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Biology

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est <30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Abstract

Méthodes d'isolement des mitochondries décrites précédemment par centrifugation différentielle et / ou gradient de Ficoll centrifugation nécessitent 60 à 100 min pour terminer. Nous décrivons un procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de mammifère en utilisant un dissociateur tissulaire commercial et filtration différentielle. Dans ce protocole, l'homogénéisation manuel est remplacé par un cycle d'homogénéisation normalisée du dissociateur tissulaire. Cela permet d'homogénéisation uniforme et cohérente de tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuelle. Après dissociation des tissus, le broyat est filtré à travers des filtres de maille de nylon, ce qui élimine les étapes de centrifugation répétitives. En conséquence, l'isolement des mitochondries peut être effectuée en moins de 30 min. Ce protocole d'isolement rendement d'environ 2 x 10 10 mitochondries compétentes viables et la respiration de 0,18 ± 0,04 g (poids humide) de l'échantillon de tissu.

Introduction

Les mitochondries existent dans toutes les cellules du corps à l'exception des globules rouges et sont impliqués dans un grand nombre de processus cellulaires et métaboliques importantes 1-4. En raison de ces nombreuses fonctions, dommage mitochondrial peut avoir des effets néfastes 3. Afin d'étudier la fonction mitochondriale et la dysfonction plusieurs méthodes d'isolement des mitochondries ont été décrits. Les premiers comptes publiés de mitochondrial date de l'isolement à la 1940 5-8. Le premier essai a démontré documenté isolement des mitochondries par broyage du tissu hépatique dans un mortier puis par centrifugation dans une solution de sel à faible vitesse 5,8. Plus tard, d'autres groupes étendus sur la procédure d'origine et ont démontré fractionnement du tissu sur la base de la centrifugation différentielle 8.6. Ces premières méthodes ont constitué la base des techniques actuelles qui intègrent souvent homogénéisation et / ou centrifugation différentielle 9-15. Le nombre de homogenizatiet les étapes de centrifugation varie selon les protocoles. Ces étapes répétitives d'augmenter le temps pour l'isolement des mitochondries et finalement réduisent la viabilité. En outre, l'homogénéisation manuel peut provoquer des dommages et incohérentes mitochondriales résultats s'il n'est pas correctement contrôlée 10,16.

Récemment, nous avons utilisé l'homogénéisation et centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries pour la transplantation dans le tissu myocardique 17,18. Cette procédure d'isolement longue besoin d'environ 90 minutes et l'applicabilité clinique de cette méthode est donc limitée. Pour permettre une utilisation thérapeutique dans le traitement aigu et clinique chirurgicale nous avons mis au point un procédé d'isolement des mitochondries rapide qui peut être effectué en moins de 30 min.

Les principaux avantages de ce protocole sont que la dissociation des tissus uniformisée permet d'uniforme et cohérente homogénéisation du tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuel. Dans suppion, l'utilisation de la filtration différentielle à la place de la centrifugation différentielle élimine beaucoup de temps et répétition des étapes de centrifugation permettant l'isolement des mitochondries plus rapide compétentes hautement purifiés, viables et de respiration.

La capacité à isoler les mitochondries compétentes viables et de respiration en moins de 30 minutes permet d'applicabilité clinique. Ce protocole d'isolement a un potentiel pour une utilisation en chirurgie coronaire pontage aorto-greffe (CABG), et d'autres procédures thérapeutiques.

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Protocol

Préparation

  1. Préparez 1 M K-HEPES Stock Solution (ajuster le pH à 7,2 avec KOH).
  2. Préparer M K-EGTA Stock Solution (ajuster le pH à 8,0 avec KOH) 0,5.
  3. Préparez 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
  4. Préparez 1 M MgCl2 Solution mère.
  5. Préparation du tampon d'homogénéisation (pH 7,2), 300 mM de saccharose, 10 mM de HEPES-K, et 1 mM d'EGTA-K. Conserver à 4 ° C.
  6. Préparer le tampon de respiration 250 mM de saccharose, 2 mM de KH 2 PO 4, 10 mM MgCl 2, mM de tampon HEPES-K 20 (pH 7,2) et 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Conserver à 4 ° C.
  7. Préparer la solution mère 10x PBS en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, et 2,4 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre à double H 2 O distillée (pH 7,4).
  8. Préparer 1x PBS à la pipette 100 ml 10x PBS dans 1 L à double H 2 O. distillée
  9. Préparer subtilisine A Stock en pesant 4 mg de subtilisine A dansun tube à centrifuger de 1,5 ml. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  10. Préparer BSA Stock en pesant 20 mg de BSA dans un tube de 1,5 ml. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.

Isolement mitochondriale (figure 1)

  1. Immédiatement avant l'isolement, la subtilisine A se dissoudre dans 1 ml de tampon d'homogénéisation.
  2. Immédiatement avant l'isolement, la dissolution de BSA dans 1 ml de tampon d'homogénéisation.
  3. Recueillir deux échantillons de tissus frais en utilisant un poinçon 6 mm de l'échantillon de biopsie et magasin en 1x PBS dans un tube à centrifuger conique de 50 ml sur la glace.
  4. Transférez les deux poinçons 6 mm de tissu dans un tube de dissociation de C contenant 5 ml de glace froide homogénéisation tampon.
  5. Homogénéiser le tissu en plaçant le tube de dissociation de C sur la dissociateur de tissus et sélectionnez le cycle de l'isolement des mitochondries pré-établi (60 sec homogénéisation).
  6. Retirer le tube de dissociation de C à un seau à glace.
  7. Ajouter 250 pi de subtilisine A Solution mère à l'l'homogénat, mélanger par inversion et incuber l'homogénat sur de la glace pendant 10 min.
  8. Placer un filtre à mailles de 40 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
  9. Ajouter 250 ul de fraîchement préparé BSA Solution mère au filtrat et mélanger par inversion.
    Remarque: Ignorez cette étape si la détermination de la protéine mitochondriale est nécessaire.
  10. Placer un filtre de 40 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
  11. Placer un filtre de 10 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
  12. Transférer le filtrat à deux pré-réfrigéré 1,5 ml microtubes à centrifuger et centrifuger à 9000 g pendant 10 min à4 ° C.
  13. Retirer le surnageant et remettre en suspension et de combiner des pastilles dans 1 ml de tampon glacé respiration.

ATP Assay

Remarque: Pour déterminer l'activité métabolique des mitochondries isolées d'un dosage par luminescence de l'ATP peut être effectuée en utilisant un kit de dosage de l'ATP. Le protocole, réactifs et des étalons ont été fournis dans le kit de dosage. Un résumé de la procédure est décrite ci-dessous.

  1. Equilibrer les réactifs à la température ambiante.
  2. Préparer 10 mM ATP Stock Solution en dissolvant culot ATP lyophilisée en 1170 ul d'eau distillée deux fois. Rangez ATP Solution Stock standard et échantillons mitochondriaux préparés sur la glace.
  3. Ajouter 5 ml de solution tampon de substrat à un flacon de solution de substrat lyophilisé. Mélanger délicatement et placer dans l'obscurité.
  4. Ajouter 100 ul de tampon de respiration à tous les puits de, un fond noir opaque, plaque de 96 puits.
  5. Ajouter 10 ul de mitochondries des échantillons préparés dans chaque puits ofa noir, fond opaque, plaque de 96 puits. Note: Les échantillons sont étalés en triple. Inclure une ligne de normes et de trois puits pour le contrôle négatif (Respiration Buffer).
  6. Ajouter 50 ul de solution de mammifère de la lyse des cellules dans chaque puits, y compris des normes et des contrôles.
  7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min sur un agitateur orbital à 125 tours par minute.
  8. Au cours de l'incubation préparer normes ATP dans des concentrations de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM, et 0,0001 mM d'ATP à partir de la solution mère mM ATP 10. normes de magasins sur la glace.
  9. Après l'incubation, ajouter 10 ul de standards de l'ATP à des puits correspondant, comme indiqué sur la carte en forme de plaque. Note: Les normes sont effectuées en double.
  10. Ajouter 50 ul de la solution de substrat reconstitué dans chaque puits.
  11. Incuber la plaque à 37 ° C sur l'agitation pendant 5 min à 125 rpm.
  12. Ouvrez le logiciel Gen5 1.11 sur un ordinateur relié au spectrophotomètre.
  13. Sous "Créez un nouvel élément ", cliquez sur" Expérience ".
  14. Cliquez sur "protocole par défaut". Cliquez sur "Ok".
  15. Dans la colonne de gauche, sélectionnez "Protocole", puis "procédure".
  16. Sélectionnez "Delay". Situé à 0:10:00. Cliquez sur "Ok".
  17. Sélectionnez "Lire". Sélectionnez "Luminescence" de menu déroulant. Définissez les autres paramètres: Lire le type Endpoint, temps d'intégration 0: 01.00 MM: SS.SS, Filtre Règle 1, émission Hole, Optique Position Haut, sensibilité 100, Top sonde Décalage vertical 1.00 mm.
  18. Lorsque la plaque est prêt à être analysé, cliquez sur l'icône "Lire Plate" sur la rangée du haut. Cliquez sur "Lire". Lorsque le spectrophotomètre s'ouvre, placez la plaque sur le plateau, le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Une boîte avec la température va s'ouvrir. Cliquez sur "Lire". Remarque: Des valeurs plus élevées sont en corrélation avec les niveaux d'ATP accrus et l'activité métabolique plus élevé.

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Representative Results

A la figure décrivant les étapes de la procédure dans l'isolement des mitochondries des tissus à l'aide de dissociation et de filtration différentielle est représentée sur la Figure 1. Temps de procédure total est inférieur à 30 min.

Des échantillons de tissus ont été obtenus en utilisant un poinçon de biopsie de 6 mm. poids des tissus a été de 0,18 ± 0,04 g (poids humide). Le nombre des mitochondries isolées tel que déterminé par la taille des particules de comptage était de 2,4 x 10 x 0,1 10 ± 10 10 mitochondries de muscle squelettique et de 2,75 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitochondries de préparations de foie (Figure 2A). Pour permettre la comparaison nombre mitochondriale a également été déterminée par hématimètre. Nombre mitochondrial a été sous-estimée déterminée par hémocytomètre que 0,11 x 10 10 x 10 ± 0,04 10 mitochondries pour le muscle squelettique et 0,34 x 10 10 ± 0,09 x 10 10 mitochondries pour des préparations de foie (Figure 2A). Diamètre mitochondriale tel que déterminé par la taille des particules à base de compteur est représenté en figure 2B. Le tracé représentant montre les mitochondries isolées sont localisés sous un pic avec un diamètre moyen de 0,38 ± 0,17 um en accord avec les rapports précédents 7.

Protéine mitochondriale / g (poids humide) de tissu de départ comme déterminé par Bicinchoninic acide (BCA) dosage était de 4,8 ± 2,9 mg / g (poids humide) et 7,3 ± 3,5 mg / g (poids humide) pour le muscle squelettique et des échantillons de foie, respectivement (Figure 2C).

Mitochondrial pureté a été déterminée par microscopie électronique à transmission et est représentée sur la Figure 2D. Les mitochondries sont présentés à électrons dense avec moins de 0,01% est fracturé ou endommagé. La contamination par des particules non-mitochondriales est inférieure à 0,001%.

Viabilité mitochondriale a été déterminée par MitoTracker Rouge comme précédemment déprescrite 17,18. Nos résultats montrent que les mitochondries isolées de maintenir le potentiel de membrane (figures 3A - C).

ATP a été déterminée en utilisant un kit de dosage luminescent. Une carte en forme de plaque pour le dosage de l'ATP est représenté sur la Figure 4. Normes de l'ATP ont été étalées en double exemplaire. Échantillons mitochondriaux et les contrôles négatifs ont été étalées en triple exemplaire. Teneur en ATP était de 10,67 ± 4,38 nmol / mg de protéine mitochondriale et 14,83 ± 4,36 nmol / mg de protéine mitochondriale du muscle squelettique et des échantillons de foie respectivement (figure 3D).

La respiration mitochondriale a été évaluée à l'aide d'une électrode de type Clark comme décrit précédemment 17,18. Le taux de consommation d'oxygène des mitochondries était de 178 ± 17 nM 2 O / min / mg de protéine mitochondriale muscle squelettique et 176 ± 23 nM 2 O / min / mg de protéine mitochondriale préparations de foie. Respiratoire indice de contrôle (RCI) valeurs étaient de 2,45 ± 0,34 uned 2,67 ± 0,17 pour le muscle squelettique et la préparation des échantillons de foie respectivement (figure 3E). Ces résultats sont similaires à ceux rapportés dans nos études précédentes utilisant l'homogénéisation manuel et centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries 17-18.

Figure 1
Figure 1: schéma pour l'isolement des mitochondries des tissus à l'aide de dissociation et de filtration différentielle. (A) Transférer deux échantillons de biopsie des poinçons 6 mm à 5 ml d'homogénéisation tampon dans un tube de dissociation de C et homogénéiser les échantillons à l'aide du programme d'homogénéisation 1 min de la dissociateur de tissu. (B) Ajouter 250 pi de subtilisine Une solution stock à l'homogénat dans la dissociation C tube et incuber sur de la glace pendant 10 min (C). filtre l'homogénat à travers un pré -wetted 40 um filtre à tamis dans un tube à centrifuger conique de 50 ml sur la glace, puis ajouter 250 microlitres de BSA solution stock au filtrat. (D) Re-filtre le filtrat à travers un filtre à maillage de 40 um pré-mouillé dans un 50 ml centrifugeuse conique sur la glace. (E) Re-filtre le filtrat à travers un filtre à mailles de 10 um pré-mouillé dans un tube à centrifuger conique de 50 ml sur la glace. (F) Transférer le filtrat à 1,5 ml microtubes et centrifuger à 9000 g pendant 10 min à 4 ° C. (G) Retirer le surnageant et remettre en suspension et de combiner les granules mitochondriaux dans 1 ml de tampon de respiration. Temps de la procédure totale est inférieure à 30 min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. rendement mitochondriale et la pureté. (A) le nombre hémocytomètre et la taille des particules contre les mitochondries isolées à partir de 0,18 ± 0,04 g de tissu (poids humide) pour le muscle squelettique et le foie. (B) de la taille des mitochondries (mg / g) distribution telle que détectée par le compteur de la taille des particules (C). Protéine mitochondriale poids mg / g de tissu humide pour le muscle squelettique et le foie. (D) microscopie électronique en transmission image de mitochondries isolées. La barre d'échelle est de 100 nm. Les flèches indiquent une possible contamination par des particules mitochondriales non et les mitochondries endommagées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 < br /> Figure 3 mitochondrial viabilité. Microphotographies représentatives des mitochondries isolées (A) de moins de contraste de phase et éclairage (B et C) de moins de fluorescence, avec les mitochondries marquées par MitoTracker Rouge CMXRos. Les barres d'échelle sont de 25 um (A, B) et 5 pm (C). Ces images indiquent que les mitochondries maintien du potentiel de membrane.   Les flèches indiquent les mitochondries défaut potentiel ou de débris (D) ATP contenu nmol protéine mitochondriale / mg membrane comme déterminé par dosage de l'ATP et (E) RCI (état 3 / état ​​4) tel que déterminé par Clark électrode. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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. Figure 4 carte de plaque pour le dosage de l'ATP Cette carte de plaque illustre comment mettre en place des normes (A1 - A12), des échantillons de mitochondries (B1 - C6), et négatifs (C7 - C9) pour le dosage de l'ATP. Au cours de l'essai, 100 ul de tampon de respiration, 50 ul de solution de mammifère de la lyse cellulaire et 50 pi de solution de substrat reconstitué sont ajoutés à tous les puits (A1 - C9).

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Discussion

Pour isoler avec succès mitochondries qui utilisent ce protocole, il est essentiel de garder toutes les solutions et les échantillons de tissus sur la glace pour conserver la viabilité mitochondriale. Même lorsqu'il est maintenu sur la glace, les mitochondries isolées présenteront une diminution de l'activité fonctionnelle au fil du temps 19. Nous recommandons que toutes les solutions et les ajouts être pré-préparés. Nous avons pré-peser et stocker subtilisine A à 4 mg aliquotes de 1,5 ml microtubes et les stocker à -20 ° C. De même BSA est pré-pesé et stocké dans des aliquotes de 20 mg dans 1,5 ml microtubes qui peuvent être stockés à -20 ° C. Juste avant utilisation, les tubes sont retirés de -20 ° C et la subtilisine A et BSA sont dissous dans 1 ml de tampon d'homogénéisation pour l'utilisation dans la procédure d'isolement des mitochondries.

Deux poinçons de biopsie de tissu musculaire squelettique obtenus en utilisant un poinçon de biopsie de 6 mm fournir mitochondries suffisantes pour une utilisation dans des procédures cliniques et chirurgicaux pour des interventions thérapeutiques 17-18. Pour estimer le nombre de mitochondries, nous avons utilisé deux méthodes, hémocytomètre et la taille des particules comptage. L'utilisation de la taille des particules de comptage est recommandée. Le compteur de la taille de particule utilise l'impédance électrique pour mesurer le volume de particules passant à travers une ouverture d'une taille définie. Le compteur de la taille des particules est coûteux, mais fournit des estimations précises et fiables et qui est indépendante utilisateur. Nombre mitochondrial estimée par hémocytométrie est plus économique. Nos études ont montré que ce procédé fournit des estimations de variables qui sont d'environ un ordre de grandeur inférieur à celui obtenu en utilisant un compteur de la taille des particules. Nous avons également noté que les chiffres obtenus par hématimètre sont fortement tributaires de l'utilisateur. Nous suggérons que, pour assurer des estimations cohérentes tous les chefs en utilisant un hématimètre doivent être effectuées par une seule personne.

Nous avons identifié les trousses de dosage d'ATP à être utile pour déterminer la fonction mitochondriale. Le kit fournit tout r nécessaireeagents et fournit un procédé simple et rapide pour la détermination de l'activité métabolique des mitochondries isolées. Le dosage de l'ATP fournit des résultats similaires à ceux obtenus à l'aide d'une électrode de type Clark et est compatible avec la précédente analyse de données 20 à 21 donc.

Un avantage majeur de notre protocole d'isolement des mitochondries est qu'il permet l'isolement d'un rendement élevé de viabilité, la respiration des mitochondries compétentes libres de contamination en moins de 30 min. Filtration différentielle à la place de centrifugation différentielle réduit considérablement le temps de la procédure. D'autres protocoles intègrent plusieurs étapes de centrifugation avec le temps global d'isolement étant de 60 min à 100 min 13-17. Un autre avantage de ce protocole est que l'homogénéisation des tissus est normalisé. Le dissociateur de tissu commercial offre un cycle normalisé et d'obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ceci est en contraste avec homogénéisation manuel qui est soumise à la variabilité de l'utilisateur etincohérence. Notre méthode pour l'isolement rapide des mitochondries en utilisant la dissociation du tissu et la filtration différentielle fournit un laps de temps d'isolement compatible pour une intervention thérapeutique clinique chirurgicale et 17,18.

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Disclosures

Tous les animaux ont été traités conformément aux directives institutionnelles actuelles. Nous n'avons pas d'intérêts financiers concurrents de divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-103542, et le Prix Trailblazer émérite de la Fondation de recherche en anesthésie BCH à la PAC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

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References

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Biologie cellulaire Numéro 91 Interventions chirurgicales les techniques d'enquête les mitochondries l'isolement la filtration l'homogénat la dissociation des tissus la transplantation

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration
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