Summary
As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.
Abstract
Enzimas degradantes Celulose, celulases, são alvos de pesquisa e interesses industriais. A preponderância destas enzimas in-a-cultura difíceis organismos, tais como fungos de construção de hifas e bactérias anaeróbias, acelerou o uso de tecnologias recombinantes neste campo. Métodos de expressão de plantas são um sistema conveniente para a produção em grande escala de enzimas e outras proteínas industrialmente úteis. Nisto, os métodos para a expressão transiente de uma endoglucanase de fungos, Trichoderma reesei Cel5A, Nicotiana tabacum são demonstradas. A expressão da proteína de sucesso é mostrado, monitorizada por fluorescência utilizando uma proteína de fusão mCherry enzima. Além disso, um conjunto de ensaios de base são usadas para examinar a actividade de T. expresso transitoriamente reesei Cel5A, incluindo SDS-PAGE, Western blot, zimografia, bem como a fluorescência e ensaios de degradação de substrato à base de corantes. O sistema aqui descrito pode ser usado para produzir uma célula activaULASE em um curto período de tempo, de modo a avaliar o potencial de produção em plantas através de sistemas de expressão constitutiva ou induzida.
Introduction
Degradação de biomassa lignocelulósica e sua conversão em combustível líquido foi concebido como um método para reduzir a dependência dos combustíveis fósseis. Um obstáculo significativo na criação de sistemas de processamento de biomassa é economicamente viáveis na degradação enzimática da celulose e hemicelulose 1. Os sistemas de expressão de plantas apresentam um grande potencial para a produção de enzimas a uma escala industrial. Agricultura, sistemas para instalações de colheita economicamente e em termos de volume já estão estabelecidos, como têm sido há milhares de anos. A produção de celulases em plantas é desejável devido a factores tais como a facilidade de autohydrolysis 2, e o potencial para maximizar o uso de níveis mais baixos de enzima, aumentando a digestibilidade das paredes das células das plantas 1. Finalmente, sistemas de plantas permitir o direccionamento das proteínas recombinantes para áreas específicas de células de plantas e são capazes de modificar posttranslationally enzimas onde requeridas 3.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tabaco) é muito comumente utilizado como um organismo modelo para estudos de expressão de proteínas heterólogas em plantas, devido ao seu rápido crescimento e de biomassa de acumulação de recursos 4. A expressão transitória de proteínas recombinantes é uma técnica que permite a produção de proteína em períodos de tempo curtos 5, enquanto mantém a flexibilidade como para a localização e, portanto, as modificações pós-traducionais das proteínas seleccionadas, ou seja, celulases. Isso permite a produção de celulase (s) para a análise básica, ao mesmo tempo, preparando o terreno para novas estratégias de expressão em plantas. Usando essa estratégia expressão transitória, uma endoglucanase de glicosil hidrolases da família 5, Cel5A, derivado do hospedeiro do fungo Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 é produzido (doravante referida como TrCel5A). TrCel5A é uma proteína de 42 kDa, que é nativamente glicosilada e é altamente ativo em hidráulicaroylzing cadeias de celulose 7.
A técnica de expressão transitória descrito aqui baseia-se num sistema relativamente comumente utilizado, infiltrando-se as folhas das plantas com a Agrobacterium transportando o gene de interesse num vector de expressão apropriado. Para permitir a análise rápida de expressão bem sucedida em planta, TrCel5A também pode ser expressa como uma proteína de fusão com mCherry, uma proteína fluorescente monomérica originalmente derivada de Discosoma sp. Proteína dsRed 8, com um período adicional de seis resíduos de histidina (His-tag) fundido com a o C-terminal (TrCel5A-mCherry). Expressão da proteína de fusão heteróloga, TrCel5A-mCherry, pode, assim, ser controlada dentro da planta em crescimento usando luz verde para examinar mCherry dispersão. Se desejado, as secções finas de material de planta pode ser examinado sob luz verde ao microscópio para estabelecer a localização específica da proteína. Para este trabalho, sinal e transentar péptidos foram incorporadas na construção para a localização da exportação da proteína heteróloga para o retículo endoplasmático 9.
Para analisar a actividade de plantas, incluindo as celulases expressas TrCel5A, uma série de testes de actividade de celulase pode ser executado. Após a extracção do total de proteínas vegetais solúveis, TrCel5A podem ser parcialmente purificadas utilizando uma técnica de incubação térmica. O tamanho da proteína é efectuada por meio de SDS-PAGE seguido por Western blot. Zimografia pode ser utilizado para analisar a actividade contra os substratos, por exemplo, de celulose, que foi carboxi-metilado (fazendo carboximetilcelulose: CMC) para a solubilidade 10. Actividade de celulase e glicosidase pode ser monitorizada utilizando o fluoróforo 4-metilumbeliferilo (4-MU), associada com β-D-celobiósido (combinados: 4-MUC). Outro método para avaliar a actividade de endoglucanase envolve a análise de espectrometria de CMC que tem sido associado com um azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Além disso, a actividade da proteína de ambas as endoglucanases e uma variedade de celulases pode ser monitorizado pela utilização de um teste de análise de açúcar, tais como a hidrazida de p-hidroxi-benzóico (PAHBAH) ensaio de 12. Estas técnicas podem ser utilizados para elucidar e quantificar a actividade da celulase expressa de interesse.
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Protocol
1. Crescimento do tipo selvagem de N. tabacum plantas
- Para crescer N. tabacum L. cv. Plantas Petit Havana SR1 no solo, colocar sementes de tabaco em potes adequados cheios de envasamento solo normal para a germinação. Após 2 semanas, a transferência de mudas para vasos individuais. Incubar as plantas em uma estufa com constante de 22 ° C (período escuro) ou 25 ° C (período de luz) e 70% de umidade relativa do ar. Fornecer iluminação em um ciclo claro / escuro 16/8 h luz (por exemplo, Philips IP65 400 lâmpadas W; 180 mol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) e água diariamente.
2. Expressão transiente de TrCel5A e TrCel5A-mCherry Proteínas
- Sob condições estéreis, escolher colónias isoladas de Agrobacterium Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) contendo ou pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry e transferir para um erlenmeyer contendo 10 ml de extrato de leveduracaldo (YEB, preparado de acordo com as especificações dos fabricantes) médio e canamicina (50 mg / ml), rifampicina (50 mg / ml), e carbenicilina (100 mg / ml) para a selecção. Incubar durante 36-40 horas a 26 ° C e 180 rpm. Nota: A concepção de construções apropriadas para a expressão da proteína está fora do âmbito deste documento, mas a título indicativo, os métodos de Maclean et al 13 e Munro e Pellham 14 pode ser seguido para a construção de criação..
- Tomar 200 mL de cada cultura para inocular 20 ml de YEB com as concentrações de antibióticos acima mencionados e incubar sob as mesmas condições que anteriormente.
- Após 36-40 horas, as culturas preinduce por adição de 2 ul acetosyringon (200 uM concentração final), 100 ul de 40% (w / v) de uma solução de glucose e 200 ul de 1 M de MES pH 5,6. Incubar durante a noite.
- Preparar 100 ml de um tampão de infiltração 2x (sais basais de 100 g / L de sacarose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige e Skoog, Ajustar o pH para 5,6 utilizando hidróxido de potássio).
- Medida OD600 das culturas com diluições de 1:05 até atingir uma OD 600 de 5-6. Calcular o volume necessário para a cultura de 30 ml de meio de infiltração a OD 600. Adicionar 15 ml de tampão de infiltração 2x, em seguida, adicionar H2O desionizada para tornar o tampão até 30 ml.
- Tome plantas de estufa e usar uma ponteira para nick do lado abaxial da 3 ª a 5 ª folha a partir do topo para facilitar a infiltração.
- Use uma ponteira de nick o lado abaxial das folhas para facilitar a infiltração.
- Encha uma seringa com meio de infiltração e colocá-lo (sem agulha) em um dos nicks feitas anteriormente. Apoio seringa com um dedo no lado inferior das folhas. Pressione o meio com cuidado para o tecido das zonas folha internervais. Nota: Após a infiltração, cultivar plantas em estufa sob as mesmas condições que as descritas acima. Além disso, manter uma proporção igual de untreated, plantas não-transitórios de expressão (NTEPs) como controles, nas mesmas condições que as plantas infiltrada.
3. Avaliação da TrCel5A-mCherry Expressão em folhas de plantas
- Depois de 4-6 dias, tome plantas infiltrados com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry do efeito estufa e colocá-los em um quarto escuro por análise de fluorescência.
- Para visualizar a fluorescência em secções foliares expressando TrCel5A-mCherry, as plantas de luz usando uma fonte de luz portátil que emite luz verde a 515 nm com um filtro vermelho (620-750 nm). Nota: Em profundidade caracterização da expressão da proteína nas folhas de plantas pode ser conseguida por folhas finas, corte com um vibratome e exame sob luz e microscopia de fluorescência. Para isso, siga os passos abaixo:
- Cortar pequenas secções de aproximadamente 5 x 5 mm de tamanho a partir de uma folha infiltrada e incorporá-las em 4% de agarose dissolvido em 50 mM de tampão de fosfato (pH 5,7).
- Cortesecção de 80-90 mM de tamanho das folhas incorporadas utilizando um vibratome. Coloque-as sobre uma lâmina de microscópio, cobrir com um tampão ou uma lamela e examiná-las usando um microscópio no aumento de 10x com um detector de fluorescência, usando o mesmo comprimento de onda e filtro indicado acima.
4. TrCel5A extração de folhas de tabaco
- Cortar pedaços de folhas de tabaco para um peso aproximado de 1 g a partir de plantas infectadas com A. Agrobacterium contendo pTRAkc-ER-TrCel5A e coloque em uma argamassa pré-resfriada com nitrogênio líquido. Adicionar uma quantidade apropriada de azoto líquido para as amostras. Moer deixa de pó usando um pilão pré-resfriada.
- Adicionar 2 ml de tampão fosfato salino (PBS) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, para a folha de matéria solo e misturar até que a maior parte da matéria de folha é em suspensão. Extracto de centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína.
- Centrifuge o extracto a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C e levar sobrenadante contendo proteína tendo cuidado para não perturbar o sedimento. Desprezar o pelete.
- Purificar parcialmente TrCel5A por incubação do sobrenadante que continha a proteína, a 55 ° C durante 10 min. Deixa-se repousar à temperatura ambiente durante mais 10 minutos, depois centrifugar a 15000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Repita o processo de purificação parcial para plantas não-infiltrados para obter amostras de controle. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses.
- Repetir o processo de purificação parcial por plantas não infiltrada para obter amostras de controlo. Usar estas amostras para todas as experiências seguintes. Nota: As soluções de proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma semana ou a -20 ° C durante até 3 meses.
5. SDS-PAGE, Western Blot, e Azo-CMC zimografia de TrCel5A-mCherry </ P>
- Compra ou preparar 12% (p / v) géis SDS-PAGE como por métodos estabelecidos 15.
- Dissolver CMC em água para obter uma solução a 1,5% (w / v). Para fazer géis de CMC-SDS-PAGE, substitui 1 ml de 1,5% de CMC para 1 ml de água em uma solução de 10 ml de mistura de gel de SDS-PAGE, o que resulta em um 0,1% (w / v) de CMC + 12% (w / v ) mistura em gel de SDS-PAGE. Despeje gel normalmente. Nota: certifique-se de que a CMC na solução inicial é completamente dissolvida por uma combinação de agitação e aquecimento para 40 ° C (repetir directamente antes da preparação da solução de gel).
- Desnaturar amostras por ebulição na presença de SDS, de acordo com métodos estabelecidos 12. Como um controlo positivo, usar uma diluição de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:500 reesei, tal como T. reesei ATCC 26921. Como controlo negativo utilizar uma solução de proteínas preparada de modo semelhante a partir de folhas não infiltrados (NTEPs).
- Efectuar a eletroforese conforme protocolos normais 15,por exemplo, utilizar ~ 200 V durante 50 min com a electroforese interrompida uma vez a frente do corante atingir o fundo do gel.
- Manchar um gel de SDS-PAGE utilizando 0,1% (w / v) de azul brilhante de Coomassie e destain usando uma mistura de metanol / ácido acético glacial. Nota: a coloração rápida e de descoloração pode ser realizada por aquecimento suave a coloração e descoloração de soluções, ou seja, usando um forno de microondas para ~ 15 seg para aquecer (mas não ferver) primeiro a coloração e, em seguida, as soluções de descoloração, mudando a solução de descoloração após 10 min ou quando esfriou, e repetir com a nova solução de descoloração.
- Realizar Western blot de um gel de SDS-PAGE utilizando os protocolos estabelecidos 16,17. Usar os seguintes anticorpos: um anticorpo policlonal de coelho contra uma região Fc de His-tag (primário) e um anticorpo policlonal de cabra anti-anticorpo de coelho que foi conjugado com uma fosfatase alcalina (secundário). Nota: Os anticorpos secundários devem ser seleccionados para permitir a visualização utilizando nitroazul tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-p-toluidina indolyphosphate sal (NBT / BCIP), tal como descrito 18.
- Realizar proteína em gel redobramento no 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel de 1,5% (w / v) β-ciclodextrina, tampão fosfato-citrato 20 mM, pH 6,5, à temperatura ambiente com agitação suave durante 15 min 19.
- Descartar a solução β-ciclodextrina e lavar rapidamente o gel com H 2 O. Incubar à temperatura ambiente em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 4,8) durante mais 15 min. Realizar CMC zimografia utilizando a 0,15% de CMC em gel de SDS-PAGE redobradas por incubação do gel em 30 mM de acetato de sódio tampão pH 4,8, durante 20 min a 50 ° C.
- Realizar CMC zimografia utilizando o redobrado 0,15% (w / v) de gel de CMC de SDS-PAGE através da incubação do gel em tampão de acetato de sódio 30 mM (pH 4,8) durante 20 min a 50 ° C.
- Corar o gel durante 10 min utilizando um 0.1% w / v de solução de vermelho de Congo e destain durante 30 minutos ou até que as bandas claras são observadas utilizando 1 M de NaCl. Lavar o gel com 0,3% (v / v) de ácido acético para melhor visualização.
6. MUC-4 Ensaio da Actividade de TrCel5A
- Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4-MUC em 50% (v / v) de metanol, e armazená-lo no escuro à temperatura ambiente
- Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 4-MUC 2x, composto de 1 mM de 4-MUC e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8.
- Realizar este teste em amostras contendo 100 ul de proteína de folha (com ou sem TrCel5A expressa por indução), 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. 1:1.000 reesei e puro H2O, respectivamente. Execute cada uma das amostras em triplicata.
- Pipete 100 pi da solução de trabalho de 4-MUC em poços separados de uma placa de 96 poços, em seguida adicionar 100 ul de cada amostra.
- Determinar 0 min ponto temporal de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, utilizando um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.
- Incubar as placas por 20min a 50 ° C, cobertas com tampas de adesivo para evitar a evaporação. Parar a reacção por congelação (ou pela combinação de 100 mL de 0,15 M de glicina, pH 10,0, e 100 ul de amostra de uma placa separada).
- Determinar o ponto final de 4-MU fluorescência através de espectroscopia de fluorescência, usando um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm. Subtrair 0 min a partir do terminal (20 min), ponto de tempo para obter a alteração dos valores de fluorescência.
7. Azo-carboximetil celulose Ensaio da Actividade de TrCel5A
- Preparar um estoque de 1,5% (w / v) Azo-CMC que é armazenada à TA, e uma solução de precipitação contendo 18 mM de acetato de zinco, 0,5 M de acetato de sódio, pH 5 e 80% de etanol (v / v), na loja quarto temperatura.
- Imediatamente antes do ensaio, preparar uma solução 2x Azo-CMC a trabalhar, composto por 1% (w / v) Azo-CMC (em H 2 O) e 60 mM de acetato de sódio, pH 4,8.
- Combinar 50 mL de amostra e 50 ul do trabalhoing solução em tubos de 1,5 ml.
- As amostras de ensaio contendo 50 ul de proteína de folhas (com ou sem TrCel5A transitoriamente expressa); 100 ul de uma mistura de celulase disponível comercialmente a partir de T. reesei diluído 1:1.000; pura e H 2 O. Executar amostras e padrões em triplicata.
- Incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C. Parar a reacção por adição de 250 ul de solução de precipitação. Vortex cada amostra vigorosamente durante 10 segundos para garantir soluções foram completamente combinados.
- Incubar as amostras a temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, novamente vórtice. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 10 min. Remover 200 ul de cada sobrenadante da amostra para uma placa de 96 poços, tendo cuidado para não perturbar o sedimento.
- Ensaio usando espectroscopia de absorvância a um comprimento de onda de 590 nm.
8. PAHBAH Ensaio de TrCel5A
- Use um furador para cortar um círculo (~ 5,5 milímetros de diâmetro) de papel de filtro. Adicionar 100 ul de NaAc 60 mM, pH 4,8, e 100 ul de amostras, ou contendo proteína folha (com ou sem TrCel5A por indução expresso) ou um T. comercial mistura de celulase reesei, diluído 1:1000, e incubar com círculos de papel de filtro durante 20 horas a 50 ° C com agitação de 300 rpm. Para cada amostra incubada com papel de filtro, também incubar uma solução duplicata sem papel filtro como amostras-controles individuais.
- Prepara-se uma 330 mM de p-hidroxi-hidrazida do ácido benzóico (PAHBAH) Uma solução por dissolução de PAHBAH em H 2 O, com a adição de 5 ml de HCl concentrado, para um total de 100 ml de solução, e armazenamento à temperatura ambiente. Nota: Os melhores resultados são obtidos pela adição do HCl a um menor volume de lama PAHBAH, isto é, 30 ml, que é agitada sob temperatura para ajudar a dissolução, antes de fazer o volume para 100 ml com H 2 O.
- Prepare PAHBAH solução B, contendo citrato de sódio 50 mM, cloreto de cálcio 10 mM, e 500 mM de NaOH e armazenamento à temperatura ambiente.
- Immediately antes do ensaio, preparar uma solução de trabalho de 1,5 x de reagente PAHBAH 1 ml de 9 ml de solução tampão, de armazenar em gelo até à sua utilização (para ser utilizado dentro de 4 horas).
- Preparar as amostras em termoestáveis 0,2 ou tubos de 0,5 ml. Combinar 5 ul de cada solução incubadas com papel de filtro (passo 8.1), 45 ul de H2O e 100 ul de solução de trabalho de PAHBAH. Controles de exemplo (amostras incubadas sem filtro de papel) deve ser executado nas mesmas concentrações (5 mL da amostra, 45 2 O, solução de trabalho de 100 mL PAHBAH mL H). Além disso, teste 5 padrões (5 ul) contendo entre 0 e 0,2 g / L de glicose, e puro H2O Executar amostras e padrões em triplicata.
- Incubar as amostras durante exactamente 10 minutos a 100 ° C, depois arrefecer à temperatura ambiente, durante exactamente 10 min. Soluções de pipeta para uma placa de 96 poços e espectroscopicamente ensaio num comprimento de onda de 410 nm. Subtrair amostra-controles individuais (incubadas sem filtro de papel) a partir de amostras para obter últimavalores.
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Representative Results
TrCel5A e TrCel5A-mCherry foram expressos com sucesso em plantas do tabaco usando o sistema de expressão transiente (Figuras 1A e 1B). O exame do modelo da proteína de fusão TrCel5A-mCherry expressão revelado folhas saudáveis (Figura 1C), que mostrou a expressão de proteínas largamente espalhada sob luz verde (Figura 1D).
Extracção das proteínas totais foi realizada em plantas de tabaco que tinham folhas que continham a proteína expressa de forma transiente TrCel5A e SDS-PAGE mostrou uma grande variedade de proteínas estavam presentes (Figura 2A, pista 1). A amostra de proteína total solúvel, a partir de plantas e TrCel5A expressando uma amostra de proteína solúvel total obtido NTEPs, foram incubadas durante 10 min a 55 ° C. TrCel5A permanece estável e activo, a 55 ° C, enquanto que muitas outras proteínas nativas (tabaco) não são estáveis a esta temperatura. Assim, muitos não-essential proteínas foram precipitadas por este tratamento, deixando um extracto parcialmente purificado de TrCel5A. Após este passo de precipitação térmica, uma banda de proteína forte foi observada a ~ 40 kDa (Figura 2A, pista 1). Isto é provável que seja o domínio catalítico (CD) do TrCel5A, que tem sido mostrado previamente para executar a este tamanho, quando expressos em plantas 4. A amostras de controlo (Figura 2A, pistas 3 e 4, respectivamente) negativos e positivos mostraram baixas concentrações de proteínas restantes tabaco termotolerantes do NTEPs (controlo negativo, Figura 2A, pista 3) e várias bandas, indicando uma mistura de T. proteínas de T. reesei (controlo positivo, Figura 2A, pista 4).
O tamanho do TrCel5A foi confirmada por coloração com anticorpo dirigido para o 6tag Sua incorporada no TrCel5A terminal C, o que foi considerado estar ausente para ambos os controlos (Figura 2B). O TrCel5A foi demonstradoreter a actividade de endoglucanase por CMC zimografia (Figura 2C, pistas 1 e 2), em que a proteína redobrada criada uma área limpa forte, indicando degradação CMC, na mesma altura no gel corado com Coomassie SDS-PAGE e Western blot. Nenhuma actividade foi observada para as misturas de proteínas não-celulase de NTEPs (Figura 2C, faixa 3), e a mistura de T. proteínas de T. reesei são executados como um controlo positivo apresentou actividade de endoglucanase a partir de vários componentes (Figura 2C, faixa 4).
Para quantificar a atividade celulolítica de TrCel5A foram utilizados três ensaios. Em primeiro lugar, a degradação de 4-MUC foi analisada por meio da observação do aumento da emissão de fluorescência a 465 nm (excitado a 360 nm) da autorização de 4-MU. TrCel5A mostrou degradar 4MUC, tal como uma diluição de 1:1000 de uma mistura disponível comercialmente de T. celulases de T. reesei (Figura 3A).
Uma análise quantificávelda actividade de TrCel5A contra CMC foi feito através da medição da libertação de um corante azo a 590 nm a partir de Azo-CMC. TrCel5A actividade sob estas condições, era equivalente em actividade a uma diluição de 1:1000 da mistura de celulase acima mencionada (Figura 3B).
A capacidade de TrCel5A para degradar papel de filtro também foi analisada. Para este ensaio, um ensaio de sacarificação inicial foi realizada (isto é, com a solução TrCel5A degradação do papel de filtro) e, em seguida, o sobrenadante foi analisado pelo ensaio de PAHBAH para determinar a quantidade de açúcares redutores libertados (Figura 3B).
Cassetes de expressão de plantas, a Figura 1. De construções TrCel5A e expressão heteróloga de TrCel5A-mCherry em quetabaco deixa visualizada por fluorescência sob luz verde. representações esquemáticas de cassete de expressão planta usada para TrCel5A (A) e TrCel5A-mCherry (B) são mostrados. Depois de expressão transitória TrCel5A-MC, folhas de tabaco foram examinados em condições normais (C) ou a luz verde (D). Para os painéis (A) e (B), o promotor de CaMV (P35SS) e do sinal de terminação (pA35S) são indicados em azul claro. 5'-UTR de chalcona sintetase (CHS), e a sequência de codificação de His6 (His6) são indicados em azul. A planta com codões optimizados peptídeo líder (LPH) derivada da cadeia pesada de murino o mAb24 está representado em verde. LPH atinge a secreção da proteína recombinante para o apoplasto, após o que um sinal KDEL C-terminal, indicada em vermelho, retarda a proteína para o ER. Setas rotular o sítio de ligação para o iniciador para amplificar a cassete de expressão CaMV 35SS. Para os painéis (c) e (D) a luz verde tinha uma excitação 515 nm.As imagens foram tomadas sem ampliação.
. Figura 2 Tamanho e actividade de TrCel5A mostrado por SDS-PAGE, Western blot, e CMC zimografia Separação das proteínas solúveis totais:. Partir de plantas de tabaco, onde TrCel5A foi transitoriamente expressos antes (1) e depois (2) a precipitação térmica purificação; a partir de plantas de tabaco, onde TrCel5A não estava presente, também, após a precipitação térmica (3); ou de uma mistura disponível comercialmente de T. celulases de T. reesei (4). Proteínas separadas por SDS-PAGE são visualizados com coloração com azul de Coomassie (A), transferência de Western contra a região do His-Tag de TrCel5A (B), e a actividade de celulase mostrada por zimografia utilizando CMC visualizada utilizando Vermelho do Congo (C). Além disso PageRuler(Fermentas) foi utilizado como o marcador de peso molecular (M).
Figura 3. Enzima actividade quantificação de TrCel5A. TrCel5A foi incubado com 4-MUC (A), azo-CMC (B), e papel de filtro (C) e a degradação do substrato, medida pela libertação do fluoróforo de 4-MU (A), um azo-corante (B), ou por meio da quantificação de açúcares redutores pela monitorização da alteração de cor de PAHBAH (C). Cada ensaio mostra os resultados para três repetições. As barras de erro indicam o desvio padrão. Em todos os três ensaios as amostras analisadas foram tampão sozinho, TrCel5A após precipitação térmica purificação, NTEP (WT Nt) após purificação precipitação térmica, e uma mistura disponível comercialmente de T. celulases reesei.
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Discussion
A expressão recombinante de celulases é um campo de grande interesse, devido ao desejo de sistemas de produção de biocombustíveis mais eficientes 1. As plantas oferecem muitas possibilidades para a produção de celulase de sucesso, com recursos como técnicas de colheita econômica e métodos autohydrolysis sendo propriedades muito desejáveis para a produção de biocombustíveis em larga escala. Além disso, o uso de diferentes localizações para a produção de proteínas de permitir, se necessário, as modificações pós-tradução 20. Alterando as plantas, para permitir a expressão constitutiva de celulases, oferecendo vantagens óbvias, é um método demorado que pode ou não pode ser bem sucedida. Técnicas tais como o sequestro de proteínas expressas e mecanismos de expressão induzível aumentar a probabilidade de produção de celulase de sucesso em plantas, no entanto estas ainda levar muitos meses a estabelecer. Aqui, os métodos de expressão transiente são demonstradas, para ilustrar o potencial de uma celulase específicapara ser produzido através de sistemas de plantas dentro de uma questão de dias.
A fusão com a proteína fluorescente mCherry foi aqui utilizado para demonstrar o sucesso dos métodos de expressão de proteína transiente. TrCel5A-mCherry foi claramente distribuído por toda a parte das folhas que tinham sido infiltradas com o contendo o vector Agrobacterium. Localização no retículo endoplasmático permite modificações pós-tradução da proteína expressa. A capacidade de um sistema de expressão, para permitir por exemplo a glicosilação é particularmente importante para as celulases, que são originalmente derivados de organismos fúngicos, como T. reesei 21. Sistemas de expressão de levedura, que são cada vez mais popular para a expressão heteróloga de celulase, freqüentemente resultam em hiper-glicosilação das enzimas, que se debate a ser um obstáculo potencial para a atividade de celulase total 22. Glicosilação Planta mecanismos de umre sem a desvantagem de hiper-glicosilação. Além disso, a expressão em sistemas de plantas permite a localização de áreas que permitem ou que não permitam modificações pós-tradução, permitindo, assim, a adaptação para a fonte de proteína. O sistema demonstrado aqui também pode ser utilizado, mediante a aplicação de diferentes sequências de sinal 14, para a localização de apoplasto, cloroplastos, vesículas citosol ou Golgi. A utilização de fusões de proteínas fluorescentes, tais como TrCel5A-mCherry, pode demonstrar o sucesso da expressão da proteína, bem como a localização da proteína. No entanto, tais conjugados não são necessários para outros testes de actividade. Assim, recomenda-se que uma construção não-mCherry TrCel5A ser utilizado para todos os outros testes, como foi mostrado, para obter dados mais exactos para a celulase expressa actividade. Quanto controles para novos experimentos, amostras de plantas não-transitoriamente infiltrados são geralmente vistos como controles adequados.
A análise quantitativa da actividade de celulase de TrCel5A expressa demonstraram que a enzima era activa contra uma variedade de substratos, incluindo 4-MUC, CMC e papel de filtro. Cada um dos substratos foi examinada usando um teste de espectroscopia diferente, seja por meio de um fluoróforo (4-MU), ou por análise de dispersão da luz de uma reacção de cor (Azo-corante ou PAHBAH). Todos os três substratos e ensaios são amplamente utilizados para a avaliação da atividade de celulase, e são ensaios relativamente simples. 4-MUC é usado como um substrato de base para determinar a actividade da glicosil hidrolase, como uma grande variedade destas enzimas (endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidases) são activos contra ele. A velocidade de ensaio, o número limitado de requisitos, de alta sensibilidadee capacidade de muitos celulases para clivar o substrato, torna este um ensaio útil para a seleção geral para celulases, ou para sondar o sucesso de uma corrida de expressão. Um ponto a ter em conta quando se utiliza 4-MUC é que este substrato é particularmente adequado para a actividade de β-glucosidases, tornando a actividade de endoglucanases (tais como TrCel5A) ou exoglucanases aparecer fraco em comparação com β-glucosidases ou misturas de enzimas que conter β-glucosidases. Ao realizar um ensaio MUC-4 com baixas concentrações de proteínas ou os níveis de actividade de outra forma baixos, recomenda-se utilizar a adição de glicina (pH 10) como uma solução de paragem, tal como a alteração do pH melhora a fluorescência de 4-MU. CMC é um substrato mais específico para a enzima expressa aqui, uma vez que só é degradada pela endoglucanases. O ensaio de Azo-CMC é mais complicada do que a de 4-MUC, devido à necessidade de precipitação da celulose (e metanol) por zinco. A principal vantagem deste substrato e, portanto, ensaio, É que é específico para a actividade de endoglucanase, tornando-se muito útil para a determinação da natureza da celulase a ser produzido. A degradação do papel de filtro é mais um teste comum para o estabelecimento de atividade da celulase. A quantidade de degradação observada varia significativamente dependente das propriedades da celulase a ser avaliada, e é um substrato preferido para a análise da actividade de misturas de enzimas. O ensaio de PAHBAH, aqui utilizada para analisar a degradação do papel de filtro, reconhece a quantidade de açúcares libertados depois de sacarificação e assim também é aplicável a uma ampla gama de substratos modelo não demonstrou aqui, incluindo CMC, liquenano, β-glucana, α-celulose, AVICEL , xilana e xiloglucano. Para este ensaio, devem ser tomados cuidados para incluir normas sobre a mesma placa (ou no mesmo prazo) que as amostras sendo avaliadas, como a variação nos tempos de incubação pode levar a diferenças nos resultados. É, assim, importante também para repetir o ensaio para assegurar a precisão. Adicionalmente, Uma amostra de controlo devem sempre ser executado, em que a amostra é incubada sem o substrato de celulose, para controlar quaisquer açúcares redutores naturalmente presentes nas amostras que podem ser identificadas pelo PAHBAH, e, caso contrário, dar falsos resultados positivos.
Em conclusão, os métodos para a expressão transitória e a caracterização de uma celulase recombinante são claramente demonstrado. Essas técnicas fornecem uma maneira simples de gerar uma quantidade suficiente de proteína para uma análise mais aprofundada de um ou mais celulases, por meio de testes de atividade, como os demonstrados aqui. Em particular, estes métodos de proporcionar uma maneira rápida para examinar o potencial de celulases designados para a produção em planta.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo BMBF Forschungsinitiative "Bioenergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" eo Cluster de Excelência "Combustíveis sob medida a partir de biomassa", que é financiado através da Iniciativa de Excelência pelos governos federal e estaduais alemães para promover a ciência e pesquisa em universidades alemãs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
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