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Summary
哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して<30分である。
Abstract
以前に分画遠心法および/またはフィコール勾配遠心分離を用いてミトコンドリア単離方法が完了するまで60〜100分を必要とする。私たちは、商業組織の解離及び差動濾過を用いて、哺乳動物の生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法を記載している。このプロトコルでは、手動の均質化は、組織解離の標準化された均質化サイクルに置き換えられる。これは、均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化することができます。組織解離の後、ホモジネートを、繰り返し遠心分離工程を排除ナイロンメッシュフィルターを通して濾過する。結果として、ミトコンドリアの単離は、30分未満で行うことができる。この単離プロトコールは、0.18±0.04グラム（湿重量）組織サンプルから約2×10 10の生存および呼吸有能なミトコンドリアをもたらす。
Introduction
ミトコンドリアは、赤血球を除く体内のあらゆる細胞に存在し、重要な細胞及び代謝過程1-4の多数に関与している。そのため、これらの多くの機能により、ミトコンドリアの損傷は有害な影響3を持つことができます。ミトコンドリア機能および機能不全を調べるために、いくつかのミトコンドリアの単離方法が記載されている。 1940 5-8ミトコンドリアアイソ日の最も早い公表さを占めています。最初の文書化された試みは、低速5,8での塩溶液中で遠心分離し、乳鉢で肝組織を粉砕することにより、ミトコンドリアの単離を実証した。その後、他のグループは、元の手順の際に展開され、分画遠心6-8に基づいて、組織の分別を実証した。これらの初期の方法は、しばしば均質化、および/ または分画遠心9-15を組み込む現在の技術の基礎を形成した。 homogenizati数ステップにし、遠心分離プロトコルによって異なります。これらの反復的な手順では、ミトコンドリアの分離のための時間を増加させ、最終的には実行可能性を減らすことができます。正しく10,16を制御しない場合に加えて、手動の均質化は、ミトコンドリアの損傷や一貫性のない結果を引き起こす可能性があります。
最近では、心筋組織17,18への移植のためのミトコンドリアを分離するために均質化および分画遠心を使用していました。この長時間の単離手順は、約90分を要し、このメソッドの臨床的適用可能性は、したがって限られていた。臨床的および外科的治療の急性治療的使用を可能にするために、私たちは30分未満で行うことができる迅速なミトコンドリアの単離法を開発した。
このプロトコルの主な利点は、標準化された組織解離が均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化を可能にすることである。 ADDITでイオン、分画遠心の代わりに、差動ろ過の使用は、時間がかかり、高度に精製された実行可能な呼吸有能なミトコンドリアのより迅速な単離を可能にする、繰り返しの遠心分離工程を排除します。
30分未満で生存可能であり、呼吸有能なミトコンドリアを単離する能力は、臨床応用が可能となる。この分離プロトコルは、冠動脈バイパスグラフト術（CABG）および他の治療手順において使用するための可能性を有する。
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Protocol
準備
- 1 M K-HEPES原液を（KOHでpHを7.2に調整）を準備します。
- 0.5 M K-EGTAストック溶液を（KOHで8.0にpHを調整）を準備します。
- 1MのKH 2 PO 4原液を準備します。
- 1 MのMgCl 2ストック溶液を準備します。
- 均質化緩衝液（pH7.2）300 mMスクロース、10 mMのK-HEPES、および1mM K-EGTAを準備します。 4℃で保存。
- 呼吸バッファー250mMスクロースを調製2mMのKH 2 PO 4、10mMのMgCl 2、20mMのK-HEPES緩衝液（pH7.2）及び0.5mMのK-EGTA液（pH8.0）。 4℃で保存。
- 1リットル中に再蒸留H 2 O（pH7.4）中のNaCl 80グラムのKCl 2グラムのNa 2 HPO 4 14.4gの、およびKH 2 PO 4 2.4gの溶解して10倍のPBS原液を準備します。
- 1リットル中に100ミリリットル10倍のPBSをピペットによって1×PBSを準備し、二重蒸留H 2 O
- ズブチリシンA 4mgの中を計量することによりサブチリシンA株式を準備1.5mlマイクロチューブに。使用するまで-20℃で保存してください。
- 1.5mlマイクロチューブにBSA 20mgを秤量することにより、BSA株式を準備します。使用するまで-20℃で保存してください。
ミトコンドリアの単離（図1）
- 分離の直前に、均質化緩衝液1mlにスブチリシンAを溶解する。
- 分離の直前に、均質化緩衝液1mlにBSAを溶解する。
- 氷上で50ミリリットルコニカル遠心管中で1×PBS中で6ミリメートル生検試料のパンチとストアを使用して2新鮮な組織サンプルを収集します。
- 氷冷均質化緩衝液5mlを含む解離Cチューブに組織の2 6mmのパンチを転送します。
- 組織解離に対する解離Cチューブをフィッティングすることにより、組織をホモジナイズし、予め設定されたミトコンドリアアイソレーション·サイクル（60秒均質化）を選択します。
- アイスバケットに解離Cチューブを取り外します。
- にサブチリシンA原液を250μlを追加ホモジネートは、転倒混和し、氷上で10分間ホモジネートをインキュベートする。
- 均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に40μmのメッシュフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。
- ろ液に新たに調製したBSA原液を250μlを加え、転倒混和。
注：ミトコンドリアタンパク質の決定が必要な場合は、この手順を省略します。 - 均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に40μmのフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。
- 均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に10μmのフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。
- で10分間、9,000×gで2予備冷却1.5mlマイクロチューブと遠心分離機にろ液を移し4ºC。
- 上清を除去し、再懸濁し、氷冷呼吸緩衝液1mlにペレットを兼ね備えています。
ATPアッセイ
注：ATPルミネセンスアッセイはATPアッセイキットを用いて行うことができる単離されたミトコンドリアの代謝活性を測定するため。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットで供給された。手順の概要について説明する。
- RTにキット試薬を平衡化する。
- 蒸留水の1170μlの凍結乾燥したATPペレットを溶解することにより10 mMのATP原液を準備します。氷上で保存ATP標準原液、準備ミトコンドリアのサンプル。
- 凍結乾燥した基質溶液のバイアルに基質緩衝溶液5mlを追加します。穏やかに混合し、暗所に置きます。
- 黒、不透明な底の96ウェルプレートのすべてのウェルに呼吸緩衝液100μlを追加します。
- Oよく準備のサンプルからそれぞれにミトコンドリアの10μl添加FA黒、不透明な底の96ウェルプレート。注：サンプルは、三連でプレーティングする。規格および陰性コントロール（呼吸バッファ）のための3つのウエルの行を含めます。
- 標準やコントロールを含む、全てのウェルに、哺乳類細胞溶解液50μlを追加します。
- 125 rpmでオービタルシェーカー上で5分間37ºCでプレートをインキュベートする。
- インキュベーション中の10mMのATP原液から0.1ミリメートル、0.05ミリメートル、0.01ミリメートル、0.005ミリモル、0.001 mmであり、0.0001 mMのATPの濃度のATP標準を準備します。氷の上の基準を保管してください。
- インキュベーション後、プレートマップ上に示されるように、対応するウェルに、ATP標準液10μlを加える。注：標準は二重に実施されている。
- 各ウェルに再構成された基質溶液50μlを追加します。
- 125 rpmで5分間、オービタルシェーカー上で37ºCでプレートをインキュベートする。
- 分光光度計を用いて接続されたコンピュータ上で開くのGen5 1.11ソフトウェア。
- "の下で新規アイテムの作成」をクリックして「実験」。
- 「デフォルトのプロトコル」をクリックします。 「OK」をクリックしてください。
- 左の列で、「プロトコル」、そして「プロシージャ」を選択します。
- 「遅延」を選択します。夜12時10分00秒に設定します。 「OK」をクリックしてください。
- 選択して「読み取り」。ドロップダウンメニューから「ルミネセンス」を選択します。読み取りタイプエンドポイント、積分時間0：01.00 MM：次のように他の設定を調整しSS.SS、フィルター1セット、排出穴、光学ポジショントップ、感度100、トッププローブ縦1.00ミリメートルオフセット。
- プレートを分析する準備ができたら、一番上の行の「リード·プレート」アイコンをクリックします。 「読む」をクリックしてください。分光光度計が開いたら、左上隅にあるだけでなく、A1にしてトレイにプレートを置く。温度のボックスが開きます。 「読む」をクリックしてください。注：値が大きいほど、増加したATPレベルより高い代謝活性と相関する。
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Representative Results
組織解離および差動濾過を用いてミトコンドリアの単離における処理手順の概要を示す図が図1に示されている。合計手続き時間が30分未満である。
組織サンプルは、6mmの生検パンチを使用して得た。組織重量は0.18±0.04グラム（湿重量）であった。粒径計数によって決定されるように単離したミトコンドリアの数は2.4であった×10 10±0.1×10 6の骨格筋10ミトコンドリアおよび肝臓調製物のための2.75×10 10±0.1×10 10ミトコンドリア（ 図2A）。比較のミトコンドリアの数を可能にするには、また、血球計数器によって測定した。ミトコンドリア数は、F（骨格筋のための0.11×10 10±0.04×10 10ミトコンドリアおよび肝臓調製のための0.34×10 10±0.09×10 10ミトコンドリアなどの血球計数器によって決定されるように過小評価されたigureの2A）。サイズベース粒子カウンタによって決定されるようにミトコンドリアの直径は、 図2Bに示されている。代表トレースが単離されたミトコンドリアは、以前の報告7と一致して0.38±0.17ミクロンの平均直径を有する一つのピークの下に局在している示しています。
ミトコンドリアタンパク質/グラム（湿重量）ビシンコニン酸（BCA）アッセイによって決定されるように、組織を出発それぞれ骨格筋および肝臓試料用ミリグラム/グラム（湿重量）4.8±2.9及び7.3±3.5ミリグラム/グラム（湿重量）（ 図2C）。
ミトコンドリアの純度は、透過型電子顕微鏡により測定し、 図2Dに示されている。ミトコンドリアは、0.01％未満では、破断または損傷した状態で密な電子れるように示されている。非ミトコンドリア粒子による汚染が0.001％未満である。
ミトコンドリア生存率は、以前にデとしてのMitoTrackerレッドによって決定した17,18スクライブ。本発明者らの結果は、単離されたミトコンドリアは膜電位（ - C図3A）を維持することを示している。
ATPは、発光アッセイキットを用いて決定した。 ATPアッセイ用のプレートマップは、 図4に示されている。ATP標準は、二連でプレートした。ミトコンドリア試料および陰性対照はトリプリケートで播種した。 ATP含有量は、10.67±4.38ナノモル/ mgのミトコンドリアタンパク質、および14.83±4.36ナノモル/ mgのミトコンドリアタンパク質骨格筋および肝臓のサンプルについて、それぞれ、（ 図3D）であった。
以前17,18に記載されるように、ミトコンドリア呼吸は、クラーク型電極を用いて評価した。ミトコンドリア酸素消費速度は、肝臓の準備のための178骨格筋のための±17 nMのO 2 /分/ mgミトコンドリアタンパク質および176±23 nMのO 2 /分/ mgミトコンドリアタンパク質であった。呼吸制御指標（RCI）の値は2.45±0.34であったdはそれぞれ骨格筋および肝臓試料調製のための2.67±0.17（ 図3E）。これらの結果は、ミトコンドリア17-18を単離するために手動の均質化および分画遠心法を用いて、われわれの以前の研究で報告されたものと同様である。
組織解離および差動濾過を用いてミトコンドリアを単離するための図1のスキーマ。 （A）転送2 6ミリメートル生検サンプルパンチ解離C管内の均質化緩衝液を5mlの組織解離の1分間均質化プログラムを使用してサンプルを均質化する。（B）250μlを解離ホモジネートに原液をスブチリシン追加C管と氷上で10分間インキュベートする。（C）プレを通してホモジネートフィルタ氷上で50ミリリットルコニカル遠心管中40ミクロンメッシュフィルターを-wetted後、ろ液にBSAストック溶液を250μlを追加。（D）の再フィルタろ液50ml中の新予め湿らせ40μmのメッシュフィルターを通して氷の上の円錐形遠心。（E）の再フィルタろ液50mlの円錐遠心管に新たな予め湿らせ10μmのメッシュフィルターを通して氷上で。（F）のために9,000×gで1.5mlマイクロチューブと遠心分離機にろ液を移し4℃で10分（G）は上清を除去し、再懸濁し、1mlの呼吸緩衝液中で、ミトコンドリアのペレットを兼ね備えています。合計処置時間は30分未満である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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2ミトコンドリア収率および純度図。 （A）血球計数器および粒子サイズカウンタミトコンドリア数骨格筋および肝臓のために0.18±0.04 g組織（湿重量）から単離した。（B）ミトコンドリアの大き量（mg / g）の分布、粒子サイズカウンタによって検出される。（C）ミトコンドリアタンパク骨格筋と肝臓のためミリグラム/ g組織湿重量。単離されたミトコンドリアの（D）の透過型電子顕微鏡像。スケールバーは100nmである。矢印は、非ミトコンドリア粒子や損傷したミトコンドリアによる汚染の可能性を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
< BR /> 図3。ミトコンドリアの生存率 。赤のMitoTracker CMXRosで標識ミトコンドリアの蛍光下で位相差照明及び（B及びC）の下で単離されたミトコンドリア（A）の代表的な顕微鏡写真。スケールバーは25μmで（A、B）及び5μmの（C）である。これらの画像は、ミトコンドリアの膜電位を維持することを示している。 矢印は、クラーク電極によって決定されたATPアッセイおよび（E）RCI（状態3 /状態4）によって決定されたコンテンツナノモル/ mgのミトコンドリアタンパク質のATP（D）膜電位やゴミを欠いたミトコンドリアを示している。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
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ATPアッセイのための図4。プレートマップこのプレートマップは規格（A1 - A12）を設定する方法を示しています。、ミトコンドリア試料（B1 - C6）、および陰性対照（C7 - C9）ATPアッセイのため。アッセイの間、呼吸緩衝液100μlを、哺乳動物細胞溶解溶液50μlと再構成された基質溶液50μlをすべてのウェルに加える（A1 - C9）。
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Discussion
正常にこのプロトコルを使用してミトコンドリアを分離するためには、ミトコンドリアの生存能力を維持するために氷の上のすべてのソリューションおよび組織サンプルを維持することが不可欠である。氷上に維持した場合でも、単離されたミトコンドリアは、19時間にわたって機能的活性の減少を示すであろう。私たちは、すべてのソリューションや追加が事前に準備することをお勧めします。私たちは、事前に計量し、店舗サブチリシンA 1.5mlマイクロチューブ内の4mgのアリコートで、-20℃で保管してください。同様に、BSAは、予め秤量し、-20℃で保存することができる1.5mlマイクロ遠心チューブ中の20mgのアリコートで保存されている。管を使用直前に-20℃から取り出し、サブチリシンAとBSAは、ミトコンドリアの単離手順において使用するための均質化緩衝液1ml中に溶解する。
6mmの生検パンチを使用して得られた骨格筋組織由来の二つの生検パンチは、治療的介入のための17の臨床的及び外科的処置で使用するのに十分なミトコンドリアを提供-18。私たちは二つの方法、血球計数器および粒子サイズのカウントを使用しているミトコンドリアの数を推定します。粒度カウントの使用が推奨されます。粒径カウンタは、定義されたサイズのアパーチャを通過する粒子の体積を測定するために電気インピーダンスを使用する。粒径カウンタは高価であるが、正確で信頼性の高い推定値を提供し、ユーザが独立している。血球計算によって推定ミトコンドリア数はより経済的である。われわれの研究では、この方法は粒子サイズカウンターを用いて得られたものよりも少ない約1桁である変数の推定値を提供することを実証した。また、血球計数器により得られた数は、ユーザーに大きく依存していることに注目した。私たちは、血球計数器を用いてすべてのカウントが一人で実行する必要が一貫性のある推定値を確保するためにあることを示唆している。
私たちは、ミトコンドリア機能を決定するために有用であることがATPアッセイキットを発見した。キットには、必要なすべてのRを供給eagentsおよび単離されたミトコンドリアの代謝活性を測定するための簡単かつ迅速な方法を提供する。 ATPアッセイは、クラーク型電極を使用して得られたものと同様の結果を提供し、したがって、以前のデータ分析20-21と互換性がある。
私たちのミトコンドリアの単離プロトコールの主な利点は、それが30分未満で汚染のない生存、呼吸有能なミトコンドリアの高収率の単離を可能にすることである。分画遠心の代わりに微分ろ過は大幅に手続き時間が短縮されます。他のプロトコルは、全体的な分離時間が60分、100分の13〜17であることにはいくつかの遠心分離工程を組み込む。このプロトコルの他の利点は、組織の均質化が標準化されることである。商業組織解離は、標準化されたサイクルを提供し、一貫性のある再現性のある結果が得られます。これは、ユーザの変動を受ける手動均質化とは対照的であり、かつ矛盾。組織解離および差分濾過を用いてミトコンドリアの迅速な単離のための私たちの方法は、臨床的および外科的治療介入17,18のための互換性のアイソレーションの時間枠を提供しています。
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Disclosures
全ての動物は、現在の機関のガイドラインに従って処理した。私たちは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立心臓、肺、血液研究所グラントHL-103542、およびCAPにBCH麻酔研究財団の識別トレイルブレイザー賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1,000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 ml Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
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Tags
細胞生物学、問題91、外科的手技、手術、調査の手法、ミトコンドリア、分離、ろ過、ホモジネート、組織解離、移植Erratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
