ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
En fremgangsmåte for hurtig isolering av mitokondrier fra pattedyr vevsbiopsier er beskrevet. Rottelever, eller skjelettmuskelpreparater ble homogenisert med en kommersiell vev dissociator og mitokondrier ble isolert ved filtrering gjennom nylon differensial mesh filter. Mitokondrie isolasjon tid er <30 min sammenlignet med 60 - 100 min ved hjelp av alternative metoder.
Abstract
Tidligere beskrevne mitokondrielle isoleringsmetoder ved hjelp av differensialsentrifugering og / eller Ficoll gradientsentrifugering krever 60 til 100 minutter å fullføre. Vi beskriver en fremgangsmåte for rask isolering av mitokondrier fra pattedyr biopsier ved hjelp av en kommersiell vev dissociator og differensial filtrering. I denne protokollen, er manuell homogenisering erstattet med vevet dissociator standardiserte homogenisering syklus. Dette sørger for en enhetlig og konsistent homogenisering av vevet som ikke er lett oppnås med manuell homogenisering. Etter vev dissosiasjon, blir homogenat ble filtrert gjennom nylon mesh filter, som fjerner gjentatt sentrifugering trinn. Som et resultat, kan mitokondriell isolering utføres i mindre enn 30 min. Denne isolasjonen protokollen gir ca 2 x 10 10 levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier fra 0,18 ± 0,04 g (våtvekt) vevsprøve.
Introduction
Mitokondrier eksistere i hver eneste celle i kroppen, bortsett fra røde blodceller og er involvert i et stort antall viktige cellulære og metabolske prosesser 1-4. På grunn av disse mange funksjoner, kan mitokondrieskade ha skadelige effekter tre. For å undersøke mitokondriefunksjon og dysfunksjon flere mitokondrielle isoleringsmetoder har blitt beskrevet. De tidligste publiserte kontoer mitokondriell isolasjon dato til 1940-tallet 5-8. Den første dokument forsøk demonstrerte mitokondriell isolert ved maling av levervev i en morter, etterfulgt av sentrifugering i en saltoppløsning ved lav hastighet 5,8. Senere, andre grupper utvidet på den opprinnelige prosedyren og demonstrert vev fraksjonering basert på differensialsentrifuge 6-8. Disse tidlige metoder dannet basis av dagens teknikker, som benytter ofte homogenisering, og / eller differensialsentrifuge 9-15. Antallet homogenizatipå og sentrifuge trinn varierer mellom protokoller. Disse repeterende trinn øke tiden for mitokondriell isolasjon og til slutt redusere levedyktighet. I tillegg kan manuell homogenisering forårsake mitokondriell skade og inkonsistente resultater hvis ikke skikkelig kontrollert 10,16.
Nylig brukte vi homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere mitokondrier for transplantasjon til hjerteinfarkt vev 17,18. Denne omstendelige isoleringsprosedyre kreves omtrent 90 min, og den kliniske anvendbarheten av denne metoden var derfor begrenset. For å tillate for akutt terapeutisk bruk i kliniske og kirurgiske behandlingen har vi utviklet en hurtig mitokondriell isolasjon prosedyre som kan utføres i mindre enn 30 min.
De store fordelene med denne protokollen er at standardiserte vev dissosiasjon gir jevn og konsistent homogenisering av vev som ikke er enkelt å oppnå med manuell homogenisering. I addition, bruk av differensial filtrering i stedet for differensialsentrifugering eliminerer tidkrevende og gjentatt sentrifugering fremgangsmåte som muliggjør hurtig isolering av mer høyrensede, levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier.
Evnen til å isolere levedyktige og respirasjon kompetente mitokondrier på mindre enn 30 min muliggjør klinisk anvendbarhet. Denne isolasjonen protokollen har potensial for bruk i koronarkirurgi (CABG) og andre terapeutiske prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forberedelse
- Forbered en M K-HEPES Stock Solution (justere pH til 7,2 med KOH).
- Forbered 0,5 M K-EGTA Stock Solution (justere pH til 8,0 med KOH).
