ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يوصف طريقة لعزل السريع الميتوكوندريا الخزعات النسيجية الثدييات. تم المتجانس كبد الفئران أو مستحضرات العضلات والهيكل العظمي مع dissociator النسيج التجاري وتم عزل الميتوكوندريا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات التفاضلي شبكة من النايلون. الميتوكوندريا الوقت العزلة هو <30 دقيقة مقارنة ب 60-100 دقيقة باستخدام طرق بديلة.
Abstract
طرق العزلة الميتوكوندريا التي سبق وصفها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي و / أو Ficoll التدرج الطرد المركزي تتطلب 60 الى 100 دقيقة لإكمال. نحن تصف طريقة لعزل الميتوكوندريا السريع لخزعات من الثدييات باستخدام dissociator النسيج التجاري والترشيح التفاضلي. في هذا البروتوكول، يتم استبدال التجانس اليدوي مع دورة التجانس موحدة للdissociator في الأنسجة. وهذا يسمح للموحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. بعد تفكك الأنسجة، ويتم تصفية جناسة من خلال شبكة مرشحات النايلون، والتي تزيل الخطوات الطرد المركزي المتكررة. ونتيجة لذلك، والعزلة الميتوكوندريا يمكن أن يؤديها في أقل من 30 دقيقة. هذا البروتوكول العزلة ينتج حوالي 2 × 10 10 الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس من 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب) عينة الأنسجة.
Introduction
وتوجد الميتوكوندريا في كل خلية في الجسم ما عدا خلايا الدم الحمراء وتشارك في عدد كبير من العمليات الخلوية والأيض المهمة 1-4. لأن العديد من هذه الوظائف، يمكن أن تلف الميتوكوندريا لها آثار ضارة 3. من أجل التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وضعف عدة طرق العزلة الميتوكوندريا تم وصفها. أقرب الحسابات المنشورة التاريخ العزلة الميتوكوندريا إلى 1940s 5-8. أظهرت محاولة موثقة الأولى العزلة الميتوكوندريا عن طريق طحن أنسجة الكبد في بمدافع الهاون تليها الطرد المركزي في محلول الملح على سرعة منخفضة 5،8. في وقت لاحق، وسعت مجموعات أخرى على الإجراء الأصلي وأظهرت الأنسجة تجزئة استنادا التفاضلية الطرد المركزي 6-8. هذه الأساليب المبكرة شكلت أساس التقنيات الحالية والتي غالبا ما تتضمن التجانس، و / أو التفاضلية الطرد المركزي 9-15. عدد homogenizatiعلى الطرد المركزي والخطوات يختلف بين البروتوكولات. هذه الخطوات المتكررة تزيد من الوقت لعزل الميتوكوندريا وفي نهاية المطاف خفض قدرتها على البقاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسبب أضرارا التجانس اليدوي وتتعارض النتائج الميتوكوندريا إذا لم يتم السيطرة بشكل صحيح 10،16.
في الآونة الأخيرة، كنا التجانس والتفضيلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا لزرعها في أنسجة عضلة القلب 17،18. هذا الإجراء يتطلب عزلة طويلة ما يقرب من 90 دقيقة وكان انطباق السريري لهذه الطريقة بالتالي محدود. للسماح للاستخدام العلاجي الحاد في العلاج السريري والجراحية وضعنا الداخلي العزلة الميتوكوندريا السريع التي يمكن القيام بها في أقل من 30 دقيقة.
الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن تفكك نسيج موحد يسمح موحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. في additأيون، واستخدام الترشيح التفاضلي في مكان الطرد المركزي التفاضلي يلغي تستغرق وقتا طويلا والخطوات الطرد المركزي المتكررة السماح لعزل أسرع من الميتوكوندريا المختصة العالية النقاء وقابلة للحياة والتنفس.
القدرة على عزل الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس في أقل من 30 دقيقة تسمح للتطبيق السريري. هذا البروتوكول العزلة لديها امكانات للاستخدام في جراحة الشريان التاجي الالتفافية تطعيم (CABG) والإجراءات العلاجية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إعداد
- إعداد 1 M-K HEPES محلول المخزون (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH).
- تحضير 0.5 M-K EGTA المالية الحل (ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع KOH).
- إعداد 1 M KH 2 PO 4 أسهم الحل.
- إعداد 1 M MgCl 2 محلول المخزون.
- إعداد المجانسة العازلة (درجة الحموضة 7.2) 300 ملي السكروز، K-10 ملي HEPES، وK-1 ملم EGTA. تخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد التنفس العازلة 250 ملي السكروز، 2 مم KH 2 PO 4، 10 ملم MgCl 2 و 20 ملي K-HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.2) و 0.5 ملي K-EGTA (8.0 درجة الحموضة). تخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد 10X PBS المالية الحل عن طريق إذابة 80 جم من كلوريد الصوديوم، و 2 غرام من بوكل، 14.4 غرام من نا 2 هبو 4، و 2.4 غرام من KH 2 PO 4 في 1 L مزدوج المقطر H 2 O (7.4 درجة الحموضة).
- إعداد 1X PBS قبل pipetting 100 مل 10X PBS إلى 1 L مزدوج المقطر H 2 O.
- إعداد سبتيليزين مخزون من وزنها من 4 ملغ من سبتيليزين ألف فيإلى أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد BSA المالية التي وزنها من 20 ملغ من BSA في أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
عزل الميتوكوندريا (الشكل 1)
- مباشرة قبل العزلة، ويحل سبتيليزين ألف في 1 مل من المجانسة العازلة.
- مباشرة قبل العزلة، ويحل BSA في 1 مل من المجانسة العازلة.
- جمع عينتين أنسجة جديدة باستخدام 6 ملم عينة خزعة لكمة وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
- نقل اثنين من اللكمات 6 ملم من الأنسجة لأنبوب التفكك C تحتوي على 5 مل من البرد الجليد التجانس العازلة.
- تجانس الأنسجة عن طريق تركيب أنبوب C التفكك على dissociator الأنسجة وتحديد دورة العزلة الميتوكوندريا المحددة مسبقا (60 ثانية التجانس).
- إزالة أنبوب التفكك C إلى دلو الجليد.
- إضافة 250 ميكرولتر من سبتيليزين مخزون الحل لجناسة، مزيج من انعكاس واحتضان جناسة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- وضع مرشح شبكة 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
- إضافة 250 ميكرولتر من الطازجة BSA الحل لاسهم الراشح وتخلط بواسطة انقلاب.
ملاحظة: حذفت هذه الخطوة إذا كان مطلوبا الميتوكوندريا تقرير البروتين. - وضع مرشح 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
- وضع مرشح 10 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
- نقل الترشيح لاثنين قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microfuge والطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 10 دقيقة في4 درجة مئوية.
- إزالة طاف وإعادة تعليق والجمع بين الكريات في 1 مل من الجليد الباردة التنفس العازلة.
ATP الفحص
ملاحظة: لتحديد النشاط الأيضي الميتوكوندريا المعزولة والتلألؤ فحص ATP يمكن أن يؤديها باستخدام عدة ATP الفحص. بروتوكول، تم تزويد الكواشف والمعايير في عدة الفحص. يوصف ملخص الإجراء أدناه.
- تتوازن الكواشف عدة لRT.
- إعداد 10 ملي ATP المالية الحل عن طريق إذابة بيليه ATP مجفف بالتجميد في 1،170 ميكرولتر من الماء المقطر مزدوجة. تخزين ATP المالية القياسية الحل وعينات الميتوكوندريا مستعدة على الجليد.
- إضافة 5 مل من محلول الركيزة العازلة إلى قارورة من حل الركيزة مجفف بالتجميد. المزيج بلطف ووضع في الظلام.
- إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التنفس لجميع آبار سوداء، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا.
- إضافة 10 ميكرولتر من الميتوكوندريا من العينات مستعدة لكل بئر ساتحاد كرة القدم الأسود، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا. ملاحظة: يتم مطلي العينات في ثلاث نسخ. تشمل على التوالي لمعايير وثلاثة آبار للسيطرة سلبية (التنفس الاحتياطي).
- إضافة 50 ميكرولتر من الثدييات حل تحلل الخلية لجميع الآبار، بما في ذلك المعايير والضوابط.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على شاكر المداري في 125 دورة في الدقيقة.
- أثناء الحضانة إعداد معايير ATP في تركيزات 0.1 ملم، 0.05 ملم، 0.01 ملم، 0.005 ملم، 0.001 ملم، و0.0001 ملي ATP من 10 ملي ATP المالية الحل. مخزن المعايير على الجليد.
- بعد الحضانة، وإضافة 10 ميكرولتر من المعايير ATP إلى الآبار المقابلة كما هو موضح على الخريطة وحة. يتم تنفيذ المعايير في نسختين: مذكرة.
- إضافة 50 ميكرولتر من الحل الركيزة أعيد إلى كل بئر.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري لمدة 5 دقائق عند 125 دورة في الدقيقة.
- مفتوحة Gen5 1.11 البرنامج على جهاز كمبيوتر مرتبط مع طيفي.
- تحت عنوان "إنشاء عنصر جديد "، انقر على" تجربة ".
- انقر على "بروتوكول الافتراضي". انقر على "موافق".
- في العمود الأيسر، حدد "البروتوكول"، ثم "الداخلي".
- حدد "تأخير". تعيين ل00:10:00. انقر على "موافق".
- حدد "اقرأ". حدد "التلألؤ" من القائمة المنسدلة. ضبط الإعدادات الأخرى إلى ما يلي: اقرأ نوع نقطة النهاية والتكامل الوقت 0: 01.00 MM: SS.ss، تصفية مجموعات 1، الانبعاثات هول، البصريات الوظيفة الأعلى، الحساسية 100، أوفست الأعلى المسبار الرأسي 1.00 ملم.
- عندما لوحة جاهزة للتحليل، انقر فوق "قراءة لوحة" أيقونة على الصف العلوي. انقر على "اقرأ". عندما يفتح طيفي، ووضع لوحة في علبة مع جيدا A1 في الزاوية اليسرى العليا. سوف يظهر مربع مع درجة حرارة فتح. انقر على "اقرأ". ملاحظة: القيم العليا ترتبط مع زيادة مستويات ATP والنشاط الأيضي العالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد الرقم يحدد الخطوات الإجرائية في عزل الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح الفارق في الشكل 1. مجموع الوقت الإجرائي هو أقل من 30 دقيقة.
وتم الحصول على عينات الأنسجة باستخدام 6 ملم خزعة لكمة. كان وزن النسيج 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب). بلغ عدد الميتوكوندريا المعزولة على النحو الذي يحدده حجم الجسيمات العد 2.4 × 10 10 ± 0.1 × 10 10 الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظمي و 2.75 × 10 10 ± 0.1 × 10 10 الميتوكوندريا للتحضير الكبد (الشكل 2A). للسماح للتم تحديد مقارنة عدد الميتوكوندريا أيضا عدادة الكريات. تم التقليل من عدد الميتوكوندريا على النحو الذي يحدده عدادة الكريات و0.11 × 10 10 ± 0.04 × 10 10 الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظمي و0.34 × 10 10 ± 0.09 × 10 10 الميتوكوندريا للتحضير الكبد (Figure 2A). يظهر قطرها الميتوكوندريا على النحو الذي يحدده حجم استنادا الجسيمات المضادة في الشكل 2B. يظهر تتبع تمثيلي يتم ترجمة الميتوكوندريا المعزولة تحت قمة واحدة مع قطر متوسط 0.38 ± 0.17 ميكرومتر في اتفاق مع تقارير سابقة 7.
الميتوكوندريا البروتين / ز (الوزن الرطب) ابتداء من الأنسجة على النحو الذي يحدده Bicinchoninic حمض (BCA) مقايسة كان 4.8 ± 2.9 ملغ / غ (وزن رطب) و 7.3 ± 3.5 ملغ / غ (وزن رطب) لعضلات الهيكل العظمي وعينات الكبد على التوالي (الشكل 2C).
تم تحديد نقاء الميتوكوندريا من انتقال الإلكترون المجهري ويظهر في الشكل 2D. وتظهر الميتوكوندريا أن الإلكترون كثيفة مع أقل من 0.01٪ يتم كسر أو التالفة. تلوث الجسيمات غير الميتوكوندريا هو أقل من 0.001٪.
تم تحديد الجدوى الميتوكوندريا بواسطة MitoTracker الأحمر ونزع سابقامكتوب 17،18. نتائجنا تظهر ان الميتوكوندريا المعزولة الحفاظ على غشاء المحتملة (أرقام 3A - C).
تم تحديد ATP باستخدام طقم فحص الانارة. ويرد خريطة لوحة للمقايسة ATP في الشكل 4. تم مطلي معايير ATP في مكررة. تم مطلي عينات الميتوكوندريا والضوابط السلبية في ثلاث نسخ. كان محتوى ATP 10.67 ± 4.38 نانومول / ملغ بروتين الميتوكوندريا و14.83 ± 4.36 نانومول / ملغ بروتين الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظمي وعينات الكبد على التوالي (الشكل 3D).
تم تقييم التنفس الميتوكوندريا باستخدام نوع القطب كلارك كما هو موضح سابقا 17،18. وكان معدل استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا 178 ± 17 نانومتر O 2 / دقيقة / ملغم بروتين الميتوكوندريا لعضلات الهيكل العظمي و 176 ± 23 نانومتر O 2 / دقيقة / ملغم بروتين الميتوكوندريا للتحضير الكبد. مؤشر تحكم في الجهاز التنفسي كانت (RCI) 2.45 ± 0.34 القيم ود 2.67 ± 0.17 لعضلات الهيكل العظمي والكبد عينة الاستعدادات على التوالي (الشكل 3E). هذه النتائج مشابهة لتلك التي أعلن عنها في دراساتنا السابقة باستخدام التجانس اليدوي والتفاضلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا 17-18.
الرقم 1. مخطط لعزل الميتوكوندريا باستخدام التفكك الأنسجة والترشيح التفاضلية. (A) نقل اثنين من 6 ملم عينة خزعة اللكمات إلى 5 مل من المجانسة العازلة في أنبوب التفكك C وتجانس العينات باستخدام برنامج التجانس 1 دقيقة على dissociator الأنسجة و. (B) إضافة 250 ميكرولتر سبتيليزين حل الأسهم إلى جناسة في التفكك C أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. (C) تصفية جناسة من خلال مسبقا -wetted 40 ميكرون فلتر شبكة في 50 مل أنبوب الطرد المركزي مخروطي على الجليد ثم إضافة 250 ميكرولتر من محلول المخزون BSA إلى الراشح. (D) إعادة فلتر الترشيح من خلال المبللة قبل 40 ميكرون فلتر شبكة الجديد في 50 مل الطرد المركزي مخروطي على الجليد. (E) إعادة فلتر الترشيح خلال 10 ميكرون مرشح شبكة المبللة مسبقا جديد في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد. (F) نقل الراشح إلى 1.5 مل أنابيب microfuge والطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. (G) إزالة طاف وإعادة تعليق والجمع بين حبيبات الميتوكوندريا في 1 مل العازلة التنفس. مجموع الوقت الإجراء هو أقل من 30 دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
د / 51682 / 51682fig2highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 2. العائد الميتوكوندريا والنقاء. (A) عدد عدادة الكريات وحجم الجسيمات المضادة عزل الميتوكوندريا من 0.18 ± 0.04 غرام الأنسجة (الوزن الرطب) لعضلات الهيكل العظمي والكبد (B) حجم الميتوكوندريا (ملغ / غ) التوزيع والكشف عنها بواسطة حجم الجسيمات المضادة (C) الميتوكوندريا البروتين ملغم / ز الأنسجة الوزن الرطب للعضلات الهيكل العظمي والكبد. (D) نقل الإلكترون المجهري صورة الميتوكوندريا المعزولة. شريط النطاق هو 100 نانومتر. السهام تشير إلى احتمال تلوث جزيئات غير الميتوكوندريا الميتوكوندريا والتالفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
< ر /> الشكل 3. الميتوكوندريا جدوى. photomicrographs تمثيلية من الميتوكوندريا المعزولة (A) في إطار المرحلة التباين والإضاءة (B و C) تحت مضان، مع الميتوكوندريا المسمى مع MitoTracker الأحمر CMXRos. أشرطة النطاق هي 25 ميكرون (A، B) و 5 ميكرون (C). هذه الصور تشير إلى أن الميتوكوندريا حافظت على غشاء المحتملة. السهام تشير الميتوكوندريا التي تفتقر إلى غشاء (D) ATP المحتوى المحتملين أو الحطام نانومول البروتين الميتوكوندريا / ملغ على النحو الذي يحدده الفحص ATP و (E) RCI (الدولة 3 / حالة 4) على النحو الذي يحدده كلارك القطب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
حمولة / 51682 / 51682fig4highres.jpg "العرض =" 600 "/>
. الرقم خريطة 4. خماسي للATP الفحص تبين هذه الخريطة لوحة كيفية إعداد المعايير (A1 - A12)، وعينات الميتوكوندريا (B1 - C6)، والسلبية الضوابط (C7 - C9) لفحص ATP. خلال الفحص، 100 ميكرولتر من العازلة التنفس، يتم إضافة 50 ميكرولتر من الثدييات حل تحلل الخلية و 50 ميكرولتر من الحل الركيزة أعيد إلى جميع الآبار (A1 - C9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لعزل الميتوكوندريا بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لا بد من الحفاظ على كل الحلول وعينات الأنسجة على الجليد للحفاظ على استمرارية الميتوكوندريا. حتى عندما حافظت على الجليد، والميتوكوندريا المعزولة تظهر انخفاضا في النشاط الوظيفي على مر الزمن 19. ونحن نوصي جميع الحلول والإضافات يكون قبل إعداد. نحن قبل تزن وتخزين سبتيليزين ألف في 4 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في -20 درجة مئوية. وبالمثل BSA يوزن مسبقا وتخزينها في 20 مأخوذة ملغ في 1.5 مل أنابيب microfuge التي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. تتم إزالة فقط قبل استخدام أنابيب من -20 درجة مئوية، وتذوب سبتيليزين ألف وBSA في 1 مل من المجانسة العازلة لاستخدامها في إجراء العزل الميتوكوندريا.
اثنين من اللكمات الخزعة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تم الحصول عليها باستخدام 6 ملم خزعة لكمة توفر الميتوكوندريا كافية للاستخدام في الإجراءات السريرية والجراحية للتدخلات العلاجية 17-18. لتقدير عدد الميتوكوندريا وقد استخدمنا طريقتين، عدادة الكريات وحجم الجسيمات العد. فمن المستحسن استخدام حجم الجسيمات العد. تستخدم العداد حجم الجسيمات مقاومة الكهربائية لقياس حجم الجسيمات التي تمر عبر فتحة من حجم محدد. العداد حجم الجسيمات مكلفة ولكنها توفر تقديرات دقيقة وموثوقة ومستقلة هو سهل. عدد الميتوكوندريا التي يقدرها hemocytometry هو أكثر اقتصادا. وقد أظهرت دراستنا أن هذا الأسلوب يوفر تقديرات متفاوتة أن ما يقرب من واحد أمر من حجم أقل من ذلك الحصول عليها باستخدام عداد حجم الجسيمات. لاحظنا أيضا أن التهم التي حصلت عليها عدادة الكريات تعتمد اعتمادا كبيرا على المستخدم. نقترح لضمان تقديرات متسقة جميع التهم الموجهة إليه باستخدام عدادة الكريات يجب أن يؤديها شخص واحد.
لقد وجدنا مجموعات الفحص ATP أن تكون مفيدة لتحديد وظيفة الميتوكوندريا. طقم لوازم كل ص الضروريeagents ويوفر طريقة بسيطة وسريعة لتحديد النشاط الأيضي الميتوكوندريا المعزولة. يوفر الفحص ATP نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام كلارك من نوع القطب ومتوافق مع تحليل البيانات السابقة 20-21 بالتالي.
والميزة الرئيسية لدينا بروتوكول العزلة الميتوكوندريا هو أنه يتيح لعزل ارتفاع العائد من والتنفس الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة خالية من التلوث في أقل من 30 دقيقة. الترشيح التفاضلي في مكان الطرد المركزي التفاضلي يخفف كثيرا من الوقت الإجراء. البروتوكولات الأخرى تتضمن عدة خطوات الطرد المركزي مع مرور الوقت العزلة العام إلى 60 دقيقة إلى 100 دقيقة 13-17. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي أن تجانس الأنسجة وموحدة. يوفر dissociator الأنسجة التجاري دورة موحدة وتعطي نتائج متسقة وقابلة للتكرار. هذا هو على النقيض من التجانس اليدوي التي تخضع لتقلبات المستخدم والتناقض. لدينا وسيلة لعزل السريع الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح التفاضلي يوفر إطار زمني العزلة متوافق للتدخل الجراحي العلاجي السريري و17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الحالية. ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد جرانت HL- 103542، وجائزة تريل بليزر المتميزة المؤسسة الغرفة بحوث التخدير لCAP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1,000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 ml Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G.
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
Tags
علم الأحياء الخلوي، العدد 91، العمليات الجراحية، المنطوق، وتقنيات التحقيق، الميتوكوندريا، والعزلة، والترشيح، جناسة، تفكك الأنسجة، وزرعErratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
