Summary
צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.
Abstract
אנזימים משפילים תאית, cellulases, הם מטרות של שניהם אינטרסים תעשייתיים מחקר ו. העליונות של אנזימים אלה באורגניזמים קשים לתרבות, כגון פטריות העובש בנייה וחיידקים אנאירוביים, שהחישה את השימוש בטכנולוגיות רקומביננטי בתחום זה. שיטות ביטוי צמח הן מערכת רצויה לייצור בקנה מידה גדולה של אנזימים וחלבונים באופן תעשייתי שימושיים אחרים. בזאת, שיטות לביטוי החולף של endoglucanase פטרייתי, Trichoderma reesei Cel5A, בNicotiana tabacum הם הפגינו. ביטוי חלבון מוצלח מוצג, פיקוח על ידי הקרינה באמצעות חלבון היתוך mCherry-אנזים. בנוסף, סדרה של בדיקות בסיסיות המשמשות לבחון את הפעילות של ט 'הביע transiently reesei Cel5A, כולל-SDS, מערבי סופג, zymography, כמו גם הקרינה ומבחני השפלה מצע מבוסס צבען. המערכת המתוארת כאן יכולה לשמש לייצור תא פעילulase בתקופת זמן קצר, על מנת להעריך את הפוטנציאל לייצור נוסף במפעלים באמצעות מערכות ביטוי מכוננות או מושרה.
Introduction
השפלה של ביומסה lignocellulosic והמרתו לדלק נוזלי כבר חזתה כשיטת להפחתת תלות בדלקים מאובנים. המשוכה משמעותית אחד בהקמת מערכות לעיבוד ביומסה מבחינה כלכלית היא בשפלה האנזימטית של תאית hemicellulose 1. מערכות ביטוי צמח מראות פוטנציאל גדול לייצור של אנזימים בקנה מידה תעשייתי. מערכות חקלאיות לצמחי יבול מבחינה כלכלית ובנפח כבר הוקמו, כפי שהם היו במשך אלפי שנים. הייצור של cellulases בצמחים רצוי בשל גורמים כמו קלות autohydrolysis 2, ואת הפוטנציאל למקסם את השימוש ברמות אנזים נמוכים יותר על ידי הגדלת הנעכלות של קירות תא צמח 1. לבסוף, מערכות מפעל מאפשרות את המיקוד של חלבונים רקומביננטי לאזורים הספציפיים של תאי צמח והם מסוגלים לשנות posttranslationally אנזימים שבו נדרשו 3.
ve_content ">tabacum Nicotiana (טבק) מאוד נפוץ כאורגניזם מודל ללימודי ביטוי חלבון Heterologous בצמחים, בשל תכונותיה צמיחה המהירה וביומסה הצטברות 4. ביטוי חולף של חלבונים רקומביננטיים הוא טכניקה המאפשרת ייצור חלבון בתקופות זמן קצר 5, תוך שמירה על גמישות כמו ללוקליזציה ולכן שינויי posttranslational של החלבונים שנבחרו, כלומר cellulases. זה מאפשר הייצור של cellulase (ים) לניתוח בסיסי, גם בעת הנחת התשתית לאסטרטגיות ביטוי נוספות בצמחים. משתמש באסטרטגית ביטוי חולפת כאלה, endoglucanase ממשפחת glycosyl hydrolase 5, Cel5A, הנגזרת מהמארח פטרייתי Trichoderma reesei (jecorina Hypocrea) 6 מופק (להלן כTrCel5A). TrCel5A הוא חלבון 42 kDa אשר glycosylated באופן מקורי, והוא פעיל מאוד בHYDroylzing רשתות תאית 7.
טכניקת הביטוי חולפת המתוארת כאן מבוססת על מערכת יחסית נפוץ, שחדרו לעלי הצמח עם Agrobacteria נושא את הגן של עניין בוקטור ביטוי מתאים. כדי לאפשר ניתוח מהיר של הצלחה בביטוי Planta, TrCel5A יכול גם לבוא לידי ביטוי חלבון היתוך עם mCherry, חלבון פלואורסצנטי monomeric נגזר במקור sp Discosoma. חלבון DsRed 8, עם שאריות נוספות שש היסטידין (שלו תג) התמזגו C-הסופית (TrCel5A-mCherry). ביטוי של חלבון Heterologous ההיתוך, TrCel5A-mCherry, ובכך תוכל להיות במעקב במסגרת גידול הצמחים על ידי שימוש באור ירוק לבחון פיזור mCherry. אם תרצה, סעיפים דקים של החומר הצמחי יכולים להיבחן תחת אור הירוק במיקרוסקופ כדי לקבוע את הלוקליזציה מסוימת של החלבון. לשם כך עבודה, אות וטראןפפטידים לשבת שולבו במבנה, בתרגום יצוא חלבון Heterologous לreticulum endoplasmic 9.
כדי לנתח את הפעילות של cellulases הצמח בא לידי ביטוי, ביניהם TrCel5A, מספר בדיקות פעילות cellulase ניתן להפעיל. לאחר המיצוי של החלבונים הצמחיים המסיסים בסך הכל, TrCel5A יכול להיות מטוהר באופן חלקי באמצעות טכניקת דגירה תרמית. גודל חלבון הוקם באמצעות SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג. Zymography יכול לשמש גם כדי לנתח את הפעילות נגד מצעים, למשל תאית אשר כבר-מפוגל carboxy (מה שהופך את תאית carboxymethyl: CMC) למסיסות 10. פעילות Cellulase וglucosidase ניתן לנטר באמצעות fluorophore 4-methylumbelliferyl (4-MU) הקשורים β-D-cellobioside (בשילוב: 4-MUC). שיטה נוספת להערכת פעילות endoglucanase כרוכה ניתוח spectrometric של CMC שנקשר עם אזו דאתם (Remazolbrilliant הכחול R) 11. בנוסף, פעילות חלבון של שני endoglucanases ומגוון של cellulases יכולה להיות פיקוח על ידי שימוש במבחן ניתוח סוכר, כגון hydrazide p-הידרוקסי benzoic החומצה (PAHBAH) assay 12. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להבהיר ולכמת את הפעילות של cellulase הביע עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה של צמחי tabacum נ סוג בר
- לגדול נ tabacum L. קורות חיים. צמחי Petit הוואנה SR1 על אדמה, במקום זרעי טבק על הסירים מתאימים מלאים באדמת שתילה רגילה לנביטה. לאחר 2 שבועות, להעביר את השתילים לעציצים בודדים. דגירה צמחים בחממה עם קבוע 22 ° C (תקופה אפלה) או 25 ° C (תקופת אור) ו70% לחות אוויר יחסי. מספק תאורה ב16/8 שעה מחזור אור / חושך (למשל 400 מנורות W פיליפס IP65; 180 μmol · שניות -1 · מ -2; λ = 400-700 ננומטר) ומים בכל יום.
2. ביטוי חולף של TrCel5A וTrCel5A-mCherry חלבונים
- בתנאים סטריליים, לבחור מושבות אחת של tumefaciens Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) המכילות גם pTRAkc-ER-TrCel5A או pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry והעברה לבקבוק Erlenmeyer מכיל 10 מיליליטר תמצית שמריםבינוני מרק (ייב, שהוכן בהתאם למפרטי יצרנים) וkanamycin (50 מ"ג / מיליליטר), ריפאמפיצין (50 מ"ג / מיליליטר), וcarbenicillin (100 מ"ג / מיליליטר) לבחירה. דגירה של 36-40 שעות ב26 מעלות צלזיוס ו180 סל"ד. הערה: העיצוב של מבנים מתאימים לביטוי חלבון הוא מחוץ לתחום של מאמר זה, אבל להדרכה, השיטות של מקלין ואח' 13 ומונרו ו14 Pellham ניתן בעקבות לעיצוב מבנה..
- קח 200 μl של כל תרבות לחסן 20 מיליליטר של ייב עם ריכוזי האנטיביוטיקה שהוזכרו לעיל ודגירה באותם תנאים כמו קודם.
- לאחר 36-40 שעות, preinduce התרבויות על ידי הוספת acetosyringon 2 μl (200 מיקרומטר ריכוז סופי), 100 μl 40% (w / v) פתרון גלוקוז ו200 μl של 1 pH חיץ M MES 5.6. דגירה הלילה.
- הכן של חיץ חדירה 2x (מלחים בסיסיים סוכרוז 100 g / L, גלוקוז 3.6 גר '/ ל', 8.6 g / L Murashige וSkoog 100 מיליליטר, כדי להתאים את pH 5.6 באמצעות אשלגן הידרוקסידי).
- מדוד OD 600 של התרבויות עם 1:05 דילולים עד שהוא מגיע OD 600 של 5-6. חישוב התרבות נחוץ ל30 בינוניים חדירת מיליליטר ב OD 600 נפח. הוסף 15 מיליליטר של חיץ חדירה 2x, ואז מוסיף H 2 O deionized לעשות עד 30 מיליליטר החיץ.
- קח את הצמחים מהחממה ולהשתמש בקצה פיפטה לכינוי צד abaxial של 3 rd לעלה 5 ה מהחלק העליון כדי להקל על חדירה.
- השתמש בקצה פיפטה לכינוי צד abaxial של העלים כדי להקל על חדירה.
- ממלאי מזרק עם מדיום חדירה והכניס אותו (בלי מחט) על אחד מהחתכים שנעשו בעבר. לתמוך במזרק עם אצבע בצד העלה adaxial. לחץ הבינוני בזהירות לתוך הרקמה של אזורים עלה interveinal. הערה: לאחר חדירה, לטפח צמחים בחממה באותם תנאים כפי שתואר לעיל. כמו כן, לשמור על פרופורציה שווה של untreated, צמחים שאינם חולפים ביטוי (NTEPs) כפקדים, תחת אותם התנאים כמו צמחים שחדר.
3. הערכת ביטוי TrCel5A-mCherry בצמח עלים
- אחרי 4-6 ימים, לקחת צמחים הסתננו עם א ' tumefaciens מכיל pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry מהחממה ולמקם אותם בחדר חשוך לניתוח הקרינה.
- כדי להמחיש את הקרינה בסעיפי עלה להביע TrCel5A-mCherry, צמחי אור באמצעות מקור אור נייד פולט אור ירוק ב515 ננומטר עם מסנן אדום (620-750 ננומטר). הערה: בעומק אפיון של ביטוי חלבון בעלי הצמח יכול להיות מושגת על ידי עלים חתך דקים עם vibratome ובדיקה תחת אור ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך בצע את הפעולות הבאות:
- לחתוך חלקים קטנים של כ 5 x 5 מ"מ גודל מעלה שחדר ולהטביע אותם ב4% מומסים agarose ב50 מ"מ חיץ פוספט (pH 5.7).
- גזורקטע של גודל מיקרומטר 80-90 מעלים מוטבעים באמצעות vibratome. למקם אותם בשקופית מיקרוסקופ, מכסה בחיץ או להחליק את מכסה ולבחון אותם באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של 10X עם גלאי הקרינה, באמצעות אותו הגל והמסנן האמור לעיל.
4. TrCel5A הפקה מעליי הטבק
- חותכים חתיכות מטבק למשקל משוער של 1 גרם מצמחים נגועים בא tumefaciens מכיל pTRAkc-ER-TrCel5A ומקום במכתש precooled עם חנקן נוזלי. הוספת כמות מתאימה של חנקן נוזלי לדגימות. לטחון משאיר לאבקה באמצעות העלי precooled.
- הוסף 2 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) המכיל פלואוריד phenylmethylsulfonyl 1 מ"מ לעניין עלה קרקע ולערבב עד שרוב עניין עלה הוא בהשעיה. תמצית צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C ולקחת את supernatant המכיל חלבון.
- CentriFUGE התמצית ב15,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולקחת נזהר שלא לשבש את גלולה המכיל supernatant חלבון. זורק את הכדור.
- חלקית לטהר TrCel5A ידי דוגרים supernatant המכיל חלבון ב55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מניח לנוח בטמפרטורת חדר למשך יותר 10 דקות, אז צנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 10 דקות ב RT. חזור על תהליך טיהור חלקי לצמחים שאינם הסתננו להשיג דגימות שליטה. השתמש בדגימות אלה לכל הניסויים הבאים. הערה: ניתן לאחסן פתרונות חלבון על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1 או ב -20 ° C עד 3 חודשים.
- חזור על תהליך הטיהור החלקי לצמחים שאינם הסתננו להשיג דגימות שליטה. השתמש בדגימות אלה לכל הניסויים הבאים. הערה: ניתן לאחסן פתרונות חלבון על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1 או ב -20 ° C עד 3 חודשים.
5. SDS-PAGE, מערבי סופג, ואזו-CMC zymography של TrCel5A-mCherry </ P>
- רכישה או להכין 12% (w / v) ג'לי-SDS לפי שיטות הוקמו 15.
- ממיסים CMC במים כדי להשיג 1.5% פתרון (w / v). כדי להפוך את ג'לי CMC-SDS-PAGE, להחליף 1 מיליליטר של .1.5% CMC ל1 מיליליטר של מים בתמיסת 10 מיליליטר תערובת ג'ל SDS-PAGE, וכתוצאה מכך 0.1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) לערבב ג'ל SDS-PAGE. יוצקים ג'ל כרגיל. הערה: ודא כי CMC בפתרון המקורי הוא נמס לגמרי על ידי שילוב של ערבוב וחימום ל40 ° C (לחזור ישירות לפני הכנת פתרון ג'ל).
- לפגל דגימות על ידי רתחה בנוכחות SDS, כמו לכל שיטות שהוקמו 12. כביקורת חיובית, השתמש בדילול 1:500 מתערובת cellulase זמינה מסחרי מט reesei, כגון T. reesei ATCC 26921. כביקורת שלילית להשתמש בפתרון חלבון שהוכן באופן דומה מעלים שאינם הסתנן (NTEPs).
- לבצע אלקטרופורזה לפי פרוטוקולים רגילים 15,למשל להשתמש 200 V ל~ דקות 50 עם אלקטרופורזה נבלמה פעם אחת מול לצבוע הגיע לתחתית הג'ל.
- כתם ג'ל SDS-PAGE אחד באמצעות 0.1% (w / v) Coomassie כחול מבריק וdestain באמצעות מתנול / תערובת חומצה אצטית קרחונים. הערה: צביעה וdestaining מהירים יכולים להתבצע בעדינות על ידי חימום מכתים וdestaining פתרונות, כלומר באמצעות מיקרוגל ל~ 15 שניות כדי לחמם (אך לא להרתיח) ראשון מכתים ולאחר מכן פתרונות destaining, שינוי פתרון destaining לאחר 10 דקות , או כאשר התקרר, וחזור עם פתרון destaining חדש.
- לבצע מערבי סופג של אחד ג'ל SDS-PAGE באמצעות פרוטוקולים הוקמו 16,17. השתמש בנוגדנים הבאים: נוגדן ארנבת polyclonal נגד אזורו תג (ראשוני) ועז polyclonal נגד ארנב נוגדני Fc אשר כבר מצומדת לphosphatase אלקליין (משני). שימו לב: יש לבחור נוגדנים משני כדי לאפשר להדמיה באמצעות tetrazol nitroblueמלח p-toluidine chloride/5-bromo-4-chloro-3 ium '-indolyphosphate (NBT / BCIP), כפי שתואר 18.
- לבצע חלבון בג'ל refolding על 0.15% (w / v) ג'ל CMC-SDS על ידי דוגרים ג'ל ב1.5% (w / v) β-ציקלודקסטרין, חיץ 20 מ"מ פוספט-ציטראט, pH 6.5, בטמפרטורת חדר עם עדין רועד במשך 15 דקות 19.
- מחק את פתרון β-ציקלודקסטרין ובקצרה לשטוף את הג'ל עם H 2 O. לדגור על RT בחיץ 50mm נתרן אצטט (pH 4.8) לדקות 15 נוספות. בצע zymography CMC באמצעות 0.15% ג'ל SDS-PAGE קפל CMC על ידי דוגרים ג'ל בpH חיץ נתרן אצטט 30 מ"מ 4.8 עבור 20 דקות ב50 ° C.
- בצע zymography CMC באמצעות 0.15% קפלו (w / v) ג'ל CMC-SDS על ידי דוגרים ג'ל ב30 חיץ נתרן אצטט מ"מ (pH 4.8) עבור 20 דקות ב50 ° C.
- כתם ג'ל ל10 דקות באמצעות 0.1% w / v פתרון קונגו אדום וdestain ל30 דקות או עד להקות ברורות הם נצפו באמצעות 1 M NaCl. שטוף את הג'ל עם 0.3% (v / v) חומצה אצטית להדמיה ברורה יותר.
6. 4-MUC פעילות Assay של TrCel5A
- הכן פתרון מניות של 10 מ"מ 4-MUC ב50% (v / v) מתנול, ולאחסן אותו בחושך ב RT
- מייד לפני assay, להכין פתרון 4-MUC 2x עובד, מורכב מ1 מ"מ 4-MUC ו60 מ"מ נתרן אצטט, pH 4.8.
- בצע בדיקה זו בדגימות המכילות חלבון עלה של 100 μl (עם או בלי TrCel5A הביע inducibly), 100 μl תערובת cellulase זמינה מסחרי מט 1:1,000 reesei, ו-H 2 O הטהור, בהתאמה. הפעל כל דגימה בשלושה עותקים.
- של הפתרון עובד 4-MUC לתוך בארות נפרדות מצלחת 96 היטב פיפטה 100 μl, ולאחר מכן להוסיף לכל דגימה 100 μl.
- קבע 0 timepoint דקות של הקרינה 4-MU באמצעות ספקטרוסקופיית ניאון, באמצעות גל עירור של 360 ננומטר ואורך גל פליטה של 465 ננומטר.
- דגירה צלחות ל20דקות על 50 מעלות צלזיוס, מכוסה במכסים דביקים כדי למנוע אידוי. לעצור את התגובה על ידי הקפאה (או על ידי שילוב של 100 μl 0.15 M גליצין, pH 10.0, ומדגם 100 μl בצלחת נפרדת).
- לקבוע את נקודת הסיום של הקרינה 4-MU באמצעות ספקטרוסקופיית ניאון, באמצעות גל עירור של 360 ננומטר ואורך גל פליטה של 465 ננומטר. להחסיר 0 דקות מtimepoint נקודת קצה (20 דקות) כדי להשיג את השינוי בערכי הקרינה.
7. אזו-carboxymethyl צלולוזה פעילות Assay של TrCel5A
- הכן מלאי של .1.5% (w / v) אזו-CMC אשר מאוחסן ב RT, ופתרון משקעים המכילים אצטט 18 מ"מ האבץ, 0.5 נתרן אצטט M, pH 5 ו80% אתנול (V / V), חנות בחדר טמפרטורה.
- מייד לפני assay, להכין פתרון אזו-CMC 2x עובד, המורכב של 1% (w / v) אזו-CMC (H 2 O) ו60 מ"מ נתרן אצטט, pH 4.8.
- שלב 50 μl של מדגם ו50 μl של העבודהing פתרון ב1.5 צינורות מיליליטר.
- בדיקת דגימות המכילות 50 μl חלבון עלה של (עם או בלי TrCel5A הביע transiently); מתערובת cellulase זמינה מסחרי מט 100 μl reesei דילול 1:1,000; וטהור H 2 O. דגימות לרוץ וסטנדרטים בשלושה עותקים.
- דגירה דגימות עבור 20 דקות ב50 ° C. עצור את התגובה על ידי הוספת 250 μl של פתרון משקעים. ורטקס כל מדגם נמרצות ל10 שניות כדי להבטיח פתרונות אוחדו לחלוטין.
- דגירה דגימות ב RT עבור 10 דקות ולאחר מכן מערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות 1,000 XG 10 דקות. הסר 200 μl של כל supernatant מדגם לצלחת 96 היטב, נזהר שלא להפריע לגלולה.
- Assay באמצעות ספקטרוסקופיית הספיגה באורך גל של 590 ננומטר.
8. PAHBAH Assay של TrCel5A
- השתמש חירור לחתוך עיגול (~ קוטר 5.5 מ"מ) של נייר סינון. הוספת 100 μl 60 מ"מ NaAc, pH 4.8, ו100 μl של דגימות, או המכילים חלבון עלה (עם או בלי TrCel5A הביע inducibly) או ט מסחרי תערובת cellulase reesei, בדילול 1:1,000, דגירה עם עיגולי נייר סינון ל20 שעות על 50 מעלות צלזיוס עם 300 סל"ד רועד. עבור כל דגימה הודגרו עם נייר סינון, גם דגירה פתרון כפול ללא נייר סינון כמדגם בקרות פרטניות.
- הכן hydrazide החומצה benzoic (PAHBAH) פתרון p-הידרוקסי 330 מ"מ על ידי המסת PAHBAH בH 2 O עם התוספת של 5 מיליליטר HCl מרוכז עבור סכום כולל של 100 פתרון מיליליטר, ולאחסן ב RT. הערה: התוצאות הטובות ביותר מושגות על ידי הוספת HCl לנפח קטן יותר של תרחיף PAHBAH, כלומר 30 מיליליטר, אשר עורר בטמפרטורה כדי לעזור פירוק לפני קבלת הנפח ל100 מיליליטר עם H 2 O.
- הכן את הפתרון B PAHBAH, המכיל נתרן ציטרט 50 מ"מ, סידן כלורי 10 מ"מ, ו500 מ"מ NaOH וחנות ב RT.
- Immediately לפני assay, להכין פתרון 1.5x עבודה של מגיב PAHBAH מיליליטר 1 עד 9 מיליליטר פתרון חיץ, לאחסן על קרח עד לשימוש (לשימוש תוך 4 שעות).
- הכן את הדגימות ב0.2 או 0.5 מיליליטר צינורות חומים. שלב 5 μl של כל פתרון הודגרו עם נייר סינון (שלב 8.1) 45 μl של H 2 O ושל פתרון עובד PAHBAH 100 μl. פקדים לדוגמא (דוגמאות הודגרו ללא נייר סינון) יש להפעיל באותם ריכוזים (5 מדגם μl, 45 H 2 O μl פתרון, 100 PAHBAH μl עובד). גם לבדוק 5 סטנדרטים (5 μl) המכילים בין 0 ל 0.2 גר '/ L של גלוקוז, ו-H הטהור 2 O. דגימות לרוץ וסטנדרטים בשלושה עותקים.
- דגירה דגימות בדיוק 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לצנן על RT במשך בדיוק 10 דקות. פתרונות פיפטה לתוך צלחת גם 96 וassay spectroscopically באורך גל של 410 ננומטר. לחסר מדגם פקדים בודדים (הודגרו ללא נייר סינון) מדגימות כדי להשיג סופיערכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TrCel5A וTrCel5A-mCherry באו לידי ביטוי בהצלחה בצמחי טבק באמצעות מערכת חולפת הביטוי (איורים 1 א ו 1 ב '). בחינה של דפוס הביטוי של חלבון היתוך TrCel5A-mCherry חשפה עלים בריאים (איור 1 ג), אשר הראה ביטוי חלבון נרחב תחת אור הירוק (1D איור).
מיצוי של החלבונים המסיסים בסך הכל בוצע בצמחי טבק שהיו עלים שהכילו הביע transiently חלבון TrCel5A ו- SDS הראה מגוון גדול של חלבונים נכחו (איור 2 א ', מסלול 1). כלל המדגם מסיס החלבון מTrCel5A להביע צמחים ומדגם חלבון מסיס בסך הכל נגזר מNTEPs, הודגרו 10 דקות ב 55 ° C. TrCel5A נשאר יציב ופעיל ב55 מעלות צלזיוס בעוד רבים חלבונים אחרים (האם של טבק) אינם יציבים בטמפרטורה זו. לפיכך, אינה essenti רביםחלבוני אל היו זירז ידי טיפול זה, והשאיר את מדגם מטוהר חלקי של TrCel5A. לאחר שלב תרמית הממטרים הזה, להקת חלבון חזקה נצפתה ב ~ 40 kDa (איור 2 א ', מסלול 1). זה עשוי להיות תחום קטליטי (CD) של TrCel5A, שכבר הראה בעבר לרוץ בגודל זה, כאשר באים לידי ביטוי בצמחים 4. (איור 2 א, מסלולי 3 ו -4, בהתאמה) דגימות בקרה השליליות והחיוביים הראה ריכוזים נמוכים של חלבוני טבק תרמו סובלני שנותרו מNTEPs (שליטה שלילית, איור 2 א ', מסלול 3) ולהקות רבות שמעיד על תערובת של ט חלבוני reesei (שליטה חיובית, איור 2 א, במסלול 4).
הגודל של TrCel5A אושר על ידי מכתים נוגדן המכוון לו-6tag שולב TrCel5A C-סופית, שנראה להיות נעדרו גם שולט (איור 2). TrCel5A הודגםלשמור על פעילות endoglucanase ידי zymography CMC (איור 2C, מסלולי 1 ו -2), שבו החלבון קפל יצר אזור פינה חזק, המציין השפלה CMC, באותו הגובה כמו בCoomassie מוכתם ג'ל SDS-PAGE והכתם המערבי. אין פעילות נצפתה עבור תערובות חלבון שאינו cellulase מNTEPs (איור 2C, מסלול 3), ואת התערובת של ט ' חלבוני reesei להפעיל כביקורת חיובית הראו פעילות endoglucanase מרכיבים מרובים (איור 2C, מסלול 4).
כדי לכמת את פעילות cellulolytic של TrCel5A שלושה מבחני היו בשימוש. ראשית, את ההשפלה של 4-MUC נותחה על ידי התבוננות פליטת הקרינה המוגברת ב465 ננומטר (נרגש ב360 ננומטר) של 4-MU שוחרר. TrCel5A הוצג לבזות 4MUC, כפי שעשה דילול 1:1,000 מתערובת זמינה מסחרי של ט ' cellulases reesei (איור 3 א).
ניתוח לכימותהפעילות של TrCel5A נגד CMC נעשה על ידי מדידת שחרורו של אזו לצבוע ב590 ננומטר מאזו-CMC. TrCel5A פעילות בתנאים אלה, הייתה שווה ערך בפעילות לדילול 1:1,000 של תערובת cellulase שהוזכר לעיל (איור 3 ב).
היכולת של TrCel5A להשפיל נייר סינון גם נותחה. עבור assay זה, assay saccharification ראשוני בוצע (כלומר עם פתרון TrCel5A משפיל את נייר הסינון) ולאחר מכן את supernatant נותח על ידי assay PAHBAH לברר את כמות הפחתת סוכרים שוחררו (איור 3 ב).
קלטות איור 1. ביטוי מפעל לבונת TrCel5A וביטוי Heterologous של TrCel5A-mCherry לבאץ משאיר דמיינו ידי הקרינה תחת אור ירוק. ייצוגים סכמטי של קלטת ביטוי הצמח המשמשת לTrCel5A () וTrCel5A-mCherry (ב ') מוצגים. אחרי הביטוי החולף TrCel5A-MC, עלי טבק נבדקו תחת נורמלי (C) או אור ירוק (D). לפאנלים (א) ו (ב) אמרגן CaMV (P35SS) ואות שליחות קטלנית (pA35S) מסומנים בכחול בהיר. 5'-UTR של synthase chalcone (CHS), ואת רצף קידוד His6 (His6) מסומנים בכחול. פפטיד הצמחים מותאמים קודון המנהיג (LPH) נגזר מהשרשרת הכבדה של mAb24 העכברי מתואר בירוק. LPH משיג את הפרשת חלבון רקומביננטי לapoplast, לאחר שאות C-מסוף KDEL, שמסומנת באדום, מעכבת את החלבון לחדר המיון. חיצים לתייג את אתר הקישור לפריימר כדי להגביר את קלטת ביטוי CaMV 35SS. לפאנלים (ג) ו (ד ') היה האור הירוק ננומטר 515 עירור.תמונות צולמו ללא הגדלה.
. איור 2 גודל ובפעילות של TrCel5A שמוצג על ידי-SDS, מערבי סופג, וzymography CMC הפרדת החלבונים המסיסים הכולל:. מצמחי הטבק שבו באו לידי ביטוי TrCel5A transiently לפני (1) ואחרי (2) טיהור ממטרים תרמית; מצמחי טבק שבי TrCel5A לא היה נוכח, גם אחרי ממטרים תרמיים (3); או מתערובת זמינה מסחרי של ט ' cellulases reesei (4). חלבונים מופרדים-SDS הם דמיינו עם מכתים Coomassie הכחול (), סופג מערבי נגד אזורו התג של TrCel5A (ב '), ופעילות cellulase שמוצגת על ידי zymography באמצעות CMC דמיינו באמצעות קונגו אדום (C). PageRuler פלוס(Fermentas) שימש כסמן המולקולרי המשקל (M).
איור 3. כימות פעילות אנזים של TrCel5A. TrCel5A הודגר עם 4-MUC (), אזו-CMC (ב '), ונייר סינון (C) ושפלת המצע נמדדה על ידי שחרורו של fluorophore 4-MU (א'), אזו צבען (ב '), או על ידי כימות הפחתת סוכרים על ידי ניטור שינוי הצבע של PAHBAH (C). כל assay מראה את התוצאות עבור שלושה משכפל. ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן. בכל שלושת מבחני הדגימות נותחו היו חיץ לבד, TrCel5A לאחר טיהור ממטרים תרמית, NTEP (WT NT) לאחר טיהור תרמית ממטרים, ותערובת זמינה מסחרי של ט ' cellulases reesei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטוי רקומביננטי של cellulases הוא תחום עניין רב, בשל הרצון למערכות ייצור דלק ביולוגי יעילים יותר 1. צמחים מציעים אפשרויות רבות לייצור cellulase מוצלח, עם תכונות כגון טכניקות קצירה כלכלית ושיטות autohydrolysis להיות תכונות רצויות מאוד לייצור דלק ביולוגי בקנה מידה גדולה. יתר על כן, השימוש בגרסות מגוירים שונות לייצור חלבונים לאפשר, שינויים במידת צורך, posttranslational 20. שינוי צמחים כדי לאפשר ביטוי מכונן של cellulases, תוך שהיא מציעה יתרונות ברורים, היא שיטת זמן רב אשר עשוי או לא עשוי להיות מוצלחת. טכניקות כגון קיבוע של החלבונים הביעו ומנגנוני ביטוי מושרה להגדיל את הסבירות של ייצור cellulase המוצלח בצמחים, אולם אלה עדיין לקחת חודשים רבים להקים. כאן, שיטות ביטוי חולפות הם הפגינו, כדי להמחיש את הפוטנציאל לcellulase ספציפילהיות מיוצר באמצעות מערכות צמח בתוך ימים ספורים.
התמזגות עם החלבון פלואורסצנטי mCherry שימשה כאן כדי להדגים את ההצלחה של שיטות ביטוי חלבון חולפות. TrCel5A-mCherry בבירור הופץ ברחבי רוב העלים שהיה הסתננו עם Agrobacteria המכיל הווקטור. לוקליזציה לreticulum endoplasmic מאפשרת שינויי posttranslational של החלבון לידי ביטוי. היכולת של מערכת כדי לאפשר ביטוי למשל glycosylation היא חשובה במיוחד עבור אלה cellulases אשר נגזר במקור פטרייתי אורגניזמים, כמו ט reesei 21. מערכות שמרי ביטוי, שהם פופולריים יותר ויותר עבור ביטוי cellulase Heterologous, לעתים קרובות לגרום להיפר-glycosylation של האנזימים, אשר נדונו להיות מכשלה פוטנציאלית לפעילות cellulase מלאה 22. מנגנוני glycosylation הצמח מחדש ללא החסרון של Hyper-glycosylation. בנוסף, ביטוי במערכות מפעל מאפשר ללוקליזציה לאזורים המאפשרים או לא מאפשרים שינויי posttranslational, ובכך מאפשר התאמה למקור של החלבון. יכולה לשמש גם מערכת הפגינה כאן, על ידי היישום של רצפי אות שונים 14, ללוקליזציה לשלפוחית apoplast, הכלורופלסט, cytosol או Golgi. השימוש בהתכת ניאון חלבון, כגון TrCel5A-mCherry, יכול להדגים את ההצלחה של ביטוי חלבון, כמו גם הלוקליזציה של החלבון. עם זאת, conjugates כאלה אינם נדרשים לבדיקות פעילות נוספות. לכן מומלץ כי מבנה אינו mCherry TrCel5A לשמש את כל בדיקות נוספות, כפי שמוצג כאן, כדי לקבל נתונים מדויקים יותר של פעילות cellulase לידי ביטוי. לגבי בקרות לניסויים נוספים, דגימות מצמחים שחדר הלא transiently נתפסות בדרך כלל להיות בקרות נאותות.
class = "jove_content"> אפיון החלבון לידי ביטוי, TrCel5A, על ידי SDS-PAGE ומערבי סופג גילה להקה בכ 40kDa, מה שמעיד על כך שאזור מקשר החלבון כבר ביקע ושהמוצר העיקרי הנגזר היה פפטיד המכיל תחום קטליטי . זו עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים של ביטוי חלבון TrCel5A בצמחים 5. ניתוח zymography של פעילות נגד CMC הצביע על כך שפפטיד שנותר היה פעיל כendoglucanase. בעוד SDS-PAGE ומערבי סופג הם מבחני נפוצים מאוד, zymography CMC הוא הרבה יותר ספציפי מבחן לcellulase (ובפרט endoglucanase) פעילות. גורמים חשובים שיש לזכור לתוצאות zymography מוצלחות) שהמצע (במקרה זה CMC) חייב להיות solubilized לחלוטין ולהתפשט באופן שווה לאורך כל ג'ל; ב) כי החלבון צריך להיות קפל בהצלחה, רצוי בתקופה קצרה כדי להגביל את כמות חלבון דיפוזיה דרך ג'ל; וג) כיassay הפעילות צריך להיות בטמפרטורה האופטימלית עבור האנזים להיות assayed (לTrCel5A בין 50 60 מעלות צלזיוס) וצריך להיות קצר כדי לאפשר ללהקות חדות יותר של השפלה.
ניתוח כמותי של פעילות cellulase של TrCel5A הביע הוכיח כי האנזים היה פעיל נגד מגוון רחב של מצעים, כולל 4-MUC, CMC ונייר סינון. כל אחד מהמצעים נבדק באמצעות מבחן ספקטרוסקופיות שונה, בין אם באמצעות fluorophore (4-MU) או על ידי ניתוח פיזור אור תגובת צבע (אזו לצבוע או PAHBAH). כל שלושה מצעים והמבחנים נמצאים בשימוש נרחב להערכה של פעילות cellulase, והם מבחני קדימה יחסית ישרים. 4-MUC משמש כמצע בסיסי לקביעת פעילות hydrolase glycosyl, כמו מגוון רחב של אנזימים אלה (endoglucanases, exoglucanases וβ-glucosidases) פועל נגדה. המהירות של assay, מספר מוגבל של דרישות, רגישות גבוההוהיכולת של cellulases הרבים לדבוק המצע, שעושה את זה assay שימושי להקרנה כללית לcellulases, או לחיטוט ההצלחה של ריצת ביטוי. נקודה אחת שכדאי לזכור בעת שימוש 4-MUC היא שמצע זה מתאים במיוחד לפעילות של β-glucosidases, מה שהופך את הפעילות של endoglucanases (כגון TrCel5A) או exoglucanases להיראות חלש בהשוואה לβ-glucosidases או תערובות אנזים אשר מכיל β-glucosidases. בעת ביצוע assay 4-MUC עם ריכוזי חלבון נמוכים או רמת פעילות נמוכה אחרת מומלץ לנצל את התוספת של גליצין (pH 10) כפתרון להפסיק, כשינוי החומציות מגביר את הקרינה של 4-MU. CMC הוא מצע ספציפי יותר לאנזים ביטא כאן, כפי שהוא מושפל רק על ידי endoglucanases. Assay אזו-CMC הוא יותר מסובך מזו שעבור 4-MUC, בשל הצורך במשקעים של התאית (ומתנול) על ידי אבץ. היתרון העיקרי של מצע זה, ובכך assay, הוא שהוא ספציפי לפעילות endoglucanase, מה שהופך את זה מאוד שימושי לקביעת אופי cellulase שיופקו. השפלה נייר סינון היא עוד מבחן משותף להקמת פעילות cellulase. הסכום של השפלה שנצפה משתנה תלוי באופן משמעותי על המאפיינים של cellulase המוערך, וזה מצע מועדף לבחינת הפעילות של תערובות אנזים. Assay PAHBAH, המשמש כאן כדי לבחון השפלה נייר סינון, מזהה את כמות הסוכרים שוחררו לאחר saccharification וכך הוא גם ישים למגוון רחב של מצעי דגם לא הפגין כאן, כוללים CMC, lichenan, β גלוקן, α-תאית, AVICEL , Xylan וxyloglucan. עבור assay זה, יש להקפיד לכלול סטנדרטים על אותה הצלחת (או באותו הטווח) כדגימות מוערכות, כוריאציה פעמים דגירה יכולה להוביל להבדלים בתוצאות. לכן, היא גם חשובה לחזור על assay כדי להבטיח דיוק. בנוסף, שליטת מדגם צריכה להיות תמיד לרוץ, שבו המדגם מודגרות ללא המצע תאית, כדי לשלוט על כל סוכרים הפחתה באופן טבעי בדגימות שהיה יכול להיות מזוהה על ידי PAHBAH, ואחרת היה לתת תוצאות חיוביות כוזבות.
לסיכום, שיטות לביטוי והאפיון חולפים של cellulase רקומביננטי הם בבירור. טכניקות אלה מספקות דרך פשוטה לייצר כמויות מספיקות של חלבון לבחינה נוספת של cellulases אחד או יותר, תוך שימוש בבדיקות פעילות כמו אלה שהפגינו כאן. בפרט, שיטות אלה מספקות דרך מהירה כדי לבחון את הפוטנציאל של cellulases המיועד לייצור בPlanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für למות Nutzung פון Biomasse" והאשכול של אקסלנס "דלקים תפורים מביומסה", אשר ממומן באמצעות יוזמת המצוינות על ידי הממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית לקידום מדע ומחקר באוניברסיטאות גרמנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
