ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Microdissection כבר מועסק באופן נרחב לבדיקה של DNA, RNA וחלבונים בתוך רקמה. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) הוא השיטה הנפוצה ביותר, אך טכניקה חדשה כרסום, mesodissection, זמינה לאחרונה. אנו מדגימים מיצוי RNA מפרפין פורמלין mesodissected הקבוע שקופיות רקמות גלומות של גרנולומות חפת Mycobacterium.
Abstract
Microdissection כבר בשימוש לבדיקה של רקמות בDNA, RNA, ורמות חלבון במשך למעלה מעשור. לייזר מיקרוסקופית הלכידה (LCM) היא טכניקת microdissection הנפוצה ביותר בשימוש כיום. בטכניקה זו, לייזר משמש כדי להמס קרום תרמופלסטיים כי overlies קטע רקמה מיובש 1 focally. מרוכבים קטע רקמה אז הרים והפריד מן הקרום. למרות שטכניקה זו יכולה לשמש בהצלחה לבדיקת רקמות, זה זמן רב ויקר. יתר על כן, על סיומו המוצלח של נהלי שימוש בטכניקה זו דורש שימוש בליזר, ובכך להגביל את השימוש בו. גישת microdissection חדשה יותר זולה ומעשית הנקראת mesodissection היא פתרון אפשרי לחסרונות של LCM. טכניקה זו מעסיקה את מערכת MESO-1/MeSectr לטחנת הרקמה הרצויה מדגימת רקמת שקופיות רכובים בזמן במקביל מחלק וaspirating נוזל לשחזר את דגימת הרקמה הרצויה לתוךקצת טחנה מתכלה. לפני תהליך הנתיחה מתחיל, המשתמש מיישר פרפין הקבוע פורמלין המוטבע (FFPE) להחליק עם hematoxylin ו eosin מוכתם שקופיות התייחסות (H & E). לאחר מכן, מפעיל הוספת הערות לאזור הנתיחה הרצויה וממשיך לנתח את הקטע המתאים. התכנית יוצרת תמונת ארכיון של הנתיחה. היתרון העיקרי של mesodissection הוא משך הזמן הקצר הנדרש כדי לנתח שקופיות, לוקח ממוצע של עשר דקות מלהגדיר לדגום דור בניסוי זה. בנוסף, המערכת היא באופן משמעותי יותר חסכונית וידידותי למשתמש. חסרון קל הוא שזה לא מדויק כמו לייזר מיקרוסקופית הלכידה. במאמר זה אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי לחלץ RNA משקופיות מגרנולומות FFPE הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium (MTB).
Introduction
דגימות באופן מסורתי microdissected ידני משתי רקמות או שקופיות באמצעות מחט ואזמל כולה. הדבר מחייב הפרדה ברורה בין קטע הרקמה של עניין וחתכים רקמות הסובבים 2. עם ההתקדמות הנוכחית בטכנולוגיית אפיון מולקולרית, יש כבר צורך הולך וגובר להערכת רקמות ברמה התאית. בשל המגבלות של microdissection הידני, טכניקות כולל LCM הוקמו כדי לאפשר דיוק בידוד גדול יותר. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מסוגי תאים שונים ושקופיות, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו למבחנים במורד כגון פרופיל ביטוי גנים. למרות שמאוד יעיל למבחנים במורד הזרם, LCM אינו נטול מגבלות. ראשית, LCM הוא תהליך יקר וזמן רב. בנוסף, בשל האופי בלתי יציב של רנ"א, שהוא לעתים קרובות מאתגר להשיג RNA איכות גבוהה מדגימות LCM 2. בשל disadvantages של LCM, התפתחויות חדשות בתחום טכנולוגית microdissection עדיין דרושים כדי להפוך אותו לנגיש יותר למספר גדול יותר של חוקרים באופן רגיש במחיר סביר ובזמן.