- Forbered en M KH 2 PO 4 Stock Solution.
- Forbered en M MgCl2 Stock Solution.
- Forbered homogenisering buffer (pH 7,2) 300 mM sukrose, 10 mM K-HEPES og 1 mM K-EGTA. Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered Respiration buffer 250 mM sukrose, 2 mM KH PO 2 4, 10 mM MgCl 2, 20 mM K-Hepes-buffer (pH 7,2) og 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Oppbevar ved 4 ° C.
- Forbered 10x PBS lageroppløsning ved å oppløse 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na HPO 2 til 4, og 2,4 g KH PO 2 4 inn 1 L dobbelt destillert H2O (pH 7,4).
- Forbered 1x PBS ved å pipettere 100 ml 10x PBS i en L dobbelt destillert H 2 O.
- Forbered Subtilisin En Stock ved veiing ut 4 mg Subtilisin A itil et 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
- Forbered BSA Stock ved å veie ut 20 mg BSA i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
Mitokondrie Isolation (figur 1)
- Umiddelbart før isolasjon, oppløse subtilisin A i 1 ml av buffer homogenisering.
- Umiddelbart før isolasjon, oppløse BSA i 1 ml av buffer homogenisering.
- Samle to ferske vevsprøver ved hjelp av en 6 mm biopsi prøven punsj og butikk i 1x PBS i en 50 ml konisk sentrifugerør på is.
- Overfør de to 6 mm slag av vevet til en dissosiasjon C-rør inneholdende 5 ml av iskald buffer homogenisering.
- Homogenisere vev ved å montere dissosiasjon C røret på vev dissociator og velg pre-set mitokondrie isolasjon syklus (60 sek homogenisering).
- Fjern dissosiasjon C røret til en isbøtte.
- Tilsett 250 pl av subtilisin en stamoppløsning tilhomogenat, blandes ved inversjon og inkuber homogenatet på is i 10 min.
- Plasser en 40 um maskefilter til et 50 ml konisk sentrifugerør på is og pre-våt filteret med buffer homogenisere og filtrere homogenatet inn i 50 ml konisk sentrifugerør på is.
- Legg 250 mL av nylaget BSA Stock Solution til filtratet og bland ved inversjon.
Merk: utelate dette trinnet hvis mitokondrie proteinbestemmelse er nødvendig. - Plasser et 40 mikrometer filter til en 50 ml konisk sentrifugerør på is og pre-våt filteret med buffer homogenisere og filtrere homogenatet inn i 50 ml konisk sentrifugerør på is.
- Plasser et 10 mikrometer filter til en 50 ml konisk sentrifugerør på is og pre-våt filteret med buffer homogenisere og filtrere homogenatet inn i 50 ml konisk sentrifugerør på is.
- Overfør filtratet til to pre-kjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 9000 xg i 10 min ved4 ° C.
- Fjern supernatanten og re-suspendere og kombinere pellets i en ml iskald respirasjon Buffer.
ATP-analysen
Merk: For å bestemme den metabolske aktiviteten av isolerte mitokondrier en ATP luminescence analysen kan utføres ved hjelp av en ATP assay kit. Den protokollen, ble reagenser og standarder som følger med i assay kit. En oppsummering av fremgangsmåten beskrives nedenfor.
- Stabilisere settreagensene til RT.
- Forbered 10 mM ATP Stock Solution ved å løse lyofilisert ATP pellet i 1170 mL dobbelt destillert vann. Oppbevar ATP standard Stock Solution og preparerte mitokondrie prøvene på is.
- Tilsett 5 ml av substrat-buffer-løsning til en ampulle med lyofilisert substratoppløsning. Bland forsiktig og plasser i mørket.
- Tilsett 100 ul av respirasjon buffer til alle brønner av en svart, ugjennomsiktig bunn, 96 brønners plate.
- Tilsett 10 pl av mitokondrier fra de preparerte prøver til hver brønn ofa svart, ugjennomsiktig bunn, 96 brønners plate. Merk: Prøver er belagt i tre eksemplarer. Ta med en rad for standarder og tre brønner for den negative kontrollen (respirasjon Buffer).
- Tilsett 50 pl av pattedyrcellelyse løsning til alle brønnene, herunder standarder og kontroller.
- Inkuber platen ved 37 ° C i 5 min på en orbital-rysteapparat ved 125 rpm.
- Under inkuberingen forberede ATP standarder i konsentrasjoner på 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM, og 0,0001 mM ATP fra 10 mM ATP lageroppløsning. Lagre standarder på is.
- Etter inkuberingen, tilsett 10 pl ATP-standarder til tilsvarende brønner som indikert på kartet plate. Note: Standarder er utført i duplikat.
- Tilsett 50 pl av den rekonstituerte løsning substrat til hver brønn.
- Inkuber platen ved 37 ° C på en orbital-rysteapparat i 5 minutter ved 125 rpm.
- Åpne Gen5 1.11 programvaren på en datamaskin knyttet til spektrofotometer.
- Under "Opprette et nytt element ", klikk på" eksperiment ".
- Klikk på "Standard Protocol". Klikk "Ok".
- I kolonnen til venstre, velg "Protocol", deretter "Prosedyre".
- Velg "Delay". Sett til 0:10:00. Klikk "Ok".
- Velg "Les". Velg "Luminescence" fra rullegardinmenyen. Justere andre innstillinger til følgende: Les typen Endpoint, Integrasjonstid 0: 01.00 MM: ss.ss, filter sett en, Emission Hole, Optikk Position Top, Sensitivity 100, Top Probe Vertical Offset 1,00 mm.
- Når platen er klar til å bli analysert, klikk på "Les Plate"-ikonet på den øverste raden. Klikk "Les". Når spektrofotometer åpnes, Sett platen i skuffen med brønn A1 i øvre venstre hjørne. En boks med temperaturen vil åpnes. Klikk "Les". Merk: Høyere verdier korrelerer med økt ATP nivåer og høyere metabolsk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En figur som beskriver de prosedyremessige trinn i isoleringen av mitokondria ved anvendelse av vev dissosiasjon og differensial filtrering er vist i figur 1. Totalt prosesstiden er mindre enn 30 min.
Vevsprøver ble oppnådd ved bruk av en 6 mm hull biopsi. Tissue vekt var 0,18 ± 0,04 g (våt vekt). Antallet mitokondriene isolert som bestemt ved telling partikkelstørrelse var 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondriene til skjelettmuskel og 2,75 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondrier for leverpreparater (figur 2A). For å tillate sammenligning mitokondrielle tall ble også bestemt ved hemocytometer. Mitokondrie nummer ble undervurdert som bestemmes av hemocytometer som 0,11 x 10 10 ± 0,04 x 10 10 mitokondrier for skjelettmuskulatur og 0,34 x 10 10 ± 0,09 x 10 10 mitokondrier for leverpreparater (Figur 2A). Mitokondriell diameter som bestemmes av størrelsen basert partikkeltelleren er vist i figur 2B. Representanten tracing viser isolerte mitokondrier er lokalisert under ett topp med gjennomsnittlig diameter på 0,38 ± 0,17 mikrometer i samsvar med tidligere rapporter 7.
Mitokondriell protein / g (våt vekt) fra vev som bestemt ved Bicinchoninic Acid (BCA) assay var 4,8 ± 2,9 mg / g (våt vekt) og 7,3 ± 3,5 mg / g (våt vekt) for henholdsvis skjelettmuskel og lever-prøvene (figur 2C).
Mitokondriell renhet ble bestemt ved transmisjonselektronmikroskopi og er vist i Figur 2D. Mitokondriene er vist å være elektron tett med mindre enn 0,01% blir brukket eller skadet. Kontaminering av ikke-mitokondrie partiklene er mindre enn 0,001%.
Mitokondrie levedyktighet ble bestemt av MitoTracker Red som tidligere utelattrisses 17,18. Våre resultater viser at de isolerte mitokondrier opprettholde membranpotensialet (figurene 3A - C).
ATP ble bestemt ved hjelp av en selvlysende assay kit. En plate kart for ATP-analysen er vist i figur 4. ATP-standarder ble belagt i duplikat. Mitokondrielle prøver og negative kontroller ble belagt i tre eksemplarer. ATP-innholdet var 10,67 ± 4,38 nmol / mg mitokondrie protein og 14.83 ± 4.36 nmol / mg mitokondrie protein for muskel-skjelettlidelser og leverprøver henholdsvis (Figur 3D).
Mitokondriell respirasjon ble vurdert ved hjelp av en Clark-elektrode typen som tidligere beskrevet 17,18. Mitokondrie oksygenforbruk hastighet var 178 ± 17 nM O 2 / min / mg mitokondrie protein for muskel-skjelettlidelser og 176 ± 23 nM O 2 / min / mg mitokondrie protein for leverpreparater. Åndedretts kontroll indeks (RCI) verdier var 2.45 ± 0.34 end 2.67 ± 0.17 for skjelettmuskulatur og leverprøve forberedelser henholdsvis (Figur 3E). Disse resultatene er lik de som er rapportert i vårt tidligere studier ved hjelp av manuell homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere mitokondrier 17-18.
Figur 1. Skjema for isolering av mitokondria ved anvendelse av vev dissosiasjon og differensial filtrering. (A) Transfer to 6 mm biopsiprøve slag på 5 ml av homogenisering Buffer i en dissosiasjon C røret og homogenisere prøvene ved hjelp av vevet dissociator 's 1 min homogenisering program. (B) Tilsett 250 pl subtilisin A-stamoppløsning til homogenatet i dissosiasjon C røret og inkuber på is i 10 min. (C) Filter homogenatet gjennom en pre -wetted 40 um maskefilter i en 50 ml konisk sentrifugerør på is, og deretter tilsett 250 ul av BSA stamoppløsning til filtratet. (D) Re-filter filtratet gjennom et nytt pre-fuktet 40 um maskefilter i en 50 ml konisk sentrifuge på is. (E) Re-filter filtratet gjennom et nytt pre-fuktet 10 um maskefilter i en 50 ml konisk sentrifugerør på is. (F) Overfør filtratet til 1,5 ml mikrofugerør og sentrifuger ved 9000 xg 10 min ved 4 ° C. (G) Fjern supernatanten og re-suspendere og kombinere de mitokondrielle pellets i 1 ml buffer respirasjon. Total prosedyre tiden er mindre enn 30 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
d / 51682 / 51682fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Mitokondrie yield og renhet. (A) hemocytometer og partikkelstørrelsesteller mitokondrier nummer isolert fra 0,18 ± 0,04 g vev (våt vekt) til skjelettmuskel og lever. (B) Mitokondriell størrelsen (mg / g) fordeling som detekteres av partikkelstørrelsesteller. (C) Mitokondriell proteinet mg / g vev-våtvekt for skjelettmuskel og lever. (D) transmisjonselektronmikroskopi bilde av isolerte mitokondrier. Scale bar er 100 nm. Piler indikerer mulig forurensning av ikke mitokondrie partikler og skadede mitokondrier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
< br /> Figur 3. mitokondrie levedyktighet. Representative mikrofotografier av isolerte mitokondrier (A) under fasekontrastbelysning og (B og C) i henhold til fluorescens, med mitokondrier merket med MitoTracker Red CMXRos. Skala linjene er 25 um (A, B) og 5 mikrometer (C). Disse bildene viser at mitokondriene opprettholdt membranpotensialet. Pilene viser mitokondrier mangler membranpotensialet eller rusk (D) ATP innhold nmol / mg mitokondrie protein som bestemmes av ATP-analysen og (E) RCI (tilstand 3 / tilstand 4) som bestemmes av Clark elektrode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
belastning / 51682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4. Plate kartet for ATP-analysen Denne platen kartet illustrerer hvordan du setter opp standarder (A1 - A12), mitokondrier prøver (B1 - C6), og negative kontroller (C7 - C9) for ATP-analysen. Under forsøket, 100 ul av respirasjon buffer, blir 50 pl av pattedyrcellelyse-løsning og 50 ul av rekonstituert substratoppløsning tilsatt til alle brønnene (A1 - C9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å kunne isolere mitokondrier ved hjelp av denne protokollen er det viktig å holde alle løsninger og vevsprøver på is for å bevare mitokondrie levedyktighet. Selv når det holdes på is, vil det isolerte mitokondrier utviser en reduksjon i funksjonell aktivitet over tid 19. Vi anbefaler at alle løsninger og tillegg være forhånds forberedt. Vi pre-veie og lagre subtilisin A i 4 mg porsjoner i 1,5 ml mikrofugerør og lagre dem ved -20 ° C. Tilsvar BSA er pre-veid og lagret i 20 mg aliquoter i 1,5 ml mikrofugerør som kan lagres ved -20 ° C. Like før bruk ble rørene fjernet fra -20 ° C og subtilisin A og BSA ble oppløst i 1 ml av buffer homogenisering for bruk i mitokondrie isoleringsprosedyren.
To biopsi slag fra skjelettmuskulatur vev innhentet ved hjelp av en 6 mm biopsi punsj gi tilstrekkelige mitokondrier for bruk i kliniske og kirurgiske prosedyrer for terapeutiske intervensjoner 17-18. For å anslå antallet mitokondrier vi har brukt to metoder, hemocytometer og partikkelstørrelse telling. Bruken av partikkelstørrelse telling anbefales. Partikkelstørrelsen telleren benytter elektriske impedans for å måle volumet av partikler som passerer gjennom en åpning av en definert størrelse. Partikkelstørrelsen teller er kostbart, men gir nøyaktige og pålitelige estimater og er brukervennlig uavhengig. Mitokondrie antall estimert ved hemocytometry er mer økonomisk. Våre undersøkelser har vist at denne metoden gir variable anslag som er omtrent en størrelsesorden mindre enn det som oppnås ved bruk av en partikkelstørrelsesteller. Vi har også merket oss at teller innhentet av hemocytometer er svært avhengig av brukeren. Vi foreslår at for å sikre konsistente estimater alle punkter ved hjelp av en hemocytometer bør utføres av én person.
Vi har funnet ATP-analysesett for å være nyttig for å bestemme mitokondriefunksjonen. Settet leverer all nødvendig reagents og gir en enkel og rask metode for å bestemme den metabolske aktiviteten til isolerte mitokondrier. ATP-analysen gir lignende resultater som de som ble oppnådd ved hjelp av en Clark-type elektrode og er derfor kompatibel med tidligere dataanalyse 20-21.
En stor fordel med vår mitokondrie isolasjon protokollen er at det gir mulighet for isolering av en høy avkastning av levedyktige, respirasjon kompetente mitokondrier gratis for forurensning i mindre enn 30 min. Differensial filtrering i stedet for differensialsentrifugering reduserer prosedyre tid betydelig. Andre protokoller innlemme flere sentrifugeringstrinn med samlet isolasjon tiden 60 min til 100 min 13-17. En annen fordel med denne protokollen er at vev homogenisering er standardisert. Den kommersielle vev dissociator gir en standardisert syklus og er konsistent og reproduserbare resultater. Dette er i motsetning til manuell homogenisering som er gjenstand for variasjon, og brukereninkonsekvens. Vår metode for rask isolering av mitokondrier ved hjelp av vev dissosiasjon og differensial filtrering gir en isolasjons tidsramme kompatibel for klinisk og kirurgisk terapeutisk intervensjon 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dyrene ble behandlet i samsvar med gjeldende institusjonelle retningslinjer. Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute Grant HL 103 542, og The BCH Anesthesia Research Foundation Distinguished Trailblazer Award til CAP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1,000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 ml Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
Tags
Cellular Biology kirurgiske prosedyrer operativ etterforskningsteknikker mitokondrier isolasjon filtrering homogenate vev dissosiasjon transplantasjonErratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
