Ekspression af rekombinant Cellulase Cel5A fra<em> Trichoderma reesei</em> I tobaksplanter
Summary
Tobaksplanter blev anvendt til at fremstille en fungal cellulase, TrCel5A via et transient ekspressionssystem. Udtrykket kan overvåges ved hjælp af et fluorescerende fusionsprotein, og proteinet aktivitet blev karakteriseret efter ekspression.
Abstract
Cellulose nedbrydende enzymer, cellulaser, er mål for både forskning og industrielle interesser. Overvægten af disse enzymer i vanskelige-til-kultur organismer, såsom hyfer-building svampe og anaerobe bakterier, har fremskyndet brug af rekombinante teknologi på dette område. Plant ekspressionsmetoder er en ønskelig for stor-skala produktion af enzymer og andre industrielt anvendelige proteiner. Heri er fremgangsmåder til transient ekspression af en svampeinfektion endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A i Nicotiana tabacum påvist. Vellykket proteinekspression vist overvåges ved fluorescens under anvendelse af et mCherry-enzym-fusionsprotein. Derudover er et sæt af grundlæggende test bruges til at undersøge aktiviteten af forbigående udtrykt T. reesei Cel5A, herunder SDS-PAGE, Western blotting, zymografi, samt fluorescens og farvestofbaserede substrat nedbrydnings assays. Det her beskrevne system kan anvendes til at fremstille en aktiv celleulase i en kort periode, for at vurdere potentialet for yderligere produktion i planter gennem konstitutive eller inducerbare ekspressionssystemer.
Introduction
Nedbrydning af lignocellulose biomasse og dets omdannelse til flydende brændstof er blevet planlagt som en metode til at mindske afhængigheden af fossile brændstoffer. En væsentlig forhindring i at etablere økonomisk gennemførlige biomasse systemer er i den enzymatiske nedbrydning af cellulose og hemicellulose 1. Plant ekspressionssystemer stort potentiale til fremstilling af enzymer i industriel skala. Landbrugssystemer til at høste planter økonomisk og volumen er allerede etableret, da de har været i tusinder af år. Produktionen af cellulaser i planter er ønskeligt på grund af faktorer som den lethed autohydrolysis 2, og potentialet for at maksimere brugen af lavere enzym niveau ved at øge fordøjeligheden af plante cellevægge 1. Endelig tillader plantesystemer målretning af rekombinante proteiner til specifikke områder af planteceller og er i stand til at posttranslationelt ændre enzymer, hvor det er påkrævet 3.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tobak) er meget almindeligt anvendt som en model organisme til heterologe protein udtryk studier i planter, på grund af sin hurtige vækst og biomasse akkumulerende har 4. Transient ekspression af rekombinante proteiner er en teknik, som giver proteinproduktion i korte perioder 5, samtidig med at fleksibilitet med hensyn til lokalisering og dermed posttranslationelle modifikationer af de udvalgte proteiner, dvs cellulaser. Dette muliggør produktionen af cellulase (r) til grundlæggende analyse, mens også om grundlaget for yderligere strategier ekspression i planter. Ved hjælp af en sådan forbigående udtryk strategi, er en endoglucanase fra glycosylhydrolase familie 5, Cel5A, der stammer fra svampeværten Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6. produceres (i det følgende benævnt TrCel5A). TrCel5A er et 42 kDa protein, som er indbygget glycosyleret og er yderst aktive i hydroylzing cellulose kæder 7.
Transient ekspression her beskrevne teknik er baseret på et relativt almindeligt anvendte system, infiltrere planternes blade med Agrobacterium, der bærer genet af interesse i en passende ekspressionsvektor. At give mulighed for hurtig analyse af succes i planta udtryk, kan TrCel5A også udtrykkes som et fusionsprotein med mCherry, en monomer fluorescerende protein oprindeligt stammer fra Discosoma sp. Protein dsRed 8, med yderligere seks histidinrester (His-tag) fusioneret til C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Kan således monitoreres ekspression af det heterologe fusionsprotein TrCel5A-mCherry inden for den voksende plante ved hjælp af grønt lys at undersøge mCherry spredning. Hvis det ønskes, kan tynde snit af plantematerialet undersøges i grønt lys mikroskopisk at indføre den specifikke lokalisering af proteinet. For dette arbejde, signal-og transidde peptider blev indarbejdet i konstruktionen, at lokalisere det heterologe protein eksport til det endoplasmatiske reticulum 9.
For at analysere aktiviteten af planteprodukter udtrykt cellulaser, herunder TrCel5A en række af cellulase aktivitet test kan køres. Efter ekstraktion af de samlede opløselige vegetabilske proteiner kan TrCel5A delvist oprenset under anvendelse af en termisk inkubation teknik. Protein størrelse er etableret ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Zymografi kan anvendes til at analysere aktivitet mod substrater, fx cellulose, som har været carboxy-methylerede (hvilket carboxymethylcellulose: CMC) opløselighed 10. Cellulase og glucosidase-aktivitet kan overvåges ved hjælp af fluoroforen 4-methylumbelliferyl-(4-MU) i forbindelse med β-D-cellobiosid (kombineret: 4-MUC). En anden metode til at vurdere endoglucanaseaktivitet involverer spektrometriske analyse af CMC, som er blevet forbundet med et azo-dI (Remazolbrilliant Blue R) 11.. Derudover kan protein-aktivitet i begge endoglucanaser og en række cellulaser overvåges ved anvendelse af en sukker-analyse test, såsom p-hydroxy-benzoesyre-hydrazid (PAHBAH)-assay 12. Disse teknikker kan anvendes til at belyse og kvantificere aktiviteten af det udtrykte cellulase af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinant ekspression af cellulaser er et område af stor interesse på grund af ønsket om mere effektive biobrændstoffer produktionssystemer 1. Planter byder på mange muligheder for en vellykket cellulase produktion, med funktioner såsom økonomisk høst teknikker og autohydrolysis metoder bliver meget ønskelige egenskaber for storstilet produktion af biobrændstoffer. Yderligere brug af forskellige lokaliseringer til fremstilling af proteiner tillader, om nødvendigt, posttranslationelle modifikation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nützung von Biomasse", og Cluster of Excellence "Skræddersyede brændstoffer", der finansieres gennem Excellence-initiativet af de tyske føderale og statslige regeringer til at fremme videnskab og forskning på tyske universiteter.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