כגון קידום אחד בטכנולוגית microdissection זמינה כעת הוא טכניקה המכונה mesodissection. בטכניקה זו מכונה משמשת לטחנת קטע הרקמה המבואר של העניין וaspirates אותו לקצת טחנה מתכלה 3. בשלב בא, מדגם זה יכול להישאף לתוך צינור איסוף ומשמש ליישומים במורד הזרם. יתרונותיה של מערכת זו הם שזה הרבה פחות יקר והזמן רגיש. מניסיוננו, המערכת מאפשרת לנתיחה של קטע רקמת גרנולומה ריאות בעשר דקות. מצד השני, LCM המסורתי עשוי לדרוש שעות כדי להשלים את התהליך. המערכת מאפשרת למפעיל כדי לטעון שקופיות התייחסות לשימוש כהשוואה, כמו גם כלי לביאור. בנוסף דו"ח מופק ה מתווהשטח E של השקופית שהיה גזור. ישנם שני חסרונות עיקריים לmesodissection. למרות יעיל בחילוץ תאים מרובים, זה מאתגר לבודד את תא בודד. בנוסף, הדיוק של התמונה שנוצרה הוא לא ברור כמו אם באמצעות מיקרוסקופים הדמיה אחרים.
שחפת (TB) היא רוצח גדול למחל זיהומיות של האנושות ברחבי העולם ותוצאות מזיהום עם MTB. ברוב של אנשים שנחשפו לאירוסולים של MTB, הזיהום מוגבל רדום. בלפחות 10 מיליון אנשים מדי שנה, התוצאה הוא מחלת שחפת פעילה 4. במהלך הזיהום לטנטי, MTB כלול בתוך נגעי ריאות פתולוגיים המכונים גרנולומות. מכאן זה כבר טען כי התוצאה של זיהום MTB יוחלט ברמה של גרנולומה 5.
כאן אנו מדגימים כיצד mesodissection יכול לשמש כדי microdissect גרנולומות נגרמת על ידי MTB. השקופיות המשמשותהם מרקמת הריאה FFPE מקופי רזוס נגוע. לצורך הפגנה זו, אנו לנתח גרנולומות בשלמותם. אנחנו גם מדגימים כי RNA יכול להיות מופק מהרקמות התאוששו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות רקמה מדגימות שונות אחרות ולאחר מכן משמשת למגוון רחב של מבחני במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כיול Mesodissection כלי עם 2iD תוכנת הדמיה
תוכנת ההדמיה 2iD תהיה המכונה גם את התוכנה או התכנית לשארית של מאמר זה. יש צורך בצעד זה כדי לעקוב בצורה נכונה את התמונה, כמו גם ליישר מסגרות שקופיות מרובות.
- הפעל מכשיר ומחשב.
- תוכנה פתוחה ולבחור באפשרות "מכשיר כיול".
- לכייל נסיעות שלב על ידי השימוש בג'ויסטיק. הזז במה לעמדה השמאלית עליונה. "סט" עיתונות תחת שלב 1 בתכנית.
- הזז במה כדי להוריד את מיקום נכון. "סט" עיתונות תחת שלב 2 בתכנית.
- לכייל את השאיפה על ידי הלחיצה הראשונה "Z-כפתור" להעלות מכלול ראש. לחץ על לחצן "דופק לשאוב" וכפתור "נתיחה" בג'ויסטיק עד מוט שליטת הבוכנה מגיעים למיקום עליון. "סט" עיתונות תחת שלב 3 של תכנית.
- לחץ על "איפוס ולשאוב8221 #; כפתור. ברגע שהבוכנה עוצרת ב" הסט "התחתון תפקיד העיתונות בשלב 4.
- לחץ על הכרטיסייה "הסולם".
- הנח שליט כיול בצד ריק.
- פוקוס מיקרוסקופ במידת צורך.
- לצייר קו בין שני הברים בקנה מידה באמצעות עכבר.
- הזן את מרחק תיבה שהכותרת לחץ על כפתור שלב 2. "מחשוב" ב.
- לחץ על כרטיסיית "כוונת". הפעל מהירות מנוע ל1.
