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Biology

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Abstract

Métodos de isolamento mitocondriais descritas anteriormente, utilizando centrifugação diferencial e / ou centrifugação em gradiente de Ficoll exigir de 60 a 100 min para completar. Descreve-se um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de mamífero, utilizando um tecido comercial Dissociator filtração e diferencial. Neste protocolo, homogeneização manual é substituído por ciclo de homogeneização padronizada do Dissociator tecido. Isto permite uma uniforme e consistente homogeneização de tecido que não é facilmente conseguido com a homogeneização manual. Após a dissociação de tecidos, o produto homogeneizado é filtrado através de filtros de nylon de malha, o que elimina os passos de centrifugação repetitivas. Como resultado, o isolamento mitocondrial pode ser realizada em menos de 30 min. Este protocolo de isolamento rende aproximadamente 2 x 10 10 mitocôndrias competentes viáveis ​​e respiratória de 0,18 ± 0,04 g (peso húmido) de uma amostra de tecido.

Introduction

As mitocôndrias existem em todas as células do corpo, excepto as células vermelhas do sangue e são envolvidos num grande número de importantes processos celulares e metabólicas 1-4. Devido a estas várias funções, dano mitocondrial pode ter efeitos prejudiciais 3. A fim de investigar a função mitocondrial e disfunção de vários métodos de isolamento mitocondriais foram descritos. Os primeiros relatos publicados de data isolamento mitocondrial à década de 1940 5-8. A primeira tentativa documentada demonstrado isolamento mitocondrial por trituração do tecido do fígado, num almofariz, seguido por centrifugação de uma solução de sal de 5,8 a baixa velocidade. Mais tarde, outros grupos expandiu o procedimento original e demonstrou fraccionamento de tecido com base na centrifugação diferencial 6-8. Estes métodos iniciais formaram a base das técnicas atuais que muitas vezes incorporam homogeneização e / ou centrifugação diferencial 9-15. O número de homogenizatiem passos de centrifugação e varia entre protocolos. Estes passos repetitivos aumentar o tempo para o isolamento mitocondrial e, finalmente, reduzir a viabilidade. Além disso, a homogeneização manual pode causar danos e inconsistentes resultados mitocondriais se não for devidamente controlado 10,16.

Recentemente, foi utilizado homogeneização e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias para transplante no tecido do miocárdio 17,18. Este procedimento de isolamento demorado necessário cerca de 90 min e a aplicabilidade clínica deste método era, portanto, limitado. Para possibilitar a utilização terapêutica aguda em tratamentos clínicos e cirúrgicos, desenvolvemos um procedimento de isolamento mitocondrial rápido que pode ser realizada em menos de 30 min.

Os principais benefícios deste protocolo são de que a dissociação do tecido padronizado permite uniforme e consistente homogeneização do tecido que não é facilmente alcançada com homogeneização manual. Em additião, o uso de filtração diferencial em lugar de centrifugação diferencial elimina demorado e passos de centrifugação repetitivas que permitam o isolamento de mitocôndrias mais rápida competentes altamente purificadas, viáveis ​​e respiratória.

A capacidade de isolar mitocôndrias competentes viáveis ​​e de respiração, em menos de 30 min permite a aplicabilidade clínica. Este protocolo de isolamento tem potencial para uso em cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) e outros procedimentos terapêuticos.

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Protocol

Preparação

  1. Prepare 1 M K-HEPES da Solução (ajustar o pH para 7,2 com KOH).
  2. Prepare 0,5 M K-EGTA da Solução (ajustar o pH para 8,0 com KOH).
  3. Prepare 1 M KH 2 PO 4 da solução.
  4. Prepare 1 M MgCl2 da solução.
  5. Preparar tampão de homogeneização (pH 7,2) 300 mM de sacarose, 10 mM de K-HEPES, e 1 mM de K-EGTA. Armazenar a 4 ° C.
  6. Preparar tampão de respiração de 250 mM de sacarose, 2 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de MgCl2, 20 mM de K-HEPES (pH 7,2) e 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Armazenar a 4 ° C.
  7. Prepare PBS 10x da solução por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH 2 PO 4 em 1 L duplo H2O destilada (pH 7,4).
  8. Prepare 1x PBS por pipetagem de 100 ml de 10x PBS em 1 L duplo H2O destilada
  9. Prepare a Subtilisina A Stock por pesagem de 4 mg de Subtilisina A empara um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso.
  10. Preparar por pesagem da BSA a 20 mg de BSA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C até o uso.

Isolamento mitocondrial (Figura 1)

  1. Imediatamente antes do isolamento, dissolver Subtilisina A em 1 ml de tampão de homogeneização.
  2. Imediatamente antes do isolamento, dissolver de BSA em 1 ml de tampão de homogeneização.
  3. Recolher duas amostras de tecido fresco utilizando um perfurador 6 milímetros amostra de biópsia e armazenar em 1x PBS num tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
  4. Transferir os dois perfuradores 6 mm de tecido para um tubo de dissociação C contendo 5 ml de tampão de homogeneização arrefecida com gelo.
  5. Homogeneizar o tecido, ajustando o tubo de dissociação C no Dissociator tecido e selecione a pré-definido ciclo isolamento mitocondrial (60 seg homogeneização).
  6. Retire o tubo de dissociação C para um balde de gelo.
  7. Adicionar 250 mL de uma solução de estoque Subtilisin aohomogeneizado, misturar por inversão e incubar o homogeneizado em gelo durante 10 min.
  8. Colocar um filtro de malha de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
  9. Adicionar 250 ul de BSA preparada de fresco da Solução ao filtrado e misturar por inversão.
    Nota: Ignore essa etapa se a determinação da proteína mitocondrial é necessária.
  10. Colocar um filtro de 40 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
  11. Colocar um filtro de 10 um para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo, e pré-molhada com o filtro de tampão de homogeneização e filtrar o homogenato para o tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo.
  12. Transferir o filtrado para dois pré-refrigerada tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugue a 9000 xg durante 10 min a4 ° C.
  13. Remover o sobrenadante e re-suspender e combinar pelotas em 1 ml de gelo frio Respiração Buffer.

ATP Assay

Nota: Para determinar a actividade metabólica da mitocôndria isolada de um ensaio de luminescência de ATP pode ser realizada utilizando um kit de ensaio de ATP. O protocolo, e os reagentes foram os padrões fornecidos no kit de ensaio. Um resumo do processo é descrito abaixo.

  1. Equilibrar reagentes para RT.
  2. Preparar 10 mM de ATP da solução através da dissolução de ATP sedimento liofilizado em 1170 mL de água duplamente destilada. Guarde ATP padrão da solução e amostras mitocondriais preparadas no gelo.
  3. Adicionar 5 ml de solução de tampão de substrato para um frasco de solução de substrato liofilizado. Misture delicadamente e coloque no escuro.
  4. Adicionar 100 ul de tampão de respiração de todos os poços de uma preta, de fundo opaco, placa de 96 poços.
  5. Adicionar 10 ul de mitocôndrias das amostras preparadas a cada poço ofa preta, de fundo opaco, placa de 96 poços. Nota: As amostras são colocadas em placas em triplicado. Inclua uma linha para os padrões e três poços para o controle negativo (Respiração Buffer).
  6. Adicionar 50 ul de solução de lise de células de mamíferos a todos os poços, incluindo padrões e controlos.
  7. Incubar a placa a 37 ° C por 5 min em um agitador orbital a 125 rpm.
  8. Durante a incubação preparar padrões de ATP em concentrações de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM e 0,0001 mM de ATP a partir de ATP 10 mM da solução. Padrão das lojas no gelo.
  9. Após a incubação, adicionar 10 ul de ATP padrão aos poços correspondentes como indicado na placa de mapa. Nota: Os padrões são realizadas em duplicata.
  10. Adicionar 50 ul da solução de substrato a cada poço reconstituído.
  11. Incubar a placa a 37 ° C num agitador orbital durante 5 minutos a 125 rpm.
  12. Abra o software Gen5 1.11 em um computador ligado com o espectrofotômetro.
  13. Em "Criar um novo item ", clique em" Experiment ".
  14. Clique em "protocolo padrão". Clique em "Ok".
  15. Na coluna da esquerda, selecione "Protocolo", depois em "Procedimento".
  16. Selecione "Delay". Defina a 0:10:00. Clique em "Ok".
  17. Selecione "Ler". Selecione "luminescência" do menu suspenso. Ajuste outras definições para o seguinte: Leia tipo Endpoint, Tempo de Integração 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Sets 1, Emissão Hole, Ótica posição, Sensibilidade 100, Top Probe Desvio vertical 1,00 milímetros.
  18. Quando a placa está pronta para ser analisada, clique no ícone "Leia Plate" na linha superior. Clique em "Read". Quando o espectrofotômetro abrir, colocar a placa na bandeja com poço A1 no canto superior esquerdo. Uma caixa com a temperatura vai abrir. Clique em "Read". Nota: Os valores mais elevados correlacionam-se com os níveis de ATP aumento e maior atividade metabólica.

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Representative Results

A figura delinear os passos processuais no isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial está representada na Figura 1. Tempo processual total é inferior a 30 min.

As amostras de tecido foram obtidas utilizando um punch de 6 mm. O peso do tecido era de 0,18 ± 0,04 g (peso molhado). O número de mitocôndrias isoladas, como determinado por contagem de tamanho de partícula foi de 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitocôndrias para o músculo esquelético e 2,75 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitocôndria para preparações de fígado (Figura 2A). Para permitir a comparação número mitocondrial, também foi determinado em hemocitômetro. Número mitocondrial foi subestimada, conforme determinado em hemocitômetro como 0,11 x 10 10 ± 0,04 x 10 10 mitocôndria para o músculo esquelético e 0,34 x 10 10 ± 0,09 x 10 10 mitocôndria para preparações de fígado (Figura 2A). Diâmetro mitocondrial, tal como determinado pelo tamanho da base do contador de partículas é apresentada na Figura 2B. O traçado representativo mostra as mitocôndrias isoladas são localizados sob um pico com diâmetro médio de 0,38 ± 0,17 mM de acordo com relatórios anteriores 7.

Proteína mitocondrial / g (peso húmido), a partir de tecidos tal como determinado por ácido bicinconínico (BCA) do ensaio foi de 4,8 ± 2,9 mg / g (peso húmido) e 7,3 ± 3,5 mg / g (peso húmido) para o músculo esquelético e de amostras de fígado, respectivamente (Figura 2C).

Pureza mitocondrial foi determinada por meio de microscopia electrónica de transmissão e é mostrado na Figura 2D. As mitocôndrias são mostradas para ser electrão denso, com menos de 0,01% a ser fracturado ou danificado. A contaminação por partículas não-mitocondrial é inferior a 0,001%.

Viabilidade mitocondrial foi determinada por MitoTracker Red como anteriormente descrito 17,18. Os nossos resultados mostram que as mitocôndrias isoladas manter potenciais de membrana (Figuras 3A - C).

ATP foi determinado utilizando um kit de ensaio luminescente. Um mapa da placa para o ensaio de ATP é mostrado na Figura 4. Padrões de ATP foram colocadas em placas em duplicado. Amostras mitocondrial e controles negativos foram semeadas em triplicata. Teor de ATP foi de 10,67 ± 4,38 nmol / mg de proteína mitocondrial e 14,83 ± 4,36 nmol / mg de proteína mitocondrial para o músculo esquelético e de amostras de fígado, respectivamente (Figura 3D).

A respiração mitocondrial foi avaliada utilizando um tipo de eletrodo de Clark, como descrito anteriormente 17,18. Taxa de consumo de oxigênio mitocondrial foi de 178 ± 17 nM O 2 / min / mg de proteína mitocondrial para o músculo esquelético e 176 ± 23 Nm O 2 / min / mg de proteína mitocondrial para preparações de fígado. Índice de controle respiratório valores (DIC) foram 2,45 ± 0,34 umd 2,67 ± 0,17 para o músculo esquelético e preparações de amostras de fígado, respectivamente (Figura 3E). Estes resultados são semelhantes aos relatados em nossos estudos anteriores usando homogeneização manual e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias 17-18.

Figura 1
Figura 1 esquema para o isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial. (A) transferência de dois 6 milímetros socos amostra de biópsia para 5 ml de homogeneização Tampão em um tubo de dissociação C e homogeneizar as amostras utilizando o programa de homogeneização 1 min do Dissociator tecido. (B) Adicionar 250 ul Subtilisina Uma solução de estoque de homogeneizado na dissociação tubo C e incubar em gelo durante 10 min. (C) Filtrar o homogeneizado através de um pré -wetted 40 um filtro de rede em um tubo de centrífuga de 50 mL cónico em gelo e, em seguida, adicionar 250 ul de solução de reserva de BSA ao filtrado. (D) Re-filtro do filtrado através de um filtro de malha pré-humedecida em 40 um de 50 ml centrífuga cónico em gelo (E). Re-se o filtrado através de filtro de um filtro de pré-humedecido de malha de 10 um num tubo de centrífuga cónico de 50 ml em gelo. (f) Transferir o filtrado para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 9000 xg durante 10 min a 4 ° C. (L) Remover o sobrenadante e re-suspensão e misturar os peletes mitocondriais em 1 ml de Tampão de respiração. O tempo total de procedimento é menos de 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. mitocondrial rendimento e pureza. (A) Número de hemocitómetro e tamanho de partícula contador mitocôndrias isoladas de 0,18 ± 0,04 g de tecido (peso molhado) para o músculo esquelético e fígado. (B) tamanho mitocondrial (mg / g) de distribuição como detectado por contador de tamanho de partícula. (C) proteína mitocondrial mg / g de tecido de peso fresco para o músculo esquelético e fígado. (D) Microscopia Eletrônica de Transmissão imagem de mitocôndrias isoladas. Barra de escala é de 100 nm. As setas indicam a possível contaminação por partículas não mitocondriais e mitocôndrias danificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 < br /> Figura 3 mitocondrial viabilidade. Fotomicrografias representativas de mitocôndrias isoladas (A) sob iluminação de contraste de fase e (B e C) sob fluorescência, com mitocôndrias marcadas com MitoTracker Red CMXRos. As barras de escala são 25 um (A, B) e 5 um (C). Estas imagens indicam que o potencial de membrana mitocondrial mantida.   As setas indicam a mitocôndria sem membrana (D) ATP conteúdo potencial ou detritos nmol / mg de proteína mitocondrial, como determinado pelo ensaio de ATP e (E) RCI (estado 3 / estado 4), conforme determinado pelo eletrodo de Clark. Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

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. Figura mapa 4 Placa de ensaio ATP Este mapa ilustra placa como configurar padrões (A1 - A12), as amostras de mitocôndrias (B1 - C6), e controles negativo (C7 - C9) para o ensaio de ATP. Durante o ensaio, 100 ul de tampão de respiração, 50 ul de solução de lise de células de mamífero e 50 ul de solução de substrato reconstituído são adicionados a todos os poços (A1 - C9).

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Discussion

Para isolar com sucesso mitocôndrias que utilizam este protocolo é fundamental para manter todas as soluções e amostras de tecido em gelo para preservar a viabilidade mitocondrial. Mesmo quando mantidos em gelo, as mitocôndrias isoladas irá exibir uma diminuição na actividade funcional ao longo do tempo 19. Recomendamos que todas as soluções e adições ser pré-preparado. Nós pré-pesar e armazenar Subtilisina A em alíquotas de 4 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e armazená-las a -20 ° C. Similarmente BSA é pré-pesados ​​e armazenados em aliquotas de 20 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga que podem ser armazenadas a -20 ° C. Imediatamente antes de utilizar os tubos são removidos de -20 ° C e Subtilisina A e BSA são dissolvidos em 1 ml de tampão de homogeneização para utilização no processo de isolamento mitocondrial.

Dois socos biópsia de tecido muscular esquelético obtido usando uma biópsia 6 milímetros fornecem mitocôndrias suficientes para utilização em procedimentos clínicos e cirúrgicos para intervenções terapêuticas 17-18. Para estimar o número de mitocôndrias que usamos dois métodos, hemocitômetro e tamanho de partícula de contagem. Recomenda-se o uso de tamanho de partícula de contagem. O contador de tamanho de partícula impedância eléctrica utiliza para medir o volume de partículas que passam através de uma abertura de um tamanho definido. O contador de tamanho de partícula é caro, mas fornece estimativas precisas e fiáveis ​​e é usuário independente. Número mitocondrial estimado pela hemocytometry é mais econômico. Os nossos estudos demonstraram que este método fornece estimativas de variáveis ​​que são aproximadamente uma ordem de grandeza menor do que a obtida utilizando um contador de tamanho de partícula. Também se observou que as contagens obtidas pelo hemocitómetro são altamente dependentes do utilizador. Sugerimos que, para garantir estimativas consistentes todas as contagens utilizando um hemocitômetro deve ser realizada por uma pessoa.

Encontraram-se kits de ensaio de ATP para ser útil para a determinação da função mitocondrial. O kit fornece todos r necessárioeagents e proporciona um método simples e rápido para a determinação da actividade metabólica das mitocôndrias isoladas. O ensaio ATP fornece resultados semelhantes aos obtidos com um eletrodo do tipo Clark e, portanto, é compatível com a análise de dados anterior 20-21.

Uma vantagem importante do nosso protocolo de isolamento mitocondrial é que ela permite que o isolamento de um rendimento elevado, de mitocôndrias de respiração competentes viáveis ​​livres de contaminação, em menos de 30 min. Filtração diferencial no lugar de centrifugação diferencial reduz significativamente o tempo de procedimento. Outros protocolos de incorporar vários passos de centrifugação, com tempo total de isolamento sendo de 60 min a 100 min 13-17. Outra vantagem deste protocolo é que a homogeneização do tecido é padronizado. O Dissociator tecido comercial fornece um ciclo padronizado e produz resultados consistentes e reprodutíveis. Isto está em contraste com a homogeneização manual que é sujeito a variabilidade do usuário einconsistência. O nosso método para o isolamento rápido de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial proporciona um período de tempo compatível com isolamento para intervenção terapêutica médica e cirúrgica 17,18.

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Disclosures

Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes institucionais vigentes. Não temos interesses financeiros competitivos para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL- 103542, e Distinguished Trailblazer Award O BCH da Fundação Anesthesia Research para CAP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

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References

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Biologia Celular Edição 91 os procedimentos cirúrgicos operativo técnicas de investigação as mitocôndrias o isolamento filtração homogeneizado dissociação de tecidos transplante

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial
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