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Biology

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन द्वारा प्रत्यारोपण के लिए mitochondria की रैपिड अलगाव और शुद्धि

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

स्तनधारी ऊतक बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया है. चूहा जिगर या कंकाल की मांसपेशी की तैयारी एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator साथ homogenized गया और माइटोकांड्रिया नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से अंतर निस्पंदन से अलग थे. वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर 100 मिनट - Mitochondrial अलगाव समय 60 की तुलना <30 मिनट है.

Abstract

अंतर centrifugation और / या Ficoll ढाल centrifugation का उपयोग पहले से वर्णित mitochondrial अलगाव तरीकों को पूरा करने के लिए 60-100 मिनट की आवश्यकता होती है. हम एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator और अंतर निस्पंदन का उपयोग स्तनधारी बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल में, पुस्तिका homogenization ऊतक dissociator के मानकीकृत homogenization चक्र के साथ बदल रहा है. यह वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है. ऊतक हदबंदी के बाद, homogenate दोहराए centrifugation कदम को खत्म जो नायलॉन जाल फिल्टर, के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. नतीजतन, mitochondrial अलगाव कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल 0.18 ± 0.04 छ (गीला वजन) ऊतक के नमूने से लगभग 2 एक्स 10 10 व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया पैदावार.

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया लाल रक्त कोशिकाओं को छोड़कर शरीर में हर कोशिका में मौजूद हैं और महत्वपूर्ण सेलुलर और चयापचय की प्रक्रिया 1-4 की एक बड़ी संख्या में शामिल हैं. क्योंकि इनमें से कई कार्यों की, mitochondrial क्षति हानिकारक प्रभाव 3 हो सकता है. Mitochondrial समारोह और रोग कई mitochondrial अलगाव तरीकों की जांच करने के आदेश में वर्णित किया गया है. 1940 5-8 को mitochondrial अलगाव की तारीख की जल्द से जल्द प्रकाशित खातों. पहली दस्तावेज प्रयास कम गति 5,8 में नमक के घोल में centrifugation द्वारा पीछा एक मोर्टार में जिगर ऊतक पीस द्वारा mitochondrial अलगाव का प्रदर्शन किया. बाद में, अन्य समूहों के मूल प्रक्रिया पर विस्तार किया है और अंतर centrifugation 6-8 पर आधारित ऊतक विभाजन का प्रदर्शन किया. ये जल्दी तरीकों अक्सर homogenization, और / या अंतर centrifugation 9-15 शामिल है जो वर्तमान तकनीकों का आधार बनाया. homogenizati की संख्याकदम पर और centrifugation प्रोटोकॉल के बीच बदलता है. ये दोहराए चरणों mitochondrial अलगाव के लिए समय बढ़ाने के लिए और अंततः व्यवहार्यता को कम. ठीक से 10,16 नियंत्रित नहीं इसके अलावा, अगर पुस्तिका homogenization mitochondrial क्षति और असंगत परिणाम हो सकता है.

हाल ही में, हम दौरे ऊतक 17,18 में प्रत्यारोपण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के homogenization और अंतर centrifugation इस्तेमाल किया. यह लंबा अलगाव की प्रक्रिया लगभग 90 मिनट की जरूरत है और इस विधि के नैदानिक ​​प्रयोज्यता इसलिए सीमित था. नैदानिक ​​और शल्य चिकित्सा उपचार में तीव्र चिकित्सकीय प्रयोग के लिए अनुमति देने के लिए हम कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है कि एक तेजी से mitochondrial अलगाव प्रक्रिया का विकास किया है.

इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ मानकीकृत ऊतक हदबंदी वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं. Addit मेंआयन, अंतर centrifugation की जगह में अंतर निस्पंदन का उपयोग समय लगता है और अत्यधिक, विशुद्ध रूप से व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया का अधिक तेजी से अलगाव के लिए अनुमति दोहराए centrifugation कदम समाप्त.

कम से कम 30 मिनट में व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की क्षमता नैदानिक ​​प्रयोज्यता के लिए अनुमति देता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग सर्जरी (सीएबीजी) और अन्य चिकित्सकीय प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए क्षमता है.

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Protocol

तैयारी

  1. 1 एम कश्मीर HEPES स्टॉक समाधान (KOH के साथ 7.2 पीएच को समायोजित) तैयार करें.
  2. 0.5 एम कश्मीर EGTA शेयर समाधान (KOH के साथ 8.0 पीएच को समायोजित) तैयार करें.
  3. 1 एम के.एच. 2 4 पीओ शेयर समाधान तैयार है.
  4. 1 एम 2 MgCl शेयर समाधान तैयार है.
  5. Homogenizing बफर (पीएच 7.2) 300 मिमी सूक्रोज, 10 मिमी कश्मीर HEPES, और 1 मिमी कश्मीर EGTA तैयार करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  6. श्वसन बफर 250 मिमी सूक्रोज, तैयार 2 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 10 मिमी 2 MgCl, 20 मिमी कश्मीर HEPES बफर (पीएच 7.2) और 0.5 मिमी कश्मीर EGTA (8.0 पीएच). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  7. NaCl के 80 ग्राम, KCl के 2 जी, ना 2 4 HPO की 14.4 ग्राम, और 1 एल दोहरा आसुत एच 2 ओ (7.4 पीएच) में 2 के.एच. पीओ 4 के 2.4 ग्राम भंग करके 10x पीबीएस शेयर समाधान तैयार है.
  8. 1 एल दोहरा आसुत एच 2 ओ में 100 मिलीलीटर 10x पीबीएस pipetting द्वारा 1x पीबीएस तैयार
  9. Subtilisin एक की 4 मिलीग्राम में बाहर वजन द्वारा Subtilisin एक शेयर की तैयारीएक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  10. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में बीएसए की 20 मिलीग्राम बाहर वजन द्वारा बीएसए स्टॉक तैयार करें. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

Mitochondrial अलगाव (चित्रा 1)

  1. अलगाव के लिए तुरंत पहले, Homogenizing बफर के 1 मिलीलीटर में Subtilisin एक भंग.
  2. अलगाव के लिए तुरंत पहले, Homogenizing बफर के 1 मिलीलीटर में बीएसए भंग.
  3. बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1x पीबीएस में एक 6 मिमी बायोप्सी नमूना पंच और दुकान का उपयोग दो ताजा ऊतक के नमूने ले लीजिए.
  4. बफर homogenizing बर्फ ठंड के 5 मिलीलीटर युक्त एक हदबंदी सी ट्यूब के लिए ऊतक के दो 6 मिमी घूंसे स्थानांतरण.
  5. ऊतक dissociator पर हदबंदी सी ट्यूब फिटिंग द्वारा ऊतक homogenize और पूर्व निर्धारित mitochondrial अलगाव चक्र (60 सेकंड homogenization) का चयन करें.
  6. एक बर्फ बाल्टी के लिए हदबंदी सी ट्यूब निकालें.
  7. को Subtilisin एक शेयर के समाधान के 250 μl जोड़ेंhomogenate, उलटा द्वारा मिश्रण और 10 मिनट के लिए बर्फ पर homogenate सेते हैं.
  8. Homogenizing बफर के साथ बर्फ और पूर्व गीला फिल्टर पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 40 माइक्रोन जाल फिल्टर प्लेस और बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में homogenate फिल्टर.
  9. छानना को हौसले से तैयार बीएसए शेयर समाधान के 250 μl जोड़ें और उलटा द्वारा मिश्रण.
    नोट: mitochondrial प्रोटीन दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है अगर यह कदम न आना.
  10. Homogenizing बफर के साथ बर्फ और पूर्व गीला फिल्टर पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 40 माइक्रोन फिल्टर प्लेस और बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में homogenate फिल्टर.
  11. Homogenizing बफर के साथ बर्फ और पूर्व गीला फिल्टर पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 10 माइक्रोन फिल्टर प्लेस और बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में homogenate फिल्टर.
  12. 10 मिनट में के लिए 9000 XG पर दो पूर्व ठंडा 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र छानना स्थानांतरण4 डिग्री सेल्सियस.
  13. सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर से निलंबित और बर्फ के ठंडे श्वसन बफर के 1 मिलीलीटर में छर्रों गठबंधन.

एटीपी परख

नोट: एक एटीपी luminescence परख एक एटीपी परख किट का उपयोग किया जा सकता है अलग माइटोकॉन्ड्रिया की चयापचय गतिविधि का निर्धारण करने के लिए. प्रोटोकॉल, अभिकर्मकों और मानकों परख किट में आपूर्ति की गई. प्रक्रिया का सारांश नीचे वर्णित है.

  1. आर टी के लिए किट अभिकर्मकों संतुलित करना.
  2. दोहरा आसुत जल से 1,170 μl में lyophilized एटीपी गोली भंग करके 10 मिमी एटीपी शेयर समाधान तैयार है. एटीपी बर्फ पर मानक स्टॉक समाधान और तैयार mitochondrial नमूनों की दुकान.
  3. Lyophilized सब्सट्रेट समाधान की एक शीशी सब्सट्रेट बफर समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे मिक्स और अंधेरे में जगह है.
  4. एक काले, अपारदर्शी तल, 96 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं को श्वसन बफर के 100 μl जोड़ें.
  5. प्रत्येक के लिए तैयार नमूनों से अच्छी तरह ओ माइटोकॉन्ड्रिया के 10 μl जोड़ेंपिता काला, अपारदर्शी तल, 96 अच्छी तरह से थाली. नोट: नमूने तीन प्रतियों में चढ़ाया जाता है. मानकों और नकारात्मक नियंत्रण (श्वसन बफर) के लिए तीन कुओं के लिए एक पंक्ति में शामिल हैं.
  6. मानकों और नियंत्रण सहित, सभी कुओं को स्तनधारी सेल समाधान के 50 μl जोड़ें.
  7. 125 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  8. ऊष्मायन के दौरान 10 मिमी एटीपी शेयर समाधान से 0.1 मिमी, 0.05 मिमी, 0.01 मिमी, 0.005 मिमी, 0.001 मिमी, और 0.0001 मिमी एटीपी की सांद्रता में एटीपी मानकों तैयार करते हैं. बर्फ पर स्टोर मानकों.
  9. ऊष्मायन के बाद, थाली के नक्शे पर संकेत के रूप में कुओं इसी को एटीपी मानकों के 10 μl जोड़ें. नोट: मानक दो प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं.
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से पुनर्गठन सब्सट्रेट समाधान के 50 μl जोड़ें.
  11. 125 rpm पर 5 मिनट के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  12. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ जुड़ा हुआ एक कंप्यूटर पर खुला Gen5 1.11 सॉफ्टवेयर.
  13. "के तहतएक नए आइटम बनाएँ प्रयोग "" पर क्लिक करें ".
  14. "तयशुदा प्रोटोकॉल" पर क्लिक करें. "ठीक है" पर क्लिक करें.
  15. बाएँ स्तंभ में, फिर, "प्रक्रिया" "प्रोटोकॉल" का चयन करें.
  16. "देरी" का चयन करें. 00:10:00 को सेट करें. "ठीक है" पर क्लिक करें.
  17. चुनें "पढ़ें". ड्रॉप डाउन मेनू से "Luminescence" का चयन करें. निम्नलिखित के लिए अन्य सेटिंग्स समायोजित करें: प्रकार समापन बिंदु, एकीकरण समय 0 पढ़ें: 01.00 एमएम: SS.ss, फिल्टर 1 सेट, उत्सर्जन होल, प्रकाशिकी स्थान ऊपर, संवेदनशीलता 100, शीर्ष जांच कार्यक्षेत्र 1.00 मिमी ऑफसेट.
  18. थाली का विश्लेषण करने के लिए तैयार हो गया है, शीर्ष पंक्ति पर "प्लेट पढ़ें" आइकन पर क्लिक करें. "पढ़ें" पर क्लिक करें. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को खोलता है, ऊपरी बाएं कोने में अच्छी तरह A1 साथ ट्रे में प्लेट रखें. तापमान के साथ एक बॉक्स खुल जाएगा. "पढ़ें" पर क्लिक करें. नोट: उच्च मूल्यों में वृद्धि हुई एटीपी स्तर और उच्च चयापचय गतिविधि के साथ सहसंबंधी.

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Representative Results

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव में प्रक्रियात्मक चरणों रूपरेखा आंकड़ा चित्र 1 में दिखाया गया है. कुल प्रक्रियात्मक समय 30 मिनट से भी कम है.

ऊतक के नमूने एक 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग कर प्राप्त किया गया. ऊतक वजन 0.18 ± 0.04 छ (गीला वजन) था. कण आकार गिनती द्वारा निर्धारित रूप में अलग माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या 2.4 थी एक्स 10 10 ± 0.1 एक्स 10 कंकाल पेशी के लिए 10 माइटोकांड्रिया और जिगर की तैयारी के लिए 2.75 x 10 10 ± 0.1 एक्स 10 10 माइटोकांड्रिया (2A चित्रा). तुलना mitochondrial संख्या भी hemocytometer द्वारा निर्धारित किया गया था के लिए अनुमति देने के लिए. 0.11 के रूप में hemocytometer द्वारा निर्धारित Mitochondrial संख्या को कम करके आंका गया था 10 x 10 ± 0.04 x 10 10 कंकाल की मांसपेशी के लिए माइटोकांड्रिया और 0.34 एक्स जिगर की तैयारी के लिए 10 x 10 माइटोकॉन्ड्रिया 10 10 ± 0.09 (एफigure 2A). आकार के आधार कण काउंटर द्वारा निर्धारित Mitochondrial व्यास चित्रा 2B में दिखाया गया है. प्रतिनिधि अनुरेखण अलग माइटोकॉन्ड्रिया पिछली रिपोर्टों 7 के साथ समझौते में 0.38 ± 0.17 माइक्रोन का मतलब व्यास के साथ एक शिखर के तहत स्थानीयकृत हैं पता चलता है.

Mitochondrial प्रोटीन / जी (गीला वजन) Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा निर्धारित ऊतक शुरू किया गया 4.8 ± 2.9 मिलीग्राम / छ (गीला वजन) और कंकाल की मांसपेशी और जिगर के नमूने के लिए 7.3 ± 3.5 मिलीग्राम / छ (गीला वजन) (चित्रा -2 सी).

Mitochondrial पवित्रता ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया था और चित्रा 2 डी में दिखाया गया है. माइटोकॉन्ड्रिया कम से कम 0.01% की हड्डी टूट या क्षतिग्रस्त होने के साथ घने इलेक्ट्रॉन होना दिखाया गया है. गैर mitochondrial कणों द्वारा संदूषण 0.001% से कम है.

पहले से डे के रूप में Mitochondrial व्यवहार्यता Mitotracker लाल द्वारा निर्धारित किया गया था17,18 मानते. हमारे परिणाम अलग माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता (- सी आंकड़े 3 ए) का कहना है कि दिखा.

एटीपी एक luminescent परख किट का उपयोग निर्धारित किया गया था. एटीपी परख के लिए एक थाली नक्शा 4 चित्र में दिखाया गया है. एटीपी मानकों दो प्रतियों में चढ़ाया गया. Mitochondrial नमूने और नकारात्मक नियंत्रण तीन प्रतियों में चढ़ाया गया. एटीपी सामग्री 10.67 ± 4.38 nmol / मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन और 14.83 ± 4.36 nmol / मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन कंकाल मांसपेशियों और जिगर के नमूने के लिए क्रमशः (चित्रा 3 डी) था.

Mitochondrial श्वसन पहले 17,18 वर्णित के रूप में एक क्लार्क प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत दर जिगर की तैयारी के लिए 178 कंकाल की मांसपेशी के लिए ± 17 एनएम ओ 2 / मिनट / मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन और 176 ± 23 एनएम ओ 2 / मिनट / मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन था. श्वसन नियंत्रण सूचकांक (आरसीआई) मूल्यों 2.45 ± 0.34 एक थेकंकाल की मांसपेशी और जिगर नमूना तैयारी क्रमशः (चित्रा 3E) के लिए डी 2.67 ± 0.17. ये परिणाम माइटोकॉन्ड्रिया 17-18 अलग करने के लिए मार्गदर्शन homogenization और अंतर centrifugation का उपयोग हमारे पिछले अध्ययनों की रिपोर्ट में उन लोगों के लिए समान हैं.

चित्रा 1
ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए चित्रा 1 स्कीमा. (ए) स्थानांतरण दो 6 मिमी बायोप्सी नमूना घूंसे एक हदबंदी सी ट्यूब में Homogenizing बफर के 5 मिलीलीटर और ऊतक dissociator के 1 मिनट homogenization प्रोग्राम का उपयोग कर नमूने homogenize. (बी) 250 μl हदबंदी में homogenate को एक शेयर के समाधान Subtilisin जोड़ें सी ट्यूब और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. (सी) एक पूर्व के माध्यम से homogenate फ़िल्टर बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 40 माइक्रोन जाल फिल्टर -wetted और फिर छानना करने के लिए बीएसए शेयर समाधान के 250 μl जोड़ें. एक 50 मिलीलीटर (घ) फिर से फिल्टर एक नया पूर्व गीला 40 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से छानना बर्फ पर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र. (ई) पुनः फिल्टर बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक नया पूर्व गीला 10 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से छानना. (एफ) के लिए 9000 XG पर 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र छानना स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट. (जी) सतह पर तैरनेवाला निकालें और फिर से निलंबित और 1 मिलीलीटर श्वसन बफर में mitochondrial छर्रों गठबंधन. कुल प्रक्रिया समय कम से कम 30 मिनट है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

डी / 51682 / 51682fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 600 "/>
2 Mitochondrial उपज और पवित्रता का आंकड़ा. (ए) hemocytometer और कण आकार काउंटर माइटोकॉन्ड्रिया संख्या कंकाल मांसपेशियों और जिगर के लिए 0.18 ± 0.04 छ ऊतक (गीला वजन) से अलग. (बी) Mitochondrial आकार (मिलीग्राम / छ) कण आकार काउंटर से पता चला के रूप में वितरण. (सी) Mitochondrial प्रोटीन कंकाल की मांसपेशी और जिगर के लिए मिलीग्राम / छ ऊतक गीला वजन. पृथक माइटोकांड्रिया (डी) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि. स्केल बार 100 एनएम है. तीर गैर mitochondrial कणों और क्षतिग्रस्त माइटोकांड्रिया से संभव संदूषण का संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3 < br /> चित्रा 3 Mitochondrial व्यवहार्यता. Mitotracker लाल CMXRos साथ लेबल माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्रतिदीप्ति के तहत चरण विपरीत रोशनी और (बी और सी) के तहत अलग माइटोकांड्रिया (ए) के प्रतिनिधि photomicrographs,. स्केल सलाखों 25 माइक्रोन (ए, बी) और 5 माइक्रोन (सी) हैं. इन छवियों को माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली क्षमता को बनाए रखा है कि संकेत मिलता है.   एटीपी परख और (ई) भारतीय पुनर्वास परिषद द्वारा निर्धारित तीर झिल्ली क्षमता या मलबे (डी) एटीपी सामग्री nmol / मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन की कमी माइटोकॉन्ड्रिया का संकेत (राज्य 3 / राज्य 4) क्लार्क इलेक्ट्रोड द्वारा निर्धारित रूप में. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

लोड / 51682 / 51682fig4highres.jpg "चौड़ाई =" 600 "/>
. एटीपी परख के लिए चित्रा 4 प्लेट नक्शा यह प्लेट मानचित्र (A1: - A12) मानकों की स्थापना करने के लिए कैसे दिखाता है, माइटोकॉन्ड्रिया नमूने एटीपी परख के लिए - - (C9 C7) (बी 1 सी 6), और नकारात्मक नियंत्रण. परख के दौरान, श्वसन बफर के 100 μl, स्तनधारी सेल समाधान के 50 μl और पुनर्गठन सब्सट्रेट समाधान के 50 μl सभी कुओं में जुड़ जाते हैं (A1 - C9).

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Discussion

इसे सफलतापूर्वक mitochondrial व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए बर्फ पर सभी समाधान और ऊतकों के नमूनों को रखने के लिए आवश्यक है इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया अलग. बर्फ पर बनाए रखा, तब भी जब अलग माइटोकॉन्ड्रिया समय 19 से अधिक कार्यात्मक गतिविधि में कमी प्रदर्शन करेंगे. हम सभी समाधान और परिवर्धन पूर्व तैयार रहने की सलाह देते हैं. हम तौलना पूर्व और 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में 4 मिलीग्राम aliquots में Subtilisin एक दुकान और -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान. इसी प्रकार बीएसए पूर्व तौला और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है कि 1.5 एमएल microfuge ट्यूबों में 20 मिलीग्राम aliquots में संग्रहीत किया जाता है. ट्यूब का उपयोग करने के लिए बस से पहले -20 डिग्री सेल्सियस से हटा रहे हैं और Subtilisin एक और बीएसए mitochondrial अलगाव की प्रक्रिया में उपयोग के लिए Homogenizing बफर के 1 मिलीलीटर में भंग कर रहे हैं.

कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों से दो बायोप्सी घूंसे एक 6 मिमी बायोप्सी पंच उपचारात्मक उपायों 17 के लिए नैदानिक ​​और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रिया प्रदान का उपयोग कर प्राप्त-18. हम दो तरीकों, hemocytometer और कण आकार गिनती का इस्तेमाल किया है माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या का अनुमान लगाने के लिए. कण आकार की गिनती के उपयोग की सिफारिश की है. कण आकार काउंटर एक परिभाषित आकार का एक छेद के माध्यम से गुजर कणों की मात्रा को मापने के लिए विद्युत प्रतिबाधा का उपयोग करता है. कण आकार काउंटर महंगा है, लेकिन सटीक और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है और उपयोगकर्ता स्वतंत्र है. Hemocytometry द्वारा अनुमानित Mitochondrial संख्या अधिक किफायती है. हमारे अध्ययन से इस पद्धति का एक कण आकार काउंटर का उपयोग कर प्राप्त की तुलना में कम परिमाण के लगभग एक आदेश हैं कि चर अनुमान प्रदान करता है कि प्रदर्शन किया है. हम भी hemocytometer द्वारा प्राप्त मायने रखता उपयोगकर्ता पर अत्यधिक निर्भर हैं कि उल्लेख किया है. हम एक hemocytometer का उपयोग सभी मामलों में एक व्यक्ति द्वारा किया जाना चाहिए संगत अनुमान सुनिश्चित करने के लिए सुझाव देते हैं.

हम mitochondrial समारोह का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होने के लिए एटीपी परख किट मिल गया है. किट सभी आवश्यक आर आपूर्तिeagents और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की चयापचय क्रिया को निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करता है. एटीपी परख एक क्लार्क प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग कर प्राप्त उन के रूप में इसी तरह के परिणाम प्रदान करता है और इसलिए पिछले डेटा विश्लेषण 20-21 के साथ संगत है.

हमारे mitochondrial अलगाव प्रोटोकॉल का एक बड़ा फायदा यह कम से कम 30 मिनट में संदूषण से मुक्त व्यवहार्य, श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया के एक उच्च उपज के अलगाव के लिए अनुमति देता है. अंतर centrifugation की जगह में अंतर निस्पंदन काफी प्रक्रिया समय कम कर देता है. अन्य प्रोटोकॉल समग्र अलगाव समय 60 मिनट के लिए 100 मिनट 13-17 होने के साथ कई centrifugation कदम शामिल. इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह ऊतक homogenization मानकीकृत है कि है. वाणिज्यिक ऊतक dissociator एक मानकीकृत चक्र प्रदान करता है और लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम पैदावार. इस उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता और के अधीन है कि पुस्तिका homogenization के विपरीत हैविसंगति. ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए हमारे विधि नैदानिक ​​और शल्य चिकित्सकीय हस्तक्षेप 17,18 के लिए संगत एक अलग समय सीमा प्रदान करता है.

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Disclosures

सभी जानवरों वर्तमान संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया. हम खुलासा करने के लिए प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों नहीं है.

Acknowledgments

यह अध्ययन राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL- 103,542, और कैप को BCH संज्ञाहरण रिसर्च फाउंडेशन के गणमान्य इन्नोवेटर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 91 शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं सहकारी तकनीक खोजी माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव निस्पंदन homogenate ऊतक हदबंदी प्रत्यारोपण

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन द्वारा प्रत्यारोपण के लिए mitochondria की रैपिड अलगाव और शुद्धि
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Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo,… More

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

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