- הכנס xScisor להרכבת ראש. הרכבה נמוכה ראש למצב מוכן Z-ציר על ידי לחיצה על כפתור "Z-ציר". הערה: מכלול הראש הוא המבנה הגדול בחלק העליון של המכשיר לנתיחה. XScisor יהיה מכונה קצת טחנה מתכלה לשארית של מאמר זה.
- לחץ על "נתיחה לעסוק" כפתור בג'ויסטיק. הערה: לחצן זה ממוקם בחלק העליון של הג'ויסטיק.
- הגדרת מרכז הסיבוב מבחינה ויזואלית. כדי לעשות זאת, להעביר את מרכז הכוונת על מרכז הסיבוב באמצעות מגדירפרמטר ד בשלב 1 של תכנית. השתמש בחצים מעלה ומטה ב" x "וברים" ציר y "כדי להתאים את הפיקסלים כדי ליישר כוונת. לחץ על הכרטיסייה "נעשתה".
- לחץ על סמל "בית". הערה: זה מיוצג על ידי תמונת בית ממוקמת בפינה הימנית העליונה.
2. יצירת תמונת סימוכין
- הנח שקופיות H & E על במה. הנח כיסוי אטום על גבי שקופיות. כונן את המכשיר על ידי הזזת הג'ויסטיק לאזור הרצוי של שקופית H & E. שמור את התמונה שנוצרה. הערה: או כרטיסיית "ללכוד התייחסות" או הכרטיסייה "לנתח" יכולה לשמש כדי להשלים שלב זה.
3. יישר רקמות לנתיחה
- לחץ על האפשרות "לנתח רקמות" במסך הבית.
- מלא את "המפעיל", "מספר לנתיחה הצטרפות", "מספר הצטרפות התייחסות", "מספר ברקוד xScisor," & #8220; מספר הרבה נוזל לנתיחה "," גודל xScisor "ו" תיאור "בכרטיסייה" הגדרות ".
- לחץ על הלשונית "מוצא רקמות".
- היבוא שנשמר בעבר תמונת התייחסות.
- מניחים שקף FFPE בלא כתם של 5 עובי מיקרון על הבמה. הזז במה לאותו אזור כאחד מתואר בתמונה הייחוס. לחץ על כרטיסייה "הכנס תמונה".
- לחץ על כרטיסייה "ליישר". השתמש בעכבר והחצים הקשורים כדי ליישר את תמונת התייחסות לתמונה ללא רבב.
4. סמן בשקופיות
- לחץ על הלשונית "ביאורים".
- השתמש בעכבר כדי לצייר עיגול מסביב לאזור הרצוי של השקופית שיהיה microdissected.
5. טען Bit מתכלים מיל
- מלא קצת טחנה מתכלה עם חיץ רצוי, כאן חיץ PKD, על ידי משיכת הבוכנה מעלה ומטה בתנועת נוזל מספר פעמים. הקפד להוציא אווירבועות.
- להעלות את ציר Z-על ידי לחיצה על "כפתור Z-ציר".
- טען קצת טחנה מתכלה למכונה. עושה זאת על ידי הזזה קצת הטחנה מתכלה לתוך החלק העליון של המכונה, כך שהקו הלבן על קווי מכשיר עם הקו השחור על קצת הטחנה מתכלה. לחץ על לחצן "איפוס שאיפה" לאפשר לבוכנה שהורידה למיקום הנכון. הערה: זה צריך להיות קל להחליק קצת הטחנה מתכלה. אם זה לא, ודא שהחריצים מיושרים כהלכה.
- Z-ציר נמוך יותר על ידי שוב לחיצה על כפתור "ציר ה-Z".
6. לנתח רקמות (איור 4)
- פתח כרטיסייה "לנתח".
- הפעל מהירויות מנוע ושאיפה ל1.
- סמן תיבה "מעקב מופע". שים לב: זה מאפשר למשתמש לדמיין את האזור גזור בתהליך לנתיחה.
- ברגע מוכן לנתח, תמשיך להחזיק "לעסוק" כפתור, כמו גם "לשאוב & #8221; כפתור בעת הזזת הג'ויסטיק בכיוון השעון כדי לנתח רקמות.
- תמשיך לנתח בכיוון השעון עד לשאוב הוא כרטיסייה "מלאה" הופכת לאדומה.
7. ריק והסר Bit מתכלים מיל
- הנח צינור microfuge 0.5 μl תחת קצה קצת הטחנה מתכלה.
- מוט שליטה "שאיפה" הקש במהירות כדי להוציא דגימה לתוך צינור microfuge.
- לחץ עם כוח מוגבר כדי להוציא קצת טחנה מתכלה משומשת.
- יש לשטוף בר רקמה על ידי משיכת בוכנה בחזרה. לדחוף את הבוכנה קדימה להביע את המדגם שנותר לקצת טחנה מתכלה. שבר הרקמה עכשיו יהיה כלול בתוך צינור microfuge.
8. דוגמא Lyse עם proteinase K עיכול ואחרי טיפול בחום
- הוספת 70 pH TE μl 8.5 המכיל 5 מיקרוגרם של proteinase K להתאושש דגימת רקמה.
- הנח מדגם לתוך תנור-ייקר לתכנות.
- עיכול מלא באמצעות מחמם שייקר לתכנות בהגדרה הבאה: 60 ˚ C למשך 30 דקות ב 1,500 סל"ד; 82 ˚ C ל15 דקות ב 1,500 סל"ד; ו25 ˚ C 1 דקות ב450 סל"ד. המדגם הוא מוכן ליישומים במורד הזרם עכשיו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הנ"ל מראה כיצד להשתמש בטכניקת mesodissection חדשה כדי לחלץ RNA משקופיות רקמת FFPE. היעילות של פרוטוקול זה מוצגת באמצעות שקופיות FFPE של גרנולומות ריאות מNHP נגועה בMTB בשלבי התולעת שונים. איורים 1-3 הם תמונות של מכשיר. איור 4 מתאר כיצד תהליך הנתיחה מתרחש והתמונה הנוצרת שנוצרה על ידי תוכנה. הטבלה 1 מציג את התוצאות של מיצוי RNA עם גרנולומה מNHP בכל מדינה ומדינה של תולעת. RNA היה מוגבר ומטוהר, כדי לאפשר ראיות RT-PCR של 16s (לוחות 2-4). הטבלה 4 מאשרת את נוכחותו של 16s למקטע ריבוזומלי MTB, ובכך MTB, בדגימות microdissected.
איור 1. תמונה של מכשיר mesodissection כולל ג'ויסטיק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מבט קרוב יותר על מכשיר mesodissection. "Z-ציר" כפתור, המהירות "המנוע" וידיות מהירות "שאיפה" מוצגות בצד השמאל של התמונה. "כפתור aspirator האיפוס" ו "הפעלה / כיבוי" הכפתור מוצגים בצד הימני של התמונה. שלב השקופיות הוא בחלק העליון של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
e = "תמיד"> 
איור 3. מבט קרוב יותר על הג'ויסטיק. ג'ויסטיק, "דופק לשאוב" ולחצנים "מהירות במה" שמוצגים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. דו"ח של כל גרנולומה mesodissected מEB23 NHP. בעלי חיים המשמשים במחקר זה היו נגוע בCDC1551 MTB באמצעות תרסיס. תמונת ההתייחסות משמאל מראה גרנולומה H & E מוכתמת ממקוק רזוס נגוע באופן פעיל. האזור הרצוי של ריבית כדי להיות גזור מתואר בירוק. התמונה באמצע shows שקופית FFPE בלא כתם המקביל של 5 עובי מיקרון לפני הנתיחה. האזורים היו מיושרים באמצעות התוכנה ובאזור המקשר עניין מתואר בירוק. התמונה מהימין מציגה את אותה הודעה שקופיות FFPE בלא כתם לנתיחה. האזור גזור מיוצג בכחול. 400 2 מ"מ קצת טחנה מתכלה שימש לנתיחה, אשר נועדה לנתיחה חוצה של מדיום לנתיחת אזור גדול. אזור נתיחה גדול מתואר כפחות מ 100 מ"מ 2. גדלים המיועדים לסוגי אזורים אחרים / נתיחה זמינים. למרות שהדו"ח מתאר את האזור כמבואר 0 מ"מ 2, זה לא מדויק. כאשר אנו מסירים את שקף microdissected מהמכונה ולחפש פיזי בשטח של העניין עצמו, אנו יכולים לראות את האזור המקביל בשקופית שיש לו כבר לא רקמות ולכן כבר גזורים. יצוין, כי מחברים שוכרים את המכשיר ונושא זה תוקן על instrume האחרNTS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פרימט | התולעת מדינה | ריכוז RNA בng / μl | RNA סה"כ בng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | פעיל | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | כמוס | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | מחדש באמצעות זיהום שיתוף עם SIV | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
טבלת 1. ריכוזי RNA לפרסם חילוץ. מדגם DNAsed ומיצוי RNA בוצע באמצעות ערכת Qiagen RNAeasy FFPE. קון RNAcentration הושג באמצעות nanodrop. שלבי התולעת NHP מתוארים גם. RNA היה eluted ב15 מים חופשיים μl RNase.
| פרימט | התולעת מדינה | ריכוז cDNA בng / μl | cDNA סה"כ בng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | פעיל | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | כמוס | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | מחדש באמצעות זיהום שיתוף עם SIV | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
טבלה 2. ריכוזי cDNA לפרסם הגברה וטיהור. שלבי התולעת NHP מתוארים גם. RNA היה מוגבר באמצעות מערכת Ovation RNA-Seq FFPE (חלק no. 7150) וכתוצאה מכך cDNA הגברה היה מטוהר באמצעות ערכת טיהור QIAGEN QIAquick PCR כפי שהוצע על ידי NuGEN בעמוד 26 של המדריך למשתמש של מערכת ההגברה. cDNA היה eluted ב30 TE חיץ μl.
| ובכן | כתב | Ct | ערך tm |
| 16S 10-1 | תקן | 12.35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | תקן | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | תקן | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | תקן | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | תקן | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | תקן | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | לא ידוע 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | לא ידוע | 17.760149 | 78 |
| EB23 | לא ידוע | 24.754618 | 78.2 |
| בקרה שלילית | NTC | 33.544422 | 79.7 |
לוח 3. RT-PCR תוצאות ביחס ל16s למקטע ריבוזומלי. הגברה מתאימה שנצפתה ובכך להוכיח את נוכחותם של MTB בדגימות. הדנ"א הגנומי מזן CDC1551 MTB שימש כסטנדרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesodissection היא טכניקה שניתן ליישם למיצוי RNA משקופיות נגע פתולוגיים נגרמות על ידי מגוון רחב של פתוגנים. זה הוא הכרח שהמשתמש עוקב אחר הדמות ומיישר את התמונה בצורה נכונה. כדי להשיג זאת, המכשיר חייב להיות מכויל בהתאם לכיווני תוכנת ההדמיה. כאשר לנתח, אם השקופית ואת תחומי עניין של להיות גזור לא ליישר, המשתמש חייב לכייל מחדש את המכשיר. עוד שלב קריטי בתהליך הנתיחה הוא לטעון קצת הטחנה מתכלה באופן כזה שהוא נטול בועות לפני לנתיחה (שלב 5.1). מצאנו כי הנוכחות של בועות מקטינה את התשואה לנתיחה. כדי לתקן בעיה זו, אנו ממליצים להנעת ולהביע את הבוכנה מספר פעמים. המשתמש יכול לתרגל את זה על ידי הוספת צבע מאכל לחיץ בפועל לדמיין בועות, כפי שהומלץ על ידי היצרן. ברגע יעיל, המשתמש צריך ולאחר מכן להמשיך עם נתיחה רגילה. לה שלב קריטי st הוא לנתח את המדגם בכיוון השעון. טחנות המכונה בכיוון השעון; לכן, מצאנו שהזזת הג'ויסטיק בתנועה סיבובית בצורה נגד כיוון השעון מגבירה את תשואת רקמות כמו חתכים הקצה המובילים יותר נקי מאשר נגרר לקצה 6. דרך נוספת לשפר את תשואת רקמה היא להפחית את המהירות של תהליך הנתיחה. מצאנו כי קביעת שיעור השאיפה ומהירות מנוע במהירות הנמוכה ביותר בו זמנית תוך קביעת מהירות הבמה כדי "נמוך" לייצר את התשואה הגבוהה ביותר ברקמות. ישנן שתי מגבלות עיקריות לגישת microdissection זה. המגבלה הראשונה היא שמצאנו לנתיחה נקודה מאוד מאתגרת בשל הצורך להסיע את הג'ויסטיק במעגלים נגד כיוון השעון בתהליך הנתיחה. המגבלה השנייה היא שהמצלמה במכשיר יוצרת תמונה שחסרה את הפירוט הסלולרי של תמונה שנוצרה מהמיקרוסקופ מתקדם.
> יש Mesodissection s = "jove_content" השלכה ישירה ביחס לניתוח transcriptomic של MTB. היווצרות גרנולומה היא סימן היכר של זיהום שחפת ותוצאות מניסיונו של המארח כדי להכיל את הפתוגן בתוך אזור מוגבל של ריאות 5. לעומת זאת, זה כבר הציע שMTB התפתח כדי לאפשר התמדתה בנגעי granulomatous 7. MTB הוא נתון ללחצים שונים, בהתאם לשלב של זיהום. חלק מלחצים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ללחץ חיזור, pH הנמוך, פגיעה בממברנה, היפוקסיה, חוסר התזונה, וכו '7-13. לאורך אלה בשלבים שונים, MTB עדיין יכול לשרוד בצורה סמויה, ואפילו מחדש. משמעות דבר היא כי גנים שונים שהוגברו וdownregulated בשלבי התולעת שונים. לדוגמא, MTB מקודד במשך 200 גורמי שעתוק 4. בנוסף, הוכיח כי האיזון בין ביטוי כמוקינים השונים, sucשעות ככמוקינים α וβ, בתוך granuloma עשויות להיות סמני הגנה חשובים 8. הערכת transcriptomics mycobacterial ברקמת granulomatous עשויה לקדם את ההבנה של המנגנונים מעורבים בהיווצרותם והתחזוקה, כמו גם גנים אלה שבאים לידי ביטוי בכל מצב של הזיהום שלנו. זה יאפשר לנו להעריך transcriptomics mycobacterial בשלבי התולעת שחפת שונים, כולל פעילה, סמויה ומחדש מחלה כמו גם באזורים שונים בתוך granuloma עצמו. בנוסף מאפשר לנו להעריך עוד יותר transcriptomics mycobacterial, ההליך הנ"ל גם מאפשר להערכת transcriptomics מארח באותה המדינות מזהמים. יתר על כן, גישה זו לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להשוות, לעומת זאת, ולנתח את הקשר בין המארח וחיידקים.
למרות שכלי חשוב במחקר שחפת, הפרוטוקול האמור ניתן להחיל על פתוגנים אחרים גם כן. מעלפרוטוקול משתמש בשקופיות FFPE מדגימות ריאה נגועות, אבל יכול להיות מיושם גם על נגעים מאיברים אחרים. אנו מדגימים כיצד להשתמש במערכת כדי לחלץ RNA, אבל זה יכול באופן תיאורטי לשמש עבור ה-DNA ומיצוי חלבון באופן רגיש יעיל באותה מידה ובזמן. לוקי FFPE זמינים ברוב מחלקות היסטולוגיה המעבדה; לכן, יש לו את הטכניקה המתוארת כאן האפשרות באופן אקספוננציאלי הגדלת הידע שנצבר מדגימות שאינם בשימוש כרגע אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לחשוף שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בפרסים / subawards הבא NIH לתמיכה של מחקר זה: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124 -08, וP51OD011104.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M.
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Tags
אימונולוגיה גיליון 88 Microdissection mesodissection פרפין פורמלין קבוע מוטבעת,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
