Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Растения табака были использованы для получения грибковые целлюлазы, TrCel5A, через систему переходных экспрессии. Выражение может контролироваться с использованием флуоресцентного слитый белок и белок активность характеризовалась после выражение.

Abstract

Целлюлоза разрушающие ферменты, целлюлозы, являются объектами как исследований, так и промышленных интересов. Преобладание этих ферментов в трудных для культуры организмов, таких как гифы потенциала грибков и анаэробных бактерий, поспешил использование рекомбинантных технологий в этой области. Методы выражения завод являются желательным система для крупномасштабного производства ферментов и других промышленно полезных белков. При этом способы временной экспрессии грибковых эндоглюканазы, Trichoderma reesei Cel5A, в Nicotiana аЬасит демонстрируются. Выражение Успешное белок показано, контролируется флуоресценции с использованием гибридного белка mCherry-фермента. Кроме того, набор базовых тестов используются для изучения деятельности временно выраженной Т. reesei Cel5A, в том числе в ДСН-ПААГ, Вестерн-блоттинга, зимографии, а также флуоресценции и на основе красителя подложки деградации анализов. Система, описанная здесь, могут использоваться для получения активной ячейкиÜlase в течение короткого периода времени, с тем, чтобы оценить потенциал для дальнейшего производства в растениях через учредительных или индуцибельных систем экспрессии.

Introduction

Деградация лигноцеллюлозной биомассы и ее преобразования в жидкое топливо было предусмотрено в качестве метода для уменьшения зависимости от ископаемых видов топлива. Одним из важных препятствием в установлении экономически обоснованных систем обработки биомассы в ферментативного расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы 1. Системы экспрессии растений показывают большой потенциал для производства ферментов в промышленном масштабе. Сельскохозяйственные системы для сбора растений экономически и в объеме уже установлены, так как они были в течение тысяч лет. Производство целлюлаз в растениях желательно из-за таких факторов, как легкость автогидролиза 2, и потенциал для максимального использования более низких уровнях ферментов, увеличивая усвояемость клеточных стенок растений 1. Наконец, системы растений позволяют адресности рекомбинантных белков в конкретных областях растительных клеток и способны посттрансляционно изменить ферменты, где необходимые 3.

ve_content ">

Nicotiana аЬасит (табак) очень широко используется в качестве модельного организма для гетерологичными исследований экспрессии белка в растениях, в связи с его быстрым ростом и биомассы особенностей накопления 4. Переходный экспрессии рекомбинантных белков является метод, который позволяет производство белка в короткие периоды времени 5, при сохранении гибкости в отношении локализации и, таким образом посттрансляционной модификации выбранных белков, т.е. целлюлазы. Это позволяет производить целлюлазы (ы) для базового анализа, в то же время заложить основу для дальнейших стратегий экспрессии в растениях. Использование такого переходную стратегию экспрессии, эндоглюканазы из гликозилгидролаз семейства 5, Cel5A, полученного из грибка Trichoderma reesei хоста (Hypocrea jecorina) 6 производится (далее по тексту TrCel5A). TrCel5A является 42 кДа белок, который изначально гликозилирован и очень активен в гидравлическиеroylzing целлюлозных цепей 7.

Методика переменной экспрессии описано здесь, основаны на сравнительно обычно используемой системе, проникают листьев растений с Agrobacteria, несущий ген интереса в соответствующий вектор экспрессии. Для обеспечения быстрого анализа успеха в выражении Планта, TrCel5A также может быть выражено в виде слитого белка с mCherry, мономерного флуоресцентного белка первоначально полученных от Discosoma зр. Белок DsRed 8, с дополнительными шестью остатками гистидина (His-тегов), слитых с С-конец (TrCel5A-mCherry). Экспрессия гетерологичного слитого белка, TrCel5A-mCherry, таким образом, может контролироваться в рамках растущего растения с помощью зеленый свет для изучения mCherry разгон. При желании тонкие слои растительного материала может быть рассмотрен в зеленом свете под микроскопом, чтобы установить конкретную локализацию белка. За эту работу сигнала и переходовсидят пептиды были включены в конструкцию, чтобы локализовать гетерологичный экспорт белка в эндоплазматический ретикулум 9.

Чтобы проанализировать деятельность растений, выраженных целлюлазы, в том числе TrCel5A, ряд тестов активность целлюлазы может быть запущен. После экстракции от общего растворимых белков растений, TrCel5A может быть частично очищен с использованием метода термической инкубации. Белок размер устанавливается с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга. Зимографии могут быть использованы для анализа активностью в отношении субстратов, например целлюлозы который был карбокси-метилированный (изготовление карбоксиметилцеллюлозу: CMC) на растворимость 10. Целлюлазы и глюкозидазы можно контролировать с помощью флуорофора 4-метилумбеллиферил (4-MU), связанное с β-D-целлобиозида (комбинированный: 4-MUC). Другой метод для оценки эндоглюканазы деятельность включает в себя спектрометрический анализ CMC который был связан с азо-двы (Remazolbrilliant Голубой R) 11. Кроме того, белок активность обоих эндоглюканаз и ряд целлюлазы можно контролировать с помощью теста на анализ сахара, такие как гидразида р-гидрокси бензойной кислоты (PAHBAH) анализа 12. Эти методы могут быть использованы для выяснения и количественной оценки активности экспрессированного целлюлазы, представляющего интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рост дикого типа N. Tabacum растений

  1. Чтобы вырастить N. аЬасит Л. резюме. Petit Havana SR1 растений на почве, поместите семена табака на соответствующих горшки с нормальной почвой для прорастания. Через 2 недели, передать саженцев отдельные горшки. Выдержите заводы в теплице с постоянной 22 ° C (темно-период) или 25 ° C (светло период) и 70% относительной влажности воздуха. Обеспечить освещение в 16/8 ч цикле свет / темнота (например, Philips IP65 400 Вт лампы; 180 мкмоль · с -1 · м -2; λ = 400-700 нм) и воды ежедневно.

2. Переходные Выражение TrCel5A и TrCel5A-mCherry белков

  1. В стерильных условиях, выбрать одиночные колонии Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, Kmr, RifR), содержащие либо pTRAkc-ER-TrCel5A или pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry и трансфер в коническую колбу, содержащую 10 мл дрожжевого экстрактабульон (YEB, приготовленный согласно спецификациям производителей) средне-и канамицин (50 мг / мл), рифампицин (50 мг / мл) и карбенициллин (100 мг / мл) для выбора. Инкубировать в течение 36-40 ч при 26 ° С и 180 оборотах в минуту. Примечание: Конструкция соответствующих конструкций для экспрессии белка выходит за рамки этой статьи, но для руководства, методы Маклин и др. 13 и Манро и Pellham 14 может следовать для разработки конструкции..
  2. Возьмем 200 мкл каждой культуры дл инокул ции 20 мл YEB с концентраций антибиотика, упомянутых выше, и инкубируют при таких же условиях, как и раньше.
  3. После 36-40 ч, preinduce культур добавлением 2 мкл acetosyringon (200 мкМ конечная концентрация) добавляли 100 мкл 40% (вес / объем) раствора глюкозы и 200 мкл 1 М MES буфера, рН 5,6. Выдержите в течение ночи.
  4. Подготовка 100 мл 2х буфера инфильтрации (100 г / л сахарозы, 3,6 г / л глюкозы, 8,6 г / л Мурасиге и Скуга базальные солей, Довести рН до 5,6 с помощью гидроксида калия).
  5. Измерение оптической плотности 600 культур с 1:05 разведений, пока она не достигнет OD 600 из 5-6. Рассчитать объем культуры, необходимой для 30 мл инфильтрации среде при OD 600. Добавить 15 мл 2 раза инфильтрации буфера, а затем добавить деионизированной H 2 O, чтобы сделать буфер до 30 мл.
  6. Возьмите растения от теплицы и использовать пипетки ник абаксиальной сторону 3-го до 5-го листа сверху, чтобы облегчить проникновение.
  7. Используйте пипетки ник абаксиальной сторону листьев, чтобы облегчить проникновение.
  8. Заполните шприц с инфильтрации среды и поместить его (без иглы) на одном из ранее сделанных вмятин. Поддержите шприц с пальцем на адаксиальную стороне листьев. Нажмите среду тщательно в ткани межжилковый зон листьев. Примечание: После инфильтрации, культивировать растения в теплице при тех же условиях, как описано выше. Кроме того, поддерживать равное долю UNTReated, без переходных растения выражение (NTEPs) в качестве контроля, в тех же условиях, что и проникли растений.

3. Оценка TrCel5A-mCherry слова в листьях растений

  1. После 4-6 дней, принять растения проникли с А. tumefaciens содержащие pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry из теплицы и размещать их в темной комнате для флуоресцентного анализа.
  2. Для визуализации флуоресценции в листовых секций, выражающих TrCel5A-mCherry, легкие растения с помощью переносного аудиоустройства светоизлучающий зеленый свет при 515 нм с красным фильтром (620-750 нм). Примечание: В глубине характеристика экспрессии белка в листьях растений может быть достигнуто путем тонких срезов-листьев с Vibratome и экспертизы в рамках света и флуоресцентной микроскопии. Для этого выполните следующие действия:
    1. Вырезать небольшие участки примерно 5 х 5 мм размером от проникли листа и вставить их в 4%-ном агарозном, растворенного в 50 мМ фосфатном буфере (рН 5,7).
    2. Вырезатьраздел 80-90 размера мкм от встроенных листьев с использованием Vibratome. Поместите их на предметное стекло микроскопа, накрыть буфера или покровным и изучить их с помощью микроскопа в 10-кратным увеличением с флуоресцентным детектором, используя ту же длину волны и фильтр, указанных выше.

4. TrCel5A Добыча из листьев табака

  1. Вырезать куски из табачных листьев, чтобы Вес системы около 1 г из растений, зараженных А. tumefaciens содержащие pTRAkc-ER-TrCel5A и место в ступке предварительно охлажденном жидким азотом. Добавить соответствующее количество жидкого азота в образцах. Измельчить листья в порошок с помощью предварительно охлажденного пестик.
  2. Добавить 2 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащем 1 мМ фенилметилсульфонилфторида на первом листе вещества и перемешать до тех пор пока большинство из листьев вещества не в суспензии. Экстракт Центрифуга при 15000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и принимать белка, содержащего супернатанта.
  3. CentriFuge экстракт при 15000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С и принять белка, содержащего супернатанта стараясь не нарушить гранул. Откажитесь от осадка.
  4. Частичной очистки TrCel5A путем инкубации белка, содержащего супернатанта при 55 ° С в течение 10 мин. Разрешить отдыхать при комнатной температуре в течение еще 10 мин, затем центрифугируют при 15000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите частичное процесс очистки для не-проникли растений для получения контрольных образцов. Используйте эти образцы для всех следующих экспериментах. Примечание: белковые растворы можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 недели или при -20 ° С в течение 3 месяцев.
  5. Повторите частичное процесс очистки для не-проникли растений для получения контрольных образцов. Используйте эти образцы для всех следующих экспериментах. Примечание: белковые растворы можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 недели или при -20 ° С в течение 3 месяцев.

5. SDS-PAGE, Вестерн-блоттинг, и азо-CMC зимографии из TrCel5A-mCherry </ Р>

  1. Покупка или подготовить 12% (в / о) ПААГ с ДСН в установленном методов 15.
  2. Растворить в воде КМЦ с получением 1,5% (вес / объем) раствора. Чтобы гели CMC-SDS-PAGE, заменить 1 мл 1,5% КМЦ для 1 мл воды в растворе 10 мл SDS-PAGE гель смеси, в результате чего 0,1% (вес / объем) CMC + 12% (вес / объем ) SDS-PAGE гель смеси. Налейте гель обычно. Примечание: Убедитесь, что КМЦ в исходном растворе полностью растворяется сочетанием перемешивании и нагревании до 40 ° С (повтор непосредственно перед приготовлением раствора гель).
  3. Денатурация образцов кипячением в присутствии SDS, согласно установленных методов 12. В качестве положительного контроля, использовать разведени коммерчески доступной смеси из целлюлазы Т. 1:500 reesei, таких как Т. reesei АТСС 26921. В качестве отрицательного контроля используют Аналогичным образом получали белкового раствора от не-проник листьев (NTEPs).
  4. Провести электрофорез по обычному протоколов 15,например использовать 200 V для ~ 50 мин с электрофореза остановился, как только передние краситель достигла дна геля.
  5. Пятно один SDS-PAGE гель с использованием 0,1% (вес / объем) кумасси бриллиантовым голубым и destain помощью метанол / ледяная уксусная кислота. Примечание: Rapid окрашивание и обесцвечивани может быть выполнена путем осторожного нагревания окрашивание и обесцвечивани решений, то есть, использование микроволновой печи в течение ~ 15 секунд, чтобы нагреть (но не кипеть) сначала окрашивание, а затем обесцвечивани решения, изменение обесцвечивани раствора через 10 мин , или при охлаждении, и повторите с новым решением обесцвечивани.
  6. Выполните Вестерн-блоттинга одного SDS-PAGE геля с использованием утвержденных протоколов 16,17. Используйте следующие антитела: поликлональное кроличье антитело против His-метки (первичный) и поликлональное козьего анти-кроличьего антитела Fc области, которая была конъюгированного с щелочной фосфатазой (вторичной). Примечание: вторичные антитела должны быть выбраны для того, чтобы визуализировать с помощью нитросинего тетразолий chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate р-толуидин соль (НБТ / BCIP), как описано 18.
  7. Выполнение белок в геле повторной укладки на 0,15% (вес / объем) CMC SDS-PAGE гель путем инкубации гель в 1,5% (вес / объем) β-циклодекстрина, 20 мМ фосфат-цитратного буфера, рН 6,5, при комнатной температуре с осторожном встряхивании в течение 15 мин 19.
  8. Откажитесь от β-циклодекстрина решение и кратко промывать гель H 2 O. Инкубируют при комнатной температуре в 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,8) в течение еще 15 мин. Выполнение CMC зимография использованием повторно уложенной 0,15% КМЦ SDS-PAGE гель путем инкубации гель в 30 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4,8 в течение 20 мин при 50 ° С
  9. Выполнение CMC зимография использованием повторно уложенной на 0,15% (вес / объем) CMC SDS-PAGE гель путем инкубации гель в 30 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,8) в течение 20 мин при 50 ° С
  10. Пятно гель в течение 10 мин с использованием 0,1% вес / объем красного раствора и destain Конго в течение 30 мин или до четкие полосы, наблюдаемые с помощью 1 М NaCl. Промойте гель 0,3% (объем / объем) уксусной кислотой четкого изображения.

6. 4-MUC Анализ активности из TrCel5A

  1. Подготовка исходного раствора 10 мм 4-Мюнхен в 50% (объем / объем) метанола, и хранить его в темноте при комнатной температуре
  2. Непосредственно перед проведением теста, подготовить рабочий раствор 4-MUC 2x, состоящую из 1 мМ 4-MUC и 60 мМ ацетата натрия, рН 4,8.
  3. Выполните проверку на образцах, содержащих 100 мкл листьев белка (с или без TrCel5A индуцибельно выразил), 100 мкл в продаже целлюлаза смесь из T. reesei 1:1000 и чистая H 2 O, соответственно. Запуск каждого образца в трех экземплярах.
  4. Пипетка по 100 мкл 4-MUC рабочего раствора на отдельные лунки 96-луночного планшета, а затем добавить 100 мкл каждого образца.
  5. Определите 0 мин временной точке флуоресценции 4-MU через флуоресцентной спектроскопии, с помощью длины волны возбуждения 360 нм и длине волны излучения 465 нм.
  6. Выдержите пластины для 20мин при 50 ° С, покрытые клейкими крышками, чтобы предотвратить испарение. Остановить реакцию путем замораживания (или путем объединения 100 мкл 0,15 М глицин, рН 10,0 и 100 мкл образца в отдельной тарелке).
  7. Определить конечную флуоресценции 4-MU через флуоресцентной спектроскопии, с помощью длины волны возбуждения 360 нм и длине волны излучения 465 нм. Вычтите 0 мин от конечной точки (20 мин) временной точки, чтобы получить изменение значений флуоресценции.

7. Азо-карбоксиметилцеллюлозы Анализ активности из TrCel5A

  1. Подготовьте запас 1,5% (вес / объем) азо-CMC, который хранится при комнатной температуре, а осадки раствор, содержащий 18 мМ ацетата цинка, 0,5 М ацетат натрия, рН 5 и 80% этанола (об / об), хранить при комнатной температура.
  2. Непосредственно перед проведением теста, подготовить рабочий раствор азо-CMC 2x, состоящий из 1% (вес / объем) азо-КМЦ (в H 2 O) и 60 мМ ацетата натрия, рН 4,8.
  3. Смешайте 50 мкл образца и 50 мкл работыING решение в 1,5 мл труб.
  4. Тестовые образцы, содержащие 50 мкл листьев белка (с или без TrCel5A временно экспрессируется); 100 мкл коммерчески доступного целлюлазной смеси из T. reesei разбавляют 1:1000; и чистой H 2 O. Запуск образцы и стандарты в трех экземплярах.
  5. Инкубируйте образцы в течение 20 мин при 50 ° С Остановите реакцию добавлением 250 мкл осадков решения. Vortex каждый образец энергично в течение 10 сек, чтобы обеспечить решения были полностью объединены.
  6. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем снова вихря. Центрифуга образцов при 1000 мкг в течение 10 мин. Удалить 200 мкл каждого образца супернатанта в 96-луночный планшет так, чтобы не нарушить гранул.
  7. Анализ с помощью спектроскопии поглощения при длине волны 590 нм.

8. PAHBAH Количественное определение TrCel5A

  1. Используйте перфорации вырезать круг (~ диаметр 5,5 мм) фильтровальной бумаги. Добавить 100 мкл 60 мм NAAC, рН 4,8, и 100 мкл образцов, либо содержащих листьев белок (с или без TrCel5A индуцибельно выразил) или коммерческой Т. reesei целлюлазы смесь, разбавляли 1:1000, и инкубируют при помощи фильтровальной бумаги кругов в течение 20 часов при 50 ° С с 300 оборотов в минуту встряхивании. Для каждого образца инкубированной фильтровальной бумагой, также инкубировать дубликат решение без фильтровальной бумаги в виде отдельных образцов-контроля.
  2. Подготовьте 330 мм П-гидрокси Гидразид бензойной кислоты (PAHBAH) раствор А, растворяя PAHBAH в H 2 O с добавлением 5 мл концентрированной соляной кислоты в общей сложности 100 мл раствора, и хранить при комнатной температуре. Примечание: Наилучшие результаты достигаются путем добавления HCl к меньшим объемом PAHBAH суспензии, то есть 30 мл, который перемешивают при температуре, чтобы помочь растворению прежде, чем сделать объем до 100 мл с H 2 O.
  3. Подготовка PAHBAH раствора B, содержащий цитрат натрия 50 мМ, 10 мМ хлорида кальция и 500 мМ NaOH и хранить при комнатной температуре.
  4. Immediately перед анализом, подготовить 1.5x рабочий раствор 1 мл PAHBAH реагента к 9 мл буферного раствора, магазин на льду до использования (не для использования в 4 ч).
  5. Подготовка образцов в термостойких 0,2 или 0,5 мл пробирок. Комбинат 5 мкл каждого раствора инкубировали с фильтровальной бумаги (шаг 8.1) 45 мкл H 2 O и 100 мкл PAHBAH рабочего раствора. Управления Примеры (образцы инкубировали без фильтровальной бумаги) должен быть запущен в тех же концентрациях (5 мкл образца, 45 мкл H 2 O, рабочий раствор 100 мкл PAHBAH). Также проверить 5 стандартов (5 мкл), содержащие от 0 до 0,2 г / л глюкозы и чистая H 2 O. Запуск образцы и стандарты в трех экземплярах.
  6. Инкубируйте образцы ровно 10 минут при 100 ° С, затем охлаждают при комнатной температуре в течение ровно 10 минут. Внесите решения в 96-луночный планшет и анализ спектрально на длине волны 410 нм. Вычтите отдельные выборки управления (инкубируемые без фильтровальной бумаги) из образцов для получения окончательногозначения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A и TrCel5A-mCherry были успешно экспрессированы в растениях табака с использованием переходных системы экспрессии (фиг.1А и 1В). Экспертиза паттерном экспрессии слитого белка TrCel5A-mCherry показал здоровые листья (рис. 1в), который показал, выражение широкое белка в зеленом свете (рис. 1D).

Добыча общего количества растворимых белков проводили на растениях табака, которые имели листьев, которые содержали временно экспрессированного белка TrCel5A и SDS-PAGE показал большое разнообразие белков присутствовали (Фигура 2А, дорожка 1). Общее растворимый белок образец из TrCel5A экспрессирующих растений и общего растворимого белка, полученного образца из NTEPs, инкубировали в течение 10 мин при 55 ° С. TrCel5A остается стабильным и активным при 55 ° С в то время как многие другие носители (табак) белки не являются стабильными при этой температуре. Таким образом, многие не-EssentiAl белки осаждали этой обработки, в результате чего частично очищенный образец TrCel5A. После этого тепловой стадии осаждения, сильная полоса белка наблюдается при ~ 40 кДа (рис. 2А, дорожка 1). Это, вероятно, будет каталитический домен (CD) из TrCel5A, который, как было показано ранее для запуска при таком размере при экспрессии в растениях 4. Отрицательный и положительный контрольные образцы (рис. 2А, полосы 3 и 4 соответственно) показали низкие концентрации оставшихся термо-терпимая белков табачных от NTEPs (отрицательный контроль, Рисунок 2А, дорожка 3) и несколько полос указывает на смесь Т. reesei белки (положительный контроль, 2А, полоса 4).

Размер TrCel5A было подтверждено окрашиванием антителом, направленным на His-6tag включены в TrCel5A С-конце, который был замечен отсутствовать для обоих элементов управления (фиг. 2B). TrCel5A была продемонстрированасохраняют активность, эндоглюканазы CMC зимографии (фиг.2С, полосы 1 и 2), где отогнутый белок создал сильную свободный участок, указывая деградации CMC, на той же высоте, что и в кумасси SDS-PAGE гель и вестерн-блоттинг. Никакой активности не наблюдалось в течение не-целлюлаз белковых смесей из NTEPs (фиг.2С, дорожка 3), и полученную смесь Т. reesei белки работают в качестве положительного контроля показали активность эндоглюканазы из нескольких компонентов (рис. 2в, дорожка 4).

Для количественной оценки целлюлолитическую активность TrCel5A были использованы три пробы. Во-первых, деградация 4-Мюнхен анализировали наблюдения возросшую флуоресцентное излучение на 465 нм (при возбуждении при 360 нм) высвобождаемой 4-MU. TrCel5A было показано, ухудшает 4MUC, так же как разведение 1:1000 из коммерчески доступной смеси T. reesei целлюлазы (рис. 3А).

Количественному анализактивности TrCel5A против CMC было сделано путем измерения о выпуске азокраситель при 590 нм от Azo-КМЦ. TrCel5A деятельность в этих условиях, была эквивалентна по активности разведении 1:1000 в целлюлазной смеси, указанных выше (рис. 3б).

Способность TrCel5A деградировать фильтровальную бумагу также анализировали. Для этого теста начальный осахаривания Анализ проводили (т.е. с раствором TrCel5A разрушающих фильтровальную бумагу), а затем супернатант анализировали с помощью анализа PAHBAH, чтобы установить количество редуцирующих сахаров, выпущенные (фиг.3В).

Рисунок 1
Выражение Рисунок 1. Завод кассеты для TrCel5A конструкций и гетерологичной экспрессии TrCel5A-mCherry в кBacco оставляет визуализировали с помощью флуоресценции в зеленом свете. схематические изображения экспрессионной кассеты растений, используемых для TrCel5A (А) и TrCel5A-mCherry (B) показаны. После выражения переходных TrCel5A-MC, табачные листья были рассмотрены при нормальных (С) или зеленый свет (D). Для панелей (А) и (Б) промоутер CaMV (P35SS) и терминатор сигнал (pA35S) указаны в светло-голубой. 5'-UTR из халкона синтазы (ЦОН), и последовательности, кодирующей His6 (His6) выделены синим цветом. Растение кодон-оптимизированный лидирующий пептид (ЛПХ), полученный из тяжелой цепи мышиного mAb24 изображен на зеленый. ЛПХ достигает секрецию рекомбинантного белка в апопласт, после чего С-концевой KDEL сигнал, обозначенный красным цветом, задерживает белка в ЭР. Стрелки маркировать сайт связывания для грунтовки для усиления кассету экспрессии CaMV 35SS. Для панелей (C) и (D) зеленый свет был возбуждения 515 нм.Изображения были приняты без увеличения.

Рисунок 2
. Рисунок 2 Размер и активность TrCel5A, показанной в ДСН-ПААГ, Вестерн-блоттинга и CMC зимографии Разделение общего количества растворимых белков. Из растений табака, где временно была выражена TrCel5A до (1) и после (2) термической очистки осадков; от растений табака, где TrCel5A не присутствовал, также после термической осадков (3); или из коммерчески доступной смеси T. reesei целлюлазы (4). SDS-PAGE, отделенные белки визуализировали с окрашиванием Кумасси синим (A), вестерн-блоттинга по отношению к области His-метки из TrCel5A (B), и активность целлюлазы, показанной на зимографии с использованием CMC визуализировали с использованием Конго красным (С). PageRuler Плюс(Fermentas) был использован в качестве маркер молекулярной массы (М).

Рисунок 3
Рисунок 3. Активность фермента количественное определение TrCel5A. TrCel5A инкубировали с 4-MUC (А), азо-CMC (B), и фильтровальной бумаги (C) и деградации субстрата измеряется выпуска флуорофора 4-MU (А), азокраситель (B), или путем количественного редуцирующих сахаров путем мониторинга изменения цвета PAHBAH (C). Каждый анализ показывает результаты для трех повторов. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Во всех трех тестах образцы проанализированы были буфера в одиночку, TrCel5A после очистки тепловой осадков, NTEP (WT Nt) после термической очистки осадков, и коммерчески доступной смеси Т. reesei целлюлазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рекомбинантной экспрессии целлюлазы является полем большой интерес, в связи с желанием более эффективных систем производства биотоплива 1. Растения предлагают много возможностей для успешного производства целлюлазы, с такими функциями, как методы экономического уборки и методов автогидролиза являющихся очень желательные свойства для крупномасштабного производства биотоплива. Кроме того, использование различных локализаций для производства белков позволит, при необходимости, посттрансляционных модификаций 20. Изменение растения для того, чтобы конститутивной экспрессии целлюлазы, а также предложить очевидные преимущества, является трудоемким методом, который может или не может быть успешным. Такие методы, как улавливание выраженных белков и индуцибельных механизмами экспрессии увеличить вероятность успешного производства целлюлазы в растениях, однако они по-прежнему занять много месяцев, чтобы установить. Здесь, переходные методы экспрессии продемонстрировали, чтобы проиллюстрировать потенциал для конкретного целлюлазыбудет производиться через системы растений в течение нескольких дней.

Слияние с флуоресцентным белком mCherry был использован, чтобы продемонстрировать успех переходных методов экспрессии белка. TrCel5A-mCherry четко распределены по большей части листьев, которые были пропитаны вектора, содержащего Agrobacteria. Локализация в эндоплазматический ретикулум позволяет посттрансляционной модификации экспрессированного белка. Способность системы экспрессии, с тем чтобы, например, гликозилирование является особенно важным для тех целлюлаз, которые первоначально полученных из грибковых организмов, таких как T. reesei 21. Системы экспрессии дрожжей, которые все более популярным для гетерологичной экспрессии целлюлазы, часто приводят к гипер-гликозилирования ферментов, который обсуждаемых, является потенциальным препятствием для полной активности целлюлазы 22. Гликозилирования завод механизмыповторно без недостатка гипер-гликозилирования. Кроме того, выражение в растительных системах позволяет локализации в районы, которые позволяют или не позволяют посттрансляционных модификаций, что позволяет пошива на источник белка. Система продемонстрировали здесь также могут быть использованы, путем применения различных сигнальных последовательностей 14, для локализации в апопласт, хлоропластов, цитозоле или Гольджи пузырьков. Использование флуоресцентных слитых белков, таких как TrCel5A-mCherry, может продемонстрировать успех экспрессии белка, а также локализацию белка. Однако такие конъюгаты не требуются для дальнейших испытаний активности. Таким образом, рекомендуется конструкция без mCherry TrCel5A быть использован для всех дальнейших испытаний, как было показано здесь, чтобы получить более точные данные о деятельности данной выраженной целлюлазы. Что касается управления для дальнейших экспериментов, образцы из не-временно проникли растений, как правило, рассматриваться в надлежащий контроль.

5. Зимографии анализ активности по отношению к CMC указано, что оставшаяся пептид был активен как эндоглюканаза. В то время как SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга чрезвычайно распространенные анализы, CMC зимографии является гораздо более специфический тест для целлюлазы (и, в частности эндоглюканаза) деятельности. Некоторые важные факторы, которые необходимо учитывать для успешной результатов зимографии являются), что субстрат (в данном случае КМЦ) должны быть полностью растворено и равномерно по всей геля; б) что белок должен быть успешно отогнутый, предпочтительно в течение короткого периода, чтобы ограничить количество белка диффузии через гель; и с)анализ активности должно быть при оптимальной температуре для фермента, подвергаемые исследованию (для TrCel5A между 50 и 60 ° С) и должно быть кратким, чтобы позволить более четкие полосы деградации.

Количественный анализ активности целлюлазы выраженного TrCel5A показали, что фермент был активен против ряда субстратов, в том числе 4-MUC, КМЦ и фильтровальной бумагой. Каждый из подложек была исследована с использованием другого спектроскопического тест, либо с помощью флуорофора (4-MU) или с помощью световой анализа разброса цветной реакции (азо-красителем или PAHBAH). Все три подложки и анализы широко используются для оценки активности целлюлазы, и относительно прямой анализы. 4-MUC используется в качестве базовой подложки, чтобы определить гликозилгидролаз активность, как широкого спектра этих ферментов (эндоглюканаз, exoglucanases и β-глюкозидазы) активны против него. Скорость анализа, ограниченное количество требований, высокая чувствительностьи способность многих целлюлазы расщеплять субстрат, делает это полезно тест для общего скрининга для целлюлазы или для зондирования успех экспрессии перспективе. Один момент, чтобы иметь в виду при использовании 4-MUC является то, что этот субстрат особенно подходит для деятельности β-глюкозидаз, что делает деятельность эндоглюканаз (например, TrCel5A) или exoglucanases показаться слабыми по сравнению с β-глюкозидазы или смеси ферментов, которые содержат β-глюкозидазы. При выполнении анализа 4-MUC с низкой концентрацией белка или иначе низкие уровни активности рекомендуется использовать добавление глицина (рН 10) в виде стоп-раствора, как изменение рН усиливает флуоресценцию 4-MU. CMC является более специфический субстрат для фермента, выраженной здесь, так как он только ухудшаться эндоглюканаз. Азо-CMC анализ является более сложным, чем для 4-MUC, из-за необходимости осаждением целлюлозы (и метанола) с помощью цинка. Основное преимущество этого субстрата, и, таким образом анализ, Является то, что он является специфическим для эндоглюканазы активности, что делает его очень полезным для установления характера целлюлазы производится. Деградация фильтровальная бумага является еще одним распространенным тестом для установления активность целлюлазы. Количество деградации наблюдали значительно варьируется зависит от свойств целлюлазы быть оценены, и это является предпочтительным субстратом для изучения активность смесей ферментов. PAHBAH анализ, используемый здесь, чтобы исследовать деградации фильтровальной бумаги, распознает количество сахаров, выпущенных после осахаривания и поэтому также применимо к широкому диапазону модельных субстратов не продемонстрировали здесь, в том числе CMC, лихенан, β-глюкан, α-целлюлозы, AVICEL , ксилан и ксилоглюкан. Для этого теста следует позаботиться, чтобы включить стандарты на том же планшете (или в той же перспективе), как образцы оценивается, как изменение времени инкубации может привести к различиям в результатах. Таким образом, важно, чтобы повторить анализ для обеспечения точности. Дополнительно, Контрольный образец должен всегда быть запущен, когда образец инкубируют без целлюлозы подложкой, для контроля за любые редуцирующих сахаров естественно присутствующих в образцах, которые могут быть идентифицированы по PAHBAH, а в противном случае давать ложные положительные результаты.

В заключение, способы временной экспрессии и характеристике рекомбинантной целлюлазы четко продемонстрировано. Эти методы обеспечивают простой способ генерировать достаточное количество белка для дальнейшего изучения одного или нескольких целлюлазы, с помощью тестов активности, подобные тем, продемонстрировали здесь. В частности, эти методы обеспечивают быстрый способ изучить потенциал назначенных целлюлазы для производства Планта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана БМБФ Forschungsinitiative "Bioenergie 2021 - Forschung für умереть Nutzung фон BIOMASSE" и кластера к совершенству "Персонализированные сделал топлива из биомассы», который финансируется в рамках инициативы совершенства немецкими федерального правительства и правительств, чтобы содействовать развитию науки и исследования в немецких университетах.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 88 гетерологичная экспрессия эндоплазматическая сеть эндоглюканазы целлюлоза гликозил-гидролазы флуоресценция целлюлазы, табачные растения
Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; В растениях табака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter