Summary

عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

Published: September 06, 2014
doi:

Summary

يوصف طريقة لعزل السريع الميتوكوندريا الخزعات النسيجية الثدييات. تم المتجانس كبد الفئران أو مستحضرات العضلات والهيكل العظمي مع dissociator النسيج التجاري وتم عزل الميتوكوندريا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات التفاضلي شبكة من النايلون. الميتوكوندريا الوقت العزلة هو <30 دقيقة مقارنة ب 60-100 دقيقة باستخدام طرق بديلة.

Abstract

طرق العزلة الميتوكوندريا التي سبق وصفها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي و / أو Ficoll التدرج الطرد المركزي تتطلب 60 الى 100 دقيقة لإكمال. نحن تصف طريقة لعزل الميتوكوندريا السريع لخزعات من الثدييات باستخدام dissociator النسيج التجاري والترشيح التفاضلي. في هذا البروتوكول، يتم استبدال التجانس اليدوي مع دورة التجانس موحدة للdissociator في الأنسجة. وهذا يسمح للموحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. بعد تفكك الأنسجة، ويتم تصفية جناسة من خلال شبكة مرشحات النايلون، والتي تزيل الخطوات الطرد المركزي المتكررة. ونتيجة لذلك، والعزلة الميتوكوندريا يمكن أن يؤديها في أقل من 30 دقيقة. هذا البروتوكول العزلة ينتج حوالي 2 × 10 10 الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس من 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب) عينة الأنسجة.

Introduction

وتوجد الميتوكوندريا في كل خلية في الجسم ما عدا خلايا الدم الحمراء وتشارك في عدد كبير من العمليات الخلوية والأيض المهمة 1-4. لأن العديد من هذه الوظائف، يمكن أن تلف الميتوكوندريا لها آثار ضارة 3. من أجل التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وضعف عدة طرق العزلة الميتوكوندريا تم وصفها. أقرب الحسابات المنشورة التاريخ العزلة الميتوكوندريا إلى 1940s 5-8. أظهرت محاولة موثقة الأولى العزلة الميتوكوندريا عن طريق طحن أنسجة الكبد في بمدافع الهاون تليها الطرد المركزي في محلول الملح على سرعة منخفضة 5،8. في وقت لاحق، وسعت مجموعات أخرى على الإجراء الأصلي وأظهرت الأنسجة تجزئة استنادا التفاضلية الطرد المركزي 6-8. هذه الأساليب المبكرة شكلت أساس التقنيات الحالية والتي غالبا ما تتضمن التجانس، و / أو التفاضلية الطرد المركزي 9-15. عدد homogenizatiعلى الطرد المركزي والخطوات يختلف بين البروتوكولات. هذه الخطوات المتكررة تزيد من الوقت لعزل الميتوكوندريا وفي نهاية المطاف خفض قدرتها على البقاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسبب أضرارا التجانس اليدوي وتتعارض النتائج الميتوكوندريا إذا لم يتم السيطرة بشكل صحيح 10،16.

في الآونة الأخيرة، كنا التجانس والتفضيلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا لزرعها في أنسجة عضلة القلب 17،18. هذا الإجراء يتطلب عزلة طويلة ما يقرب من 90 دقيقة وكان انطباق السريري لهذه الطريقة بالتالي محدود. للسماح للاستخدام العلاجي الحاد في العلاج السريري والجراحية وضعنا الداخلي العزلة الميتوكوندريا السريع التي يمكن القيام بها في أقل من 30 دقيقة.

الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن تفكك نسيج موحد يسمح موحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. في additأيون، واستخدام الترشيح التفاضلي في مكان الطرد المركزي التفاضلي يلغي تستغرق وقتا طويلا والخطوات الطرد المركزي المتكررة السماح لعزل أسرع من الميتوكوندريا المختصة العالية النقاء وقابلة للحياة والتنفس.

القدرة على عزل الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس في أقل من 30 دقيقة تسمح للتطبيق السريري. هذا البروتوكول العزلة لديها امكانات للاستخدام في جراحة الشريان التاجي الالتفافية تطعيم (CABG) والإجراءات العلاجية الأخرى.

Protocol

إعداد إعداد 1 M-K HEPES محلول المخزون (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH). تحضير 0.5 M-K EGTA المالية الحل (ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع KOH). إعداد 1 M KH 2 PO 4 أسهم الحل. <li sty…

Representative Results

ويرد الرقم يحدد الخطوات الإجرائية في عزل الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح الفارق في الشكل 1. مجموع الوقت الإجرائي هو أقل من 30 دقيقة. وتم الحصول على عينات الأنسجة باستخدام 6 ملم خزعة لكمة. كان وزن النسيج 0.18 ± 0.0…

Discussion

لعزل الميتوكوندريا بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لا بد من الحفاظ على كل الحلول وعينات الأنسجة على الجليد للحفاظ على استمرارية الميتوكوندريا. حتى عندما حافظت على الجليد، والميتوكوندريا المعزولة تظهر انخفاضا في النشاط الوظيفي على مر الزمن 19. ونحن نوصي جميع الح…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد جرانت HL- 103542، وجائزة تريل بليزر المتميزة المؤسسة الغرفة بحوث التخدير لCAP.

Materials

Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1000 Assay Kit
Perkin Elmer 6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader
BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

References

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Play Video

Cite This Article
Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

View Video