Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Abstract

Zellulose abbauende Enzyme, Cellulasen, sind Ziele der Forschung und industriellen Interessen. Das Übergewicht dieser Enzyme in schwer Kulturorganismen wie Hyphen bild Pilze und anaeroben Bakterien, ist die Verwendung von rekombinanten Technologien in diesem Bereich beschleunigt. Pflanzenexpressionsverfahren sind ein wünschenswertes System zur großtechnischen Herstellung von Enzymen und anderen industriell nützlichen Proteinen. Hierin sind Verfahren für die transiente Expression eines Pilz-Endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum demonstriert. Erfolgreiche Proteinexpression angezeigt wird, durch Fluoreszenz mit einem mCherry-Enzym-Fusionsproteins überwacht. Zusätzlich ist ein Satz von Basistests werden verwendet, um die Aktivität von transient exprimierten T. prüfen reesei Cel5A, einschließlich SDS-PAGE, Western Blot, Zymographie, wie Fluoreszenz-und farbstoffbasierten Substratabbau Assays. Das hier beschriebene System kann auf eine aktive Zelle verwendet werdenULASE in einer kurzen Zeitperiode, um so das Potential für die weitere Produktion in Pflanzen durch konstitutive oder induzierbare Expressionssysteme zu beurteilen.

Introduction

Der Abbau von Lignocellulose-Biomasse und deren Umwandlung in flüssigen Kraftstoff als ein Verfahren, um die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen verringern vorgestellt worden. Eine wesentliche Hürde bei der Gründung wirtschaftlich machbar Biomasse Verarbeitungssysteme ist in den enzymatischen Abbau von Cellulose und Hemicellulose ein. Pflanzenexpressionssystemen zeigen großes Potenzial für die Produktion von Enzymen im industriellen Maßstab. Landwirtschaftliche Anlagen bis zur Ernte Pflanzen wirtschaftlich und Volumen bereits etabliert sind, wie sie seit Tausenden von Jahren. Die Produktion von Cellulasen in Pflanzen aufgrund von Faktoren wie die Leichtigkeit der Autohydrolyse 2, und das Potential für die Maximierung der Verwendung von geringeren Enzymmengen durch die Erhöhung der Verdaulichkeit von Pflanzenzellwänden 1 wünschenswert. Schließlich Anlagensysteme ermöglichen die Ausrichtung von rekombinanten Proteinen, um bestimmte Bereiche von Pflanzenzellen und sind in der Lage, Enzyme posttranslational wo erforderlich 3 ändern.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (Tabak) ist sehr häufig als Modellorganismus für die heterologe Proteinexpressionsstudien in Pflanzen verwendet wird, durch sein schnelles Wachstum und Biomasseakkumulation verfügt über 4. Transiente Expression von rekombinanten Proteinen ist eine Technik, die die Proteinproduktion können in kurzen Zeitperioden 5, wobei die Flexibilität in Bezug auf die Lokalisierung und somit posttranslationale Modifikationen der Proteine ​​ausgewählt, dh Cellulasen. Dies ermöglicht die Herstellung der Cellulase (n) für die Grundlagenanalyse, aber auch die Grundlagen für weitere Expressionsstrategien in Pflanzen. Unter Verwendung eines solchen transienten Expressionsstrategie ist eine Endoglucanase aus Glykosylhydrolase Familie 5, Cel5A von der Pilzwirts Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) abgeleitet 6 hergestellt (nachstehend als TrCel5A bezeichnet). TrCel5A ist ein 42 kDa Protein, das nativ glykosyliert ist und in hyd hochaktivenroylzing Celluloseketten 7.

Die transiente Expression Technik hier beschrieben wird, auf einem relativ häufigsten verwendete System basiert, Infiltrieren des Pflanzenblätter mit Agrobakterien, die das Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Um für eine schnelle Analyse der in planta Ausdruck erfolgreich zu ermöglichen, können TrCel5A auch als Fusionsprotein mit mCherry, einer monomeren fluoreszierenden Protein ursprünglich aus Discosoma sp ausgedrückt werden. Protein DsRed 8, mit weiteren sechs Histidin-Reste (His-Tag) fusioniert der C-Terminus (TrCel5A-mCherry). Expression der heterologen Fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kann somit innerhalb der wachsenden Pflanze durch Verwendung von grünem Licht zu untersuchen mCherry Verbreitung überwacht werden. Wenn gewünscht, kann Dünnschnitte des Pflanzenmaterials unter grünem Licht mikroskopisch untersucht werden, um die spezifische Lokalisation des Proteins zu etablieren. Für diese Arbeit, Signal-und Übersitzen Peptide wurden in das Konstrukt eingebracht, um das heterologe Protein den Export nach dem endoplasmatischen Retikulum 9 lokalisieren.

Zur Analyse der Aktivität der Pflanze exprimiert Cellulasen, einschließlich TrCel5A eine Anzahl von Cellulase-Aktivitätstests ausgeführt werden kann. Nach der Extraktion der gesamten löslichen Pflanzenproteinen, kann TrCel5A teilweise unter Verwendung eines thermischen Inkubation Technik gereinigt werden. Proteingröße wird mit SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot etabliert. Zymographie kann verwendet werden, um die Aktivität gegen Gründen, z. B. Zellulose, die seit Carboxy-methylierte hat zu analysieren (was Carboxymethylcellulose: CMC) für die Löslichkeit 10. Cellulase und Glucosidase-Aktivität kann mit dem Fluorophor 4-Methylumbelliferyl-(4-MU) mit β-D-cellobiosid assoziiert (4-MUC kombiniert) überwacht werden. Ein weiteres Verfahren zur Endoglucanase-Aktivität zu beurteilen beinhaltet die spektrometrische Analyse der CMC, die mit einer Azo-d zugeordnet worden istihr (Remazolbrilliant Blue R) 11. Darüber hinaus können Protein-Aktivität beider Endoglucanasen und eine Reihe von Cellulasen, die durch die Verwendung einer Zuckeranalyse Test, wie der p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Test 12 überwacht werden. Diese Techniken können verwendet werden, um aufzuklären und Quantifizierung der Aktivität des exprimierten Cellulase von Interesse sein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Wachstum von Wildtyp N. tabacum Pflanzen

  1. Um N. wachsen tabacum L. cv. Petit Havana SR1 Pflanzen auf Erde, legen Tabaksamen über geeignete Töpfe mit normaler Blumenerde für die Keimung gefüllt. Nach 2 Wochen übertragen Sämlinge auf einzelne Töpfe. Inkubieren Pflanzen in einem Gewächshaus mit konstanten 22 ° C (dunkle Zeit) bzw. 25 ° C (Lichtperiode) und die relative Luftfeuchte 70%. Geben Beleuchtung in einem 16/8 h Licht / Dunkel-Zyklus (zB Philips IP65 400 W-Lampen, 180 mmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) und Wasser täglich.

2. Transiente Expression von TrCel5A und TrCel5A-Proteine ​​mCherry

  1. Unter sterilen Bedingungen, nehmen einzelne Kolonien von Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, KmR, RifR), die entweder pTRAkc-ER-TrCel5A oder pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry und Transfer zu einem Erlenmeyerkolben mit 10 ml HefeextraktBrühe (YEB, nach Herstellerangaben hergestellt) Medium und Kanamycin (50 mg / ml), Rifampicin (50 mg / ml) und Carbenicillin (100 mg / ml) für die Selektion. Inkubation für 36-40 Stunden bei 26 ° C und 180 UpM. Hinweis: Die Gestaltung geeigneter Konstrukte für die Proteinexpression ist außerhalb des Geltungsbereichs dieses Papier, sondern zur Orientierung, können die Verfahren der Maclean et al 13 und Munro und Pellham 14 für Konstrukt Design folgen..
  2. Nehmen Sie 200 &mgr; l jeder Kultur zu 20 ml YEB mit den oben genannten Konzentrationen an Antibiotikum zu inokulieren und Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor.
  3. Nach 36-40 h preinduce die Kulturen durch Zugabe von 2 &mgr; l Acetosyringon (200 &mgr; M Endkonzentration), 100 &mgr; l 40% (w / v) Glucoselösung und 200 &mgr; l 1 M MES-Puffer pH 5,6. Inkubieren über Nacht.
  4. Es werden 100 ml einer Infiltration 2x Puffer (100 g / l Saccharose, 3,6 g / l Glucose, 8,6 g / l Murashige und Skoog-Basalsalze, PH-Wert auf 5,6 mit Kaliumhydroxid).
  5. Messen OD 600 der Kulturen mit 1.05 Verdünnungen bis eine OD 600 von 5-6 erreicht. Berechnen Kulturvolumen von 30 ml Infiltrationsmedium benötigt bei OD 600. 15 ml 2x Infiltration Puffer, dann fügen deionisiertem H 2 O, um den Puffer auf 30 ml zu machen.
  6. Nehmen Sie Pflanzen aus Gewächshaus und eine Pipettenspitze verwenden, um den nick abaxial Seite der 3. bis 5. Blatt von oben, um die Infiltration zu erleichtern.
  7. Verwenden Sie eine Pipettenspitze nick die unterseits der Blätter, um die Infiltration zu erleichtern.
  8. Füllen Sie eine Spritze mit Infiltrationsmedium und legen Sie sie (ohne Nadel) auf einem der bisherigen Nicks. Unterstützen Spritze mit einem Finger auf dem adaxial Blatt Seite. Drücken Sie das Medium vorsichtig in das Gewebe zwischen den Blattblattzonen. Anmerkung: Nach der Infiltration pflegen Pflanzen im Gewächshaus unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Auch pflegen einen gleichen Anteil von untreated, nicht-transiente Expressionspflanzen (NTEPs) als Kontrollen, unter den gleichen Bedingungen wie infiltrierten Pflanzen.

3. Beurteilung der TrCel5A-mCherry Expression in Pflanzenblätter

  1. Nach 4-6 Tagen nehmen Pflanzen mit A. infiltriert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry aus dem Gewächshaus und legen Sie sie in einem dunklen Raum für die Fluoreszenzanalyse.
  2. Um die Fluoreszenz in Blattstücke ausdrücken TrCel5A-mCherry, Lichtanlagen mit einem tragbaren Lichtquelle, die grünes Licht bei 515 nm mit einem roten Filter (620-750 nm) zu visualisieren. Hinweis: In Tiefe Charakterisierung von Protein-Expression in den Pflanzenblättern durch Dünnschnitt Blätter mit einem Vibratom und Prüfung unter Licht-und Fluoreszenzmikroskopie erreicht werden. Dazu gehen Sie folgendermaßen vor:
    1. Schneiden kleine Abschnitte von ca. 5 x 5 mm Größe aus einer infiltrierten Blatt und betten sie in 4% Agarose in 50 mM Phosphatpuffer gelöst (pH 5,7).
    2. CutAbschnitt von 80-90 um der Größe von Embedded-Blätter mit einem Vibratom. Legen sie auf einen Objektträger, Deckel mit Puffer oder ein Deckglas und untersuchen sie mit einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzdetektor unter Verwendung der gleichen Wellenlänge und Filter oben angegeben.

4. TrCel5A Extraktion aus Tabakblättern

  1. Schneiden Sie Stücke aus Tabakblättern zu einem ungefähren Gewicht von 1 g aus Pflanzen mit A. infiziert tumefaciens enthält pTRAkc-ER-TrCel5A und in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Hinzufügen einer geeigneten Menge von flüssigem Stickstoff auf den Proben. Grind Blätter zu Pulver mit Hilfe eines vorgekühlten Stößel.
  2. 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid auf den Boden Blatt Materie und mischen, bis die Mehrheit der Blatt Materie in Suspension. Zentrifuge Extrakt bei 15.000 × g für 20 min bei 4 ° C an, um Protein-haltige Überstand.
  3. Centrifuge der Extrakt bei 15.000 g für 20 min bei 4 ° C und nehmen proteinhaltigen Überstand man aufpassen, nicht, um das Pellet zu stören. Entsorgen Sie die Pellets.
  4. Teilweise zu reinigen TrCel5A durch Inkubation der proteinhaltigen Überstands bei 55 ° C für 10 min. Bei Raumtemperatur für weitere 10 min ruhen, dann Zentrifugieren bei 15.000 xg für 10 min bei RT. Wiederholen Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden.
  5. Wiederholen Sie die Teilreinigungsverfahren für nicht-infiltrierten Pflanzen zu Kontrollproben zu erhalten. Mit diesen Proben für alle folgenden Versuche. Achtung: Die Proteinlösungen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden.

5. SDS-PAGE, Western Blot und Azo-Zymographie von CMC TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Kauf oder bereiten 12% (w / v) SDS-PAGE-Gelen nach etablierten Methoden 15.
  2. CMC in Wasser auflösen, um eine 1,5% (w / v) Lösung zu erhalten. CMC-SDS-PAGE-Gelen zu machen, ersetzen 1 ml 1,5% CMC zu 1 ml Wasser in einem 10 ml SDS-PAGE-Gel-Mix-Lösung, was zu einer 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE-Gel-Mix. Gießen Gel normal. Hinweis: Sicherstellen, dass die CMC in der ursprünglichen Lösung ist vollständig durch eine Kombination von Rühren und Erwärmen auf 40 ° C gelöst (Wiederholung direkt vor der Herstellung der Gel-Lösung).
  3. Denaturieren Proben durch Kochen in Gegenwart von SDS, nach etablierten Methoden 12. Als positive Kontrolle, verwenden Sie eine 1:500-Verdünnung eines kommerziell erhältlichen Cellulase Mischung aus T. reesei, wie T. reesei ATCC 26921. Als Negativkontrolle mit einem ähnlich hergestellten Proteinlösung aus nicht-infiltrierten Blätter (NTEPs).
  4. Führen Sie die Elektrophorese wie für normale Protokolle 15,zB verwenden, 200 V für ~ 50 min mit der Elektrophorese gestoppt, sobald der Farbstofffront das Ende des Gels erreicht.
  5. Fleck eine SDS-PAGE-Gel unter Verwendung von 0,1% (w / v) Coomassie-Brilliantblau und Entfärbung unter Verwendung eines Methanol / Eisessig-Gemisch. Hinweis: Schnellfärbung und Entfärbung kann durch leichtes Erwärmen der Färbung und Entfärbung Lösungen, dh durch Verwendung einer Mikrowelle für ~ 15 Sek. erwärmen (aber nicht kochen) zunächst die Färbung und dann die Entfärbung Lösungen, die Änderung der Entfärbelösung nach 10 Minuten durchgeführt werden oder wenn sie abgekühlt, und wiederholen Sie mit neuen Entfärbelösung.
  6. Führen eines Western-Blotting SDS-PAGE-Gel unter Verwendung etablierter Protokolle 16,17. Mit den folgenden Antikörpern: ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen ein His-tag (primären) und einem polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper-Fc-Region, die zu einer alkalischen Phosphatase (sekundäre) konjugiert wurde. Hinweis: Sekundärantikörper sollten ausgewählt werden, um Visualisierung mit Nitro Tetrazol ermöglichenium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-p-indolyphosphate Toluidinsalz (NBT / BCIP), wie beschrieben 18.
  7. Führen in-Gel-Protein-Rückfaltungs auf 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel, das durch Inkubation des Gels in 1,5% (w / v) β-Cyclodextrin, 20 mM Phosphat-Citrat-Puffer, pH 6,5, bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln 15 min 19.
  8. Entsorgen Sie die β-Cyclodextrin-Lösung und kurz waschen das Gel mit H 2 O. Inkubieren bei Raumtemperatur in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 15 min. Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,8 für 20 min bei 50 ° C.
  9. Führen CMC-Zymographie unter Verwendung des rückgefalteten 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-Gel durch Inkubation des Gels in 30 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,8) für 20 min bei 50 ° C.
  10. Färben Sie das Gel für 10 min mit einer 0,1% w / v Kongo rote Lösung entfärben und für 30 Minuten oder bis klar Bänder werden mit 1 M Na beobachtetCl. Mit 0,3% (v / v) Essigsäure für klarere Abbildungs ​​Waschen des Gels.

6. 4-MUC Aktivitätstest von TrCel5A

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) Methanol, und speichern sie in der Dunkelheit bei RT
  2. Unmittelbar vor dem Test, bereiten ein 4-MUC 2x Arbeitslösung von 1 mM 4-MUC zusammengesetzt und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8.
  3. Diese Prüfung auf Proben mit 100 ul Protein-Blatt (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert), 100 &mgr; l einer im Handel erhältlichen Mischung aus Cellulase T. reesei 1:1.000 und reinem H 2 O auf. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
  4. Je 100 ul der 4-MUC-Arbeitslösung in einzelne Wells einer 96-Well-Platte, dann fügen Sie 100 ul jeder Probe.
  5. Bestimmen Zeitpunkt 0 min von 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf.
  6. Inkubation erfolgt während 20min bei 50 ° C, mit Klebstoff Deckel abgedeckt, um Verdampfung zu verhindern. Stoppen der Reaktion durch Einfrieren (oder durch Kombinieren von 100 &mgr; l 0,15 M Glycin, pH 10,0, und 100 ul der Probe in einer separaten Platte).
  7. Bestimmen den Endpunkt der 4-MU-Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm auf. Subtrahieren von 0 min Endpunkt (20 min) Zeitpunkt, um die Änderung in der Fluoreszenzwerte zu erhalten.

7. Azo-Carboxymethyl Cellulose Aktivitätstest von TrCel5A

  1. Bereiten Sie einen Bestand von 1,5% (w / v) Azo-CMC, die bei Raumtemperatur gelagert wird, und eine Fällungslösung mit 18 mM Zink-Acetat, 0,5 M Natriumacetat, pH 5 und 80% Ethanol (v / v), bei Zimmer Temperatur.
  2. Unmittelbar vor dem Assay Vorbereiten eines Azo-CMC 2x Arbeitslösung, bestehend aus 1% (w / v) Azo-CMC (in H 2 O) und 60 mM Natriumacetat, pH 4,8.
  3. Kombinieren 50 ul Probe und 50 ul des Arbeitsten Lösung in 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Testproben, die 50 ul Blatt Protein (mit oder ohne TrCel5A transient exprimiert); 100 &mgr; l eines handelsüblichen Cellulase-Mischung aus T. reesei verdünnt 1:1000; und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung.
  5. Proben für 20 min Inkubation bei 50 ° C. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 ul Fällungslösung. Vortex jede Probe kräftig für 10 Sekunden, um sicherzustellen, Lösungen wurden vollständig zusammen.
  6. Proben Inkubation bei RT für 10 min und dann wieder Wirbel. Zentrifuge Proben bei 1000 g für 10 min. Entfernen 200 ul jeder Probe Überstand auf eine 96-Well-Platte, kümmert sich nicht um das Pellet zu stören.
  7. Assay unter Verwendung von Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 590 nm aufweist.

8. PAHBAH Test der TrCel5A

  1. Verwenden Sie einen Locher, um einen Kreis (~ Durchmesser 5,5 mm) aus Filterpapier geschnitten. 100 l 60 mM NaAc, pH 4,8 und 100 ul-Proben, enthaltend entweder Blatt-Protein (mit oder ohne TrCel5A induzierbar exprimiert) oder eine kommerzielle T. reesei Cellulase Mischung 1:1000 verdünnt, und Inkubation mit Filterpapier Kreise für 20 Stunden bei 50 ° C mit 300 rpm schütteln. Für jede Probe mit Filterpapier inkubiert, auch inkubieren eine doppelte Lösung ohne Filterpapier als individuelle Probe-Kontrollen.
  2. Vorbereitung einer 330 mM p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Lösung A durch Auflösen PAHBAH in H 2 O unter Zugabe von 5 ml konzentrierter HCl für insgesamt 100 ml Lösung, und Lagern bei RT. Hinweis: Die besten Ergebnisse werden durch Zugabe von HCl auf einen kleineren Volumen PAHBAH Aufschlämmung, dh 30 ml, der unter Temperatur gerührt wird, um die Auflösung, bevor das Volumen auf 100 ml mit H 2 O gelöst helfen
  3. Bereiten PAHBAH Lösung B, die 50 mM Natriumcitrat, 10 mM Calciumchlorid und 500 mM NaOH und lagern bei RT.
  4. Immediately vor dem Test, bereiten eine 1,5 x Arbeitslösung von 1 ml PAHBAH Reagenz zu 9 ml Pufferlösung auf Eis aufbewahren bis zur Verwendung (innerhalb von 4 Stunden verwendet werden).
  5. Bereiten Proben in thermo 0,2 oder 0,5-ml-Röhrchen. Kombinieren 5 ul jeder Lösung mit Filterpapier (Schritt 8.1), 45 ul H &sub2; O und 100 ul PAHBAH Arbeitslösung inkubiert. Probenkontrollen (Proben ohne Filterpapier inkubiert) sollte unter den gleichen Konzentrationen (5 ul Probe, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH Arbeitslösung) ausgeführt werden. Auch testen 5 Standards (5 ul), die zwischen 0 und 0,2 g / l Glucose und reinem H 2 O. Führen Proben und Standards in dreifacher Ausfertigung.
  6. Proben inkubieren genau 10 min bei 100 ° C, dann bei RT abkühlen genau 10 min. Pipette Lösungen in eine 96-Well-Platte und Assay-spektroskopisch bei einer Wellenlänge von 410 nm aufweist. Subtrahieren Sie einzelne Probe-Kontrollen (ohne Filterpapier inkubiert) aus Proben endgültig zu erhaltenWerte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A und TrCel5A-mCherry wurden erfolgreich in Tabakpflanzen unter Verwendung des transienten Expressionssystem (1A und 1B) ausgedrückt. Die Untersuchung der Expressionsmuster des TrCel5A mCherry-Fusionsprotein zeigte gesunde Blätter (1C), die weit verbreiteten Proteinexpression unter grünen Licht (1D) zeigte.

Extraktion der gesamten löslichen Proteine ​​wurden auf Tabakpflanzen, die Blätter, die enthalten waren durch die transient exprimiert TrCel5A Protein und SDS-PAGE zeigte eine große Vielfalt von Proteinen vorhanden waren (2A, Bahn 1). Die gesamten löslichen Proteinprobe aus TrCel5A exprimierenden Pflanzen und gesamten löslichen Proteinprobe aus NTEPs abgeleitet wurden für 10 min bei 55 ° C inkubiert, TrCel5A bleibt stabil und aktiv bei 55 ° C, während viele andere (native Tabak) Proteine ​​nicht bei dieser Temperatur stabil. So sind viele nicht-essential-Proteine ​​wurden durch diese Behandlung ausgefällt, so dass eine teilweise gereinigte Probe von TrCel5A. Nach dieser thermisch-Fällungsschritt wurde eine starke Proteinbande bei ~ 40 kD (Fig. 2A, Spur 1) beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf die katalytische Domäne (CD) des TrCel5A, die zuvor gezeigt worden ist, um in dieser Größe ausgeführt, wenn in Pflanzen 4 ausgedrückt werden. Die negative und positive Kontrollproben (Fig. 2A, Spuren 3 und 4 wurden) zeigten geringe Konzentrationen an restlichen thermotoleranten Proteine ​​aus Tabak NTEPs (Negativkontrolle, Fig. 2A, Spur 3) und mehreren Bändern, die eine Mischung von T. reesei Proteine ​​(positive Kontrolle, 2A, Bahn 4).

Die Größe des TrCel5A wurde durch Antikörperfärbung auf der His-6tag TrCel5A in den C-Terminus, was gesehen wurde abwesend beiden Kontrollen (Fig. 2B) werden einge gerichtet bestätigt. Die TrCel5A wurde nachgewiesenbehalten Endoglucanase-Aktivität durch CMC-Zymographie (2C, Bahnen 1 und 2), wobei die rückgefaltete Protein erzeugt eine starke gelöscht Bereich anzeigt CMC Degradation auf der gleichen Höhe wie in der Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gel und Western-Blot. Keine Aktivität wurde für die nicht-Cellulase-Protein Mischungen aus NTEPs (2C, Spur 3) beobachtet, und die Mischung von T. reesei Proteine ​​als positive Kontrolle laufen zeigte Endoglucanaseaktivität aus mehreren Komponenten (2C, Spur 4).

Um die Aktivität der cellulolytischer TrCel5A drei Assays verwendet wurden, zu quantifizieren. Zunächst wurde der Abbau von 4-MUC durch Beobachtung der erhöhten Fluoreszenzemission bei 465 nm (angeregt bei 360 nm) des freigesetzten 4-MU analysiert. TrCel5A wurde gezeigt 4MUC verschlechtern, wie auch eine 1:1000 Verdünnung einer kommerziell erhältlichen Mischung von T. reesei-Cellulasen (Abbildung 3A).

Eine quantifizierbare Analyseder Aktivität der TrCel5A gegen CMC wurde durch Messung der Freisetzung eines Azo-Farbstoffes bei 590 nm von Azo-CMC geführt. TrCel5A Aktivität unter diesen Bedingungen entsprach in Aktivität zu einer 1:1000 Verdünnung des oben (Fig. 3B) genannten Cellulase-Mischung.

Die Fähigkeit zu TrCel5A Filterpapier abbauen wurde ebenfalls analysiert. Für diesen Test wurde eine anfängliche Verzuckerung Assay durchgeführt (dh die Lösung TrCel5A Verschlechterung der Filterpapier) und dann wurde der Überstand von der PAHBAH-Tests analysiert, um die Menge der reduzierenden Zucker freigesetzt (Fig. 3B) zu ermitteln.

Figur 1
Abbildung 1. Pflanzenexpressionskassetten für TrCel5A Konstrukte und heterologen Expression von TrCel5A-mCherry in denTabakblätter durch Fluoreszenz unter grünem Licht visualisiert. Schematische Darstellungen der Pflanzen-Expressionskassette für TrCel5A (A) und TrCel5A-mCherry (B) gezeigt. Nach transienter TrCel5A mC-Expression wurden die Tabakblätter unter normalen (C) oder grünes Licht (D) untersucht. Für Panels (A) und (B) der CaMV-Promotor (P35SS) und Terminator-Signal (pA35S) in hellblau angezeigt. 5'-UTR von Chalkonsynthase (CHS), und dem His6-kodierende Sequenz (His6) sind in blau angegeben. Die Anlage codonoptimierten Leader-Peptid (LPH) von der schweren Kette des murinen mAb24 abgeleitet ist in grün dargestellt. LPH erreicht die Sekretion des rekombinanten Proteins an den Apoplasten, nach dem ein C-terminalen KDEL-Signal, in rot angezeigt ist, verzögert das Protein zu dem ER. Die Pfeile kennzeichnen die Bindungsstelle für Grundierung auf den CaMV 35SS Expressionskassette zu verstärken. Für Panels (C) und (D) das grüne Licht hatte eine Anregung 515 nm.Die Bilder wurden ohne Vergrößerung.

Figur 2
. Abbildung 2 Größe und Aktivität der TrCel5A durch SDS-PAGE, Western Blotting, und CMC-Zymographie gezeigt Trennung der gesamten löslichen Proteinen:. Aus Tabakpflanzen, wo TrCel5A wurde vorübergehend vor (1) ausgedrückt und nach (2) Wärmefällungsreinigung; aus Tabakpflanzen, wo TrCel5A nicht anwesend war, auch nach der thermischen Fällung (3); oder eines im Handel erhältlichen Gemisches von T. reesei-Cellulasen (4). SDS-PAGE getrennten Proteine ​​werden mit Coomassie-Blaufärbung (A), Western-Blotting gegen den His-Tag-Region von TrCel5A (B) und der durch Zymographie mit CMC gezeigt Cellulaseaktivität visualisiert visualisiert mit Kongo-Rot (C). PageRuler Plus-(Fermentas) wurde als Molekulargewichtsmarker (M) verwendet.

Fig. 3
3. Enzymaktivität Quantifizierung TrCel5A. TrCel5A wurde mit 4-MUC (A), Azo-CMC (B), und das Filterpapier (C) und der Substratabbau durch Freisetzung des Fluorophors 4-MU (A) gemessen inkubiert, ein Azo-Farbstoff (B) oder durch Quantifizierung reduzierenden Zuckern durch Überwachen der Farbänderung des PAHBAH (C). Jeder Test zeigt die Ergebnisse für drei Wiederholungