في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton
Summary
اندماجي 5 البروتينات الفلورية وضع علامات على الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تسمح في الجسم الحي تتبع النسيلي عبر مبائر واثنين من الفوتون المجهري، وتوفير نظرة ثاقبة العمارة المكونة للدم نخاع العظم خلال التجدد. هذا الأسلوب يسمح رسم الخرائط مصير غير الغازية مشفرة طيفيا من الخلايا المشتقة من HSPCs في أنسجة سليمة لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع.
Abstract
قمنا بتطوير والتحقق من صحة العلامات الفلورية منهجية لتتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) مع القرار المكانية والزمانية عالية لدراسة تكون الدم في الجسم الحي باستخدام الفئران زرع نخاع العظم نموذج تجريبي. اندماجي بمناسبة الجيني باستخدام ناقلات lentiviral ترميز البروتينات الفلورية (FPS) تمكين الخرائط مصير الخلية من خلال التصوير المجهري المتقدم. استخدمت فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry إلى تنبيغ بالتزامن HSPCs، وخلق لوحة متنوعة من خلايا اللون ملحوظ: ناقلات ترميز خمسة ضباط مختلفة. التصوير باستخدام متحد البؤر / ثنائي الفوتون المجهري الهجين تمكن في وقت واحد تقييم عالية الدقة للخلايا تميز فريد وذريتها بالتزامن مع المكونات الهيكلية للأنسجة. الحجمي يحلل على مساحات واسعة تكشف عن أن مشفرة طيفيا خلايا HSPC المشتقة يمكن الكشف غير جراحية في أنسجة سليمة المختلفة، بما في ذلك نخاع العظم (BM)، لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع. دراسات حية تجمع بين multiphoton معدل الفيديو ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير في 4D تثبت إمكانية تتبع الديناميكي الخلوي والنسيلي بطريقة كمية.
Introduction
إنتاج خلايا الدم، تكون الدم يسمى، والتي تحتفظ بها عدد صغير من السكان من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs). هذه الخلايا الموجودة داخل نخاع العظم (BM) في محراب microenvironmental معقدة تتكون من بانيات، والخلايا اللحمية، الأنسجة الدهنية، وهياكل الأوعية الدموية، وجميع المتورطين في السيطرة على تجديد الذات والتمايز 1،2. كما كان حالها BM لا يمكن الوصول إليها تقليديا على الملاحظات المباشرة، والتفاعل بين HSPC والمكروية التي لا تزال uncharacterized إلى حد كبير في الجسم الحي. سابقا، أنشأنا منهجية لتصور العمارة 3D من BM سليمة باستخدام مضان المجهري متحد البؤر والتفكير 3. نحن تتميز توسيع HSPCs EGFP ملحوظ في BM، ولكن استخدام واحد فقط FP يمنع تحليل تجديد على مستوى النسيلي. مؤخرا جدا ونحن استغل Lentiviral جين الأنطولوجيا (ليغو) ناقلات التعبير جوهري فلوريداالبروتينات uorescent (FPS) لمارك خلايا 4،5 بكفاءة. شارك في تنبيغ HSPC مع 3 أو 5 ناقلات يولد لوحة متنوعة من الألوان اندماجي، مما يسمح تتبع متعددة استنساخ HSPC الفردية.
تميزت HSPC جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا التصوير الجديدة يسمح لتتبع الأفراد صاروخ موجه HSPC وengraftment في BM من الفئران المعرضة للإشعاع. واستخدمت ناقلات ليغو للاحتفال HSPC مع 3 أو 5 ضباط مختلفة (من فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry) واتبع engraftment على مر الزمن في BM بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر و2 الفوتون، مما يسمح التصور الواضح من العظام وغيرها هياكل مصفوفة، والعلاقة من الحيوانات المستنسخة HSPC لمكونات المكروية بهم. تم تنقيته HSPC والخلايا السلبية النسب من C57BL / 6 الفئران BM، transduced مع ناقلات ليغو، وreinfused بواسطة ذيل حقن الوريد حيز ذاب myelo الفئران مسانج. من خلال رصد كميات كبيرة من الأنسجة القص BM نحن تصور engraftment عظمي تحدث في وقت مبكرBM التجدد. ظهرت مجموعات الخلايا مع لون الأطياف المتنوعة في البداية على مقربة من العظام وتقدما مركزيا مع مرور الوقت. ومن المثير للاهتمام، وبعد أكثر من 3 أسابيع يتكون نخاع مجموعات نسيلي العيانية، مما يشير إلى انتشار تكون الدم المستمدة من HSPCs فرد متاخم في نخاع، بدلا من نشرها على نطاق واسع من HSPCs عبر مجرى الدم. كان هناك أقل تنوع الألوان في نقاط زمنية متأخرة، مما يشير إلى صعوبة في transducing طويلة الأجل إعادة إسكانها الخلايا مع ناقلات متعددة.
بالإضافة إلى ذلك، شكلت مجموعات HSPCs في الطحال، جهازا مسؤولا أيضا عن تكون الدم في الفئران. يمكن أن تحل الخلايا الفردية المستمدة HPSC في الغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية والطحال والكبد والرئة والقلب والجلد والعضلات والهيكل العظمي، الأنسجة الدهنية، والكلى أيضا. صور 3D يمكن تقييم نوعيا وكميا لتقدير توزيع الخلايا مع الاضطرابات الحد الأدنى من الأنسجة. وأخيرا، فإننا توضيحد جدوى دراسات ديناميكية حية في 4D من خلال الجمع بين الرنانة multiphoton المسح الضوئي ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير. هذه المنهجية تمكن غير الغازية ارتفاع القرار، ومتعدد الأبعاد تتبع خلية من خلايا مصير السكان طيفيا تميز في الهندسة المعمارية 3D سليمة، وتوفير أداة قوية في دراسة تجديد الأنسجة وعلم الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا هنا تفاصيل منهجية قوية وضعت مؤخرا لتتبع خلية نسيلي، والجمع بين التنوع الكبير التي تولدها بمناسبة اندماجي مع ترميز 5FP ناقلات ليغو والتصوير مع متحد البؤر جنبا إلى جنب و 2 الفوتون المجهري لتحقيق الحجمي والتصوير الديناميكي في الأنسجة الحية. هذا مدد استخدام الألوان…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
