Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is <30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.
Eerder beschreven mitochondriale isolatiemethoden middels differentiële centrifugatie en / of Ficoll gradiënt centrifugatie vereisen 60 tot 100 minuten in beslag. We beschrijven een werkwijze voor de snelle isolatie van mitochondria van zoogdieren biopten met een commercieel tissue Dissociator en differentiële filtratie. In dit protocol wordt manueel homogenisering vervangen door gestandaardiseerde homogenisering cyclus het weefsel Dissociator's. Dit zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. Na weefsel dissociatie, wordt het homogenaat gefilterd door nylon mesh filters, die repetitieve centrifugeren stappen te elimineren. Hierdoor kan mitochondriale isolatie worden uitgevoerd in minder dan 30 minuten. Deze isolatie protocol levert ongeveer 2 x 10 10 levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria van 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht) weefselmonster.
Mitochondriën bestaan in elke cel in het lichaam behalve rode bloedcellen en zijn betrokken bij een groot aantal belangrijke cellulaire en metabole processen 1-4. Door deze vele functies kunnen mitochondriale schade nadelige gevolgen 3 hebben. Om mitochondriale functie en dysfunctie verschillende mitochondriale isolatiemethoden onderzoeken zijn beschreven. De vroegste gepubliceerde rekeningen van mitochondriale isolatie datum om de jaren 1940 5-8. De eerste gedocumenteerde poging aangetoond mitochondriale isolatie door malen leverweefsel in een mortier gevolgd door centrifugatie in een zoutoplossing bij lage snelheid 5,8. Later, andere groepen uitgebreid op de oorspronkelijke procedure en gedemonstreerd weefsel fractionering op basis van differentiële centrifugatie 6-8. Deze vroege methoden vormde de basis van de huidige technieken die vaak nemen homogenisering, en / of differentieel centrifugeren 9-15. Het aantal homogenizatiop en centrifugatiestappen varieert tussen protocollen. Deze repetitieve stappen verhogen de tijd voor mitochondriële isolatie en uiteindelijk levensvatbaarheid verminderen. Daarnaast kunnen handmatige homogenisering mitochondriale schade en inconsistente resultaten veroorzaken als ze niet goed gecontroleerd 10,16.
Onlangs, gebruikten we homogenisering en differentiële centrifugatie om mitochondriën voor transplantatie te isoleren in hartspierweefsel 17,18. Deze langdurige isolatie procedure vereist ongeveer 90 min en de klinische toepasbaarheid van deze methode was dus beperkt. Met het oog op acute therapeutisch gebruik in klinische en chirurgische behandeling hebben we een snelle mitochondriale isolatieprocedure die in minder dan 30 min kan worden uitgevoerd ontwikkeld.
De belangrijkste voordelen van dit protocol is dat gestandaardiseerde weefsel dissociatie zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. In addition, het gebruik van differentiële filtratie in plaats van differentiële centrifugatie elimineert tijdrovend en repetitief centrifugatiestappen waardoor meer snelle isolatie van zeer gezuiverd, levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria.
Het vermogen om levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria isoleren in minder dan 30 minuten maakt klinische toepasbaarheid. Deze isolatie protocol heeft potentieel voor gebruik in een coronaire bypass operatie chirurgie (CABG) en andere therapeutische procedures.
Met succes isoleren mitochondria met dit protocol is het essentieel om alle oplossingen en weefselmonsters op ijs houden mitochondriale levensvatbaarheid behouden. Zelfs wanneer op ijs wordt geïsoleerde mitochondria een afname van functionele activiteit vertonen in de tijd 19. We raden aan dat alle oplossingen en aanvullingen vooraf worden voorbereid. We vooraf wegen en te bewaren Subtilisine A in 4 mg aliquots in 1,5 ml microfuge buizen en opgeslagen bij -20 ° C. Evenzo BSA is pre-gewogen en opgeslagen in …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103542, en de BCH Anesthesia Research Foundation Distinguished Trailblazer Award voor CAP.
Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
Equipment | |||
50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |