה: gating לב מתבצע באמצעות oximetry הדופק, המאפשר ניטור פולשני של רוויון חמצן בדם עורקים. החיישן הדופק oximetry צריך להיות מחובר לקרסול השמאל, וכף הרגל צריכה להיות מאובטח עם לולאת חוט והדביקה על מנת לשמור על הקרסול בחיישן. ההדמיה MRM מושגת על ידי gating הנשימה ואותות לב ללא שימוש בכל סוכנים בניגוד.

3. רכישת תמונה

  1. לאחר הכנת בעלי החיים (איור 1), מקם את העכבר במרכז סורק MRM עם הלב ממוקם במרכז שדה ראייה (FOV), שבו הומוגניות של שדה המגנטי היא מרבי. הערה: רחב נשא(89 מ"מ) 9.4 מגנט אנכי נשא T מצויד בשיפועים משולשים ציר 100 G / סנטימטר ו4 סנטימטר בתדר רדיו סליל הדמיה (RF) הוא לשמש כדי לקבל תמונות תלת ממדי (3D) ברזולוציה גבוהה. הערה: הקפד חומרים מתכלים שאינם מגנטיים בעת שימוש בסורק ה-MRI.
  2. הפעל את ממשק ההדמיה ובחר "מחקר חדש" מהתפריט "אפשרויות הלימוד". הקלד "mtune" בשורת הפקודה ולהפעיל אותו כדי למשוך את "Tune GUI". לאחר מכן בחר "התחל בדיקה Tune" ולחץ על כפתור "Autoscale". הניגון GUI ישתנה כדי להראות RFsignal. השתמש בכפתורי מנגינה / ההתאמה המרוחקים בקצה של הסליל לכוון את סליל RF לתדר התהודה של פרוטון (400 MHz). בכרטיסייה "התחל" לעבור לדף "Prescan" כדי להפעיל את כיול התדר ועוצמה על ידי לחיצה על הכפתורים בנושא. לחץ על הכפתור XYZ (מהיר) על "הכרטיסייה של" שים לימוד 'כרטיסייה למשוך את דף shimming.עבור לדף הפחית, בחר את כל החזרות, ולחץ על כפתור הפחית לבצע shimming האוטומטי.
  3. בחר רצף הסקאוט מהכרטיסייה "המחקר" של ממשק ההדמיה כדי למקם את לב העכבר. בכרטיסייה "לרכוש" לשנות את שדה הראייה ל35 מ"מ 2 ולשמור את הגדרות ברירת המחדל של המכשיר. לחץ על התחל כדי להפעיל את הרצף; להתאים את המיקום של בעל החיים אם הלב הוא לא במרכז שדה הראייה, retune סליל RF ולהשיג את תמונות הסקאוט שוב.
  4. לחץ על "אבני חן" כפתור הרצף בכרטיסייה "העיון" ולאחר מכן להזין את הפרמטרים הרכישה בכרטיסייה "לרכוש" המתאימה לקבלת שני מטוסים מאונך לאורך הציר הקצר וציר של הלב 20,21 ארוך. הערה: פרמטרים רכישה אופייניים לסריקת שיפוע הד הם: עובי פרוס, 1 מ"מ; זמן החזרה (TR), 200 אלפיות שניים; זמן הד (TE), 2.67 אלפיות שני (מינימום); זווית שנייה, 25 °; גודל inplane מטריקס, 128 x 128; FOV, מ"מ 222; מספר הרכישות, 4; וזמן רכישה משוער של 1 דקות ו30 שניות.
  5. בכרטיסייה "עו"ד" לבחור את הרצף "CINE" כדי לאסוף את תמונות הדופק מגודרת oximetry קצר ציר קולנוע MR על מנת למדוד פרמטרים אנטומיים ותפקודיים LV. להתאים את המיקום וזווית של פרוסות הדמיה המבוססת על תצוגת ציר זמן של הלב על ידי ריחוף עכבר וגרירה. הזן את הפרמטרים ההדמיה הבאים בכרטיסייה "לרכוש" כדי להשיג את רצף שיפוע הד קולנוע: TR, 500 אלפיות שניים; TE, 5 אלפיות שניים; FOV, 22 2 מ"מ; מטריקס רכישה, 256 x 256; עובי פרוס, 1 מ"מ; מספר הרכישות, 8; מספר המסגרות, 6; וזמן רכישת ~ 17V דקות. לחץ על התחל כדי להתחיל את הרכישה.
  6. להמיר את התמונות שנרכשו בפורמט DICOM באמצעות הכרטיסייה "I / O" של תוכנת ההדמיה ולהעביר את הקבצים המתאימים למרכז נתונים לעיבוד.
  7. בסופו של הליך הדמיה, כלow העכברים להתאושש מהרדמה בתוך כלובי מסנן העליון. אל תשאירו את העכברים ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה ולשמור אותם למחקרים נוספים במידת צורך.

4. ניתוח נתונים של הדמיה תהודה מגנטית מיקרוסקופית לב

  1. השתמש בתוכנת מגזר לנתח את הפרמטרים אנטומיים ותפקודיים של LV 19. על ידי טעינת תמונות Cine פורמט DICOM לתוך התוכנה באמצעות "פתח קובץ התמונה (ים)" תפריט המשנה של התפריט "קובץ". על GUI בחר 'MRGE' כטכניקת הדמיה, 'Cine' כסוג התמונה ו'קצר ציר אמצע חדרית-'כמטוס תצוגת תמונה.
  2. ציין טווחי הזמן כדי לשמש לקצה ירוויח וקצה התכווצות דרך "קבע זמן נוכחי לסיום תרוויח" ו" קבע זמן נוכחי לסיום התכווצות "תפריטי משנה של התפריט" ערוך ", בהתאמה.
  3. תחילה לחץ על לחצן הפקודה "LV" ולאחר מכן "אנדו" וחצני פקודה "EPI" בלוח ימני התחתון לצייר באופן ידני endocardium החדר השמאלי וepicardium בהתאמה. הסר את שרירי papillary על ידי להכות על כפתור הפקודה המתאים כדי להגביר את הדיוק של החישובים.
  4. קראו את הפרמטרים LV לכימות, כגון נפח הדיאסטולי, הסיסטולי נפח, נפח פעימה, ומקטע פליטה בלוח ימני העליון. לחץ על לחצן הפקודה "שונה" ולאחר מכן על לחצן הפקודה "מדידת Caliper" כדי למדוד את הפרמטרים LV כגון עובי דופן, וקוטר חדרית 22.
  5. לחץ על תפריט המשנה "שמור שניהם תמונה סטאקס ופילוח" של התפריט "קובץ" כדי לשמור את התמונות, כולל הפילוחים, בפורמט ". מחצלת 'לעבד מחדש את התמונות לפי צורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בדו"ח זה, השירות של טכניקת MRM כשיטה לא פולשנית כדי לקבוע את השינויים המבניים ותפקודיים בלבם של בעלי החיים מושפעים עם EAM מוצג. דלקת שריר הלב היה מושרה בעכברים / י על ידי חיסון החיות עם 334-352 Myhc-α ב -7 CFA, ובעלי החיים היו נתונים לניסויי MRM ביום 21 לאחר חיסון. ההדמיה MRM בוצעה על בעלי חיים תחת ההרדמה isoflurane ב9.4 T (400 MHz עבור פרוטונים) באמצעות מגנט אנכי נשא 89 מ"מ מצויד בשיפועים משולשים ציר (100 G / סנטימטר כוח מרבי). תמונת הסקאוט נרכשה לאתר ולמקם את לב העכבר במרכז שדה הראייה, ואחרי תמונות צירי להשיג 4 קאמרי הראייה ארוך ציר. הזווית שבה הלב היה צילמה במשך 2 הקאמרית התצוגה שמוצגת באיור 2 א. תמונות לב נרכשו באמצעות בדיקה הדמיה 4 סנטימטר מרבה רגליים RF עם רצף דופק קולנוע המבוסס על שיפוע הד. מדידת תפקוד לבurements (הדמיה: עובי קיר LV; פלט: LV סוף דיאסטולי נפח ומקטע פליטה) היו לאחר מכן נותח באמצעות תוכנת מגזר. מומים מבניים בלבם של עכברים מושפעים-EAM שמעידים עלייה בעובי LV על ידי כ 1.5 פי (p = 0.018) (איור 2 וטבלה 1), עם ירידה מקבילה בLV סוף דיאסטולי נפח [18.0 ± 4.2 μl לעומת . 37.5 ± 3.5 μl, איור 2C (i); p = 0.002] ומקטע פליטה [49.4 ± לעומת 2.3% 71.5 ± .6.0%, p = .00066; איור 2C (ii)], בהשוואה לעכברים בריאים. כצפוי, הערכה היסטולוגית של לב מmyocarditic, אבל לא בריא, עכברים הראו מחלחל הלימפוציטים multifocal, כפי שכבר הוכיחו בעבר 7; איור 2 ד). הנתונים מראים כי שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים בלב דלקתי יכולים להיות הלא פולשני במעקב על ידי i MRM n בעלי חיים.

איור 1
איור 1. הכנת בעלי חיים ומיצוב של בדיקות לרכישת תמונות MRM מלב העכבר. כדי לרכוש תמונות מהלב, העכבר הרדים ממוקם בבעל החיים שתוכנן במיוחד עבור ההדמיה MRM ומחובר לדוד המכה באוויר כדי לשמור על טמפרטורת גוף. תחת הרדמה רציפה, בעלי החיים הוא משותק במצב המועדים. כרית פנאומטי, חיישן oximetry סיבים אופטי וחיישן הטמפרטורה הקימו כדי לפקח על נשימה, דופק וטמפרטורת גוף, בהתאמה, עד לרכישת MRM של תמונות לב שלמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

page = "תמיד"> איור 2
איור 2. ההדמיה MRM של עכברים נגועים בדלקת שריר הלב אוטואימוניות מגלה מומים לב. דלקת שריר הלב היה מושרה בעכברים / י על ידי חיסון החיות עם Myhc-α 334-352 בCFA. בעלי החיים היו נתונים להדמית MRM ביום 21 postimmunization להעריך מומים לב. () קבוצה של חיתוך MRM. הזווית שבה הלב היה פרוס לרכישת תמונה מוצגת. הדמיה (B) MRM. פרוסות ציר קצר של לב נתפסו באמצעות רצף דופק קולנוע המבוסס על הד בשמונה מסגרות זמן עם TR של 500 אלפיות (TE, 5 אלפיות שנייה; זווית שנייה, 20 °; מספר הרכישות, 4; מטריצת רכישה, 256 x 256) .. תפוקת לב: [חצים עובי קיר LV] (C) תפוקת לב נמדדה בהתבסס על (i) LV סוף דיאסטולי נפח וכן (ii) מקטע פליטה בעכברים בריאים וmyocarditic uלשיר ניתוח תמונה רפואי כמותית עם תוכנת מגזר. ערכי SEM ממוצע עבור קבוצה של עכברים מוצגים (n = 2 עד 5 בכל קבוצה). (ד ') היסטולוגיה. לבבות מקבוצות הטיפול הנ"ל הוערכו על ידי דלקת hematoxylin ומכתים eosin. חוגים:. חדירות לימפוציטית multifocal אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעלי חיים בריא (n = 3) EAM (n = 5)
1 מאוס 1.03 1.48
עכבר 2 1.3 1.59
עכבר 3 0.94 1.44
4 מאוס 2.11
עכבר 5 1.92
ממוצע ± SEM 1.71 ± 0.1

טבלת 1. השוואה של חדר שמאל עובי קיר (LV) בין דלקת שריר הלב אוטואימוניות בריאה וניסוי עכברים (EAM). שלוש הדמיה בריאה וחמישה עכברים מושרה EAM היו נתונים למיקרוסקופיה בתהודה מגנטית (MRM) בpostimmunization 21 היום. לאחר שרכש את תמונות לב על ידי MRM, עובי קיר LV נמדד באמצעות תוכנת מגזר כפי שתואר בפרוטוקול. הערכים המוצגים בטבלה מייצגים עובי קיר LV במ"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקר זה מתאר את הליך MRM והשירות שלה ככלי לא פולשנית כדי לברר מומים לב בעכברים נגועים בדלקת שריר הלב אוטואימוניות. מאז התכונות היסטולוגית של EAM להידמות דלקת שריר הלב postinfectious של בני אדם, מודלים עכבר הם בדרך כלל מועסקים על מנת להתוות את מנגנוני החיסון של פציעות שריר הלב 23-25. עם זאת, בעלי החיים נגועים בדלקת שריר הלב מופיעים קליני רגילים, והאבחנה נעשית על סמך היסטולוגיה בסיום הניסויים 7. החיות בדרך כלל מוקרבות על יום 21 postimmunization. הערכת תהליך המחלה בדרך זו בפעם מצביעה גבולות שימוש במודלים אלה, במיוחד במחקר תרופות, שבו מעקב אחר התקדמות מחלה בתגובה לטיפולים הוא דרישה קריטית.

כדי לברר מומים לב בבעלי חי חיים, שימוש בשיטות בלתי פולשני כמו MRM הוא מועילה. טכניקת MRM שתואר כאןמציע את יתרון של קבלת המאפיינים המבניים ותפקודיים של לב, ללא צורך בשימוש בחומרי ניגוד. עם זאת, טכניקה זו דורשת רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה אנטומיים 3D בשדות מגנטיים חזקים. עם זאת, ברגע שהתמונות שנרכשו, ניתן לנתח פרמטרים תפקודיים כגון כרכי סוף דיאסטולי LV ושברים פליטה מאוחר יותר באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי, ללא הצורך להרכיב את מנגנון MRM נוסף. כפי שניתן לראות בתרשים 2, בדיקת MRM של בעלי חיים שחוסנו עם Myhc-α 334-352 עובי קיר LV מתגלה להיות גדול יותר מאשר בעכברים בריאים (איור 2), עם ירידה מקבילה בתפוקות תפקודיות (כרכי סוף דיאסטולי LV ושברים פליטה ; איור 2 ג). כצפוי, לב ממחוסן, אבל לא בריא, לא היו לי חיות מחלחל דלקתי (איור 2 ד). לפיכך, ממצאים מטכניקת MRM וcor היסטולוגיהroborate אחד את השני.

עם זאת, כדי להשיג תוצאות לשחזור על ידי MRM, שלושה הגורמים הבאים שצריכים לטפל. (א) בעלי חיים צריכים להיות ממוקמים בסורק MRM כך לב ממוקמים במרכז המגנט לחשוף אותם לשדה המגנטי עם ההומוגניות מקסימלי. (ב) חפץ תנועה הוא דאגה בניסויים בבעלי חיים בשידור חי. כדי להפחית טשטוש תמונה בשל נשימה ותנועות לב, דופק oximetry וrespirometry שימשו לMRM שער רכישה, כלומר, לרכוש אותות תמונה בדידים בנקודות זמן ספציפיות בדרכי הנשימה ומחזורי שלב נדרשו השימוש במערכת ניטור בעלי החיים . (ג) רכישת ברזולוציה גבוהה תמונות לב 3D היא דרישה קריטית כדי לאפשר ניתוח מפורט של מומים לב. כדי להשיג תמונות בכל שלושת הממדים, וכדי להגדיל את יחס אות לרעש, חשוב לתכנן סלילי הדמיה רגישים יותר ספציפיים לMRM המאפשרים מדויק וcomלכידת plete של תמונות בשדות מגנטיים חזקים בכיוון קצר ציר בתוך הסורקים של בעלי החיים.

לסיכום, פיתוח של טכניקת MRM להעריך מומים לב בבעלי חיים הוא מאתגר. זה נכון במיוחד עבור עכברים, בגלל גודלם הקטן יותר לב (~ 1/2, 000 ההמוני של לב אנושי) ושיעור גבוה יותר לב (~ 600 פעימות לדקה), בהשוואה לבני אדם 26. יחד עם זאת, ברגע שפותח ומאומתים, טכניקת MRM ניתן להשתמש כדי להשוות את השינויים האנטומיים ותפקודיים של לב בין בעלי חיים בריאים וחולים. לכן, שיטת MRM יכולה לשמש ככלי רב ערך, לא פולשנית כדי להעריך את התקדמות האורך של פתולוגיות לבביות דלקתיות הקשורים לשני את האופי האקוטי וכרוני של תהליך המחלה, ולעקוב אחר תגובות לטיפולים בחי חיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB H37Rv extract Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Isoflurane Piramal Healthcare, Mumbai, India NDC66794-013-25
Female A/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Luer-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Luer-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Protouch Stockinette Medline Industries, Mundelein, IL 30-1001
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, 
ThermiPAQ hot and cold therapy system  Theramics Corporation, Springfield, IL
Reptile heating lamp Energy Savers Unlimited, Inc. Carson, CA
3M Transpore tapes Target Corporation, MN
Up and Up Polymyxin B sulfate/Bacitracin/Neomycin sulfate antibiotic ointment Target Corporation, MN
North Safety DeciDamp-2PVC foam ear plugs North Safety Products, Smithfield, RI
Cotton tipped applicator, 6’’ wooden stem  Jorgensen Laboratories, Inc. Loveland, CO
Anesthesia induction chamber  Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Summit Anesthesia Support system for regulating flow of anesthesia  Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI
Specially designed animal holder Agilent Technologies, Santa Clara, CA
Bickford Omnicon F/Air anesthesia gas filter unit  A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY
Pulse-oximeter module, MR compatible small animal monitoring and gating system  Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Oxygen cylinder  Matheson-Tri Gas, North-Central Zone, Lincoln, NE
Gas regulator  Western Medica, West Lake, OH
Signal breaking module, MR compatible small animal monitoring and gating system Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore MR scanner Agilent Technologies, Santa Clara, CA
4 cm millipede micro-imaging RF coil Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SAM PC monitor Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY
Quantitative Medical Image analysis software http://segment.heiberg.se;  Segment v1.8 R1430,  Medviso, Oresunds region, Sweden
Matlab software The Mathworks, Inc.  Natick, MA
Computer-Unix operating system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123, (8), 933-944 (2011).
  2. Fujinami, R. S., et al. Molecular mimicry, bystander activation, or viral persistence: infections and autoimmune disease. Clin Microbiol Rev. 19, (1), 80-94 (2006).
  3. Cihakova, D., Rose, N. R. Pathogenesis of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Adv Immunol. 99, 95-114 (2008).
  4. Donermeyer, D. L., et al. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182, (5), 1291-1300 (1995).
  5. Gangaplara, A., et al. Coxsackievirus B3 infection leads to the generation of cardiac myosin heavy chain-alpha-reactive CD4 T cells in A/J mice. Clin Immunol. 144, (3), 237-249 (2012).
  6. Huber, S. A., Lodge, P. A. Coxsackievirus B-3 myocarditis in Balb/c mice. Evidence for autoimmunity to myocyte antigens. Am J Pathol. 116, (1), 21-29 (1984).
  7. Massilamany, C., et al. Identification of novel mimicry epitopes for cardiac myosin heavy chain-alpha that induce autoimmune myocarditis in A/J mice. Cell Immunol. 271, 438-449 (2011).
  8. Pummerer, C. L., et al. Identification of cardiac myosin peptides capable of inducing autoimmune myocarditis in BALB/c mice. J Clin Invest. 97, (9), 2057-2062 (1996).
  9. Rose, N. R., Hill, S. L. The pathogenesis of postinfectious myocarditis. Clin Immunol Immunopathol. 80, (1996).
  10. Saraste, A., et al. Coronary flow reserve and heart failure in experimental coxsackievirus myocarditis. A transthoracic Doppler echocardiography study. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, (2006).
  11. Altes, T. A., et al. Hyperpolarized 3He MR lung ventilation imaging in asthmatics: preliminary findings. J Magn Reson Imaging. 13, (3), 378-384 (2001).
  12. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49, (1), 35-53 (2008).
  13. Smith, B. R. Magnetic resonance microscopy with cardiovascular applications. Trends Cardiovasc Med. 6, (8), 247-254 (1996).
  14. Potter, K. Magnetic resonance microscopy approaches to molecular imaging: sensitivity vs specificity. J Cell Biochem Suppl. 39, 147-153 (2002).
  15. Benveniste, H., Blackband, S. MR microscopy and high resolution small animal MRI: applications in neuroscience research. Prog Neurobiol. 67, 393-420 (2002).
  16. Epstein, F. H., et al. MR tagging early after myocardial infarction in mice demonstrates contractile dysfunction in adjacent and remote regions. Magn Reson Med. 48, (2), 399-403 (2002).
  17. Gewalt, S. L., et al. MR microscopy of the rat lung using projection reconstruction. Magn Reson Med. 29, (1), 99-106 (1993).
  18. Kern, M. J. The cardiac catheterization handbook., Edn 5th. (2011).
  19. Heiberg, E., et al. Design and validation of Segment--freely available software for cardiovascular image analysis. BMC Med Imaging. 10, (2010).
  20. Cranney, G. B., et al. Left ventricular volume measurement using cardiac axis nuclear magnetic resonance imaging. Validation by calibrated ventricular angiography. Circulation. 82, (1), 154-163 (1990).
  21. Hiba, B., et al. Cardiac and respiratory double self-gated cine MRI in the mouse at 7 T. Magn Reson Med. 55, (3), 506-513 (2006).
  22. Bryant, D., et al. Cardiac failure in transgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-alpha. Circulation. 97, (14), 1375-1381 (1998).
  23. Neu, N., et al. Cardiac myosin-induced myocarditis as a model of postinfectious autoimmunity. Eur Heart J. 12 Suppl D, 117-120 (1991).
  24. Neumann, D. A., et al. Induction of multiple heart autoantibodies in mice with coxsackievirus B3- and cardiac myosin-induced autoimmune myocarditis. J Immunol. 152, (1), 343-350 (1994).
  25. Rose, N. R., et al. Postinfectious autoimmunity: two distinct phases of coxsackievirus B3-induced myocarditis. Ann N Y Acad Sci. 475, 146-156 (1986).
  26. Farmer, J. B., Levy, G. P. A simple method for recording the electrocardiogram and heart rate from conscious animals. Br J Pharmacol Chemother. 32, (1), 193-200 (1968).
הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J. Vis. Exp. (88), e51654, doi:10.3791/51654 (2014).More

Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J. Vis. Exp. (88), e51654, doi:10.3791/51654 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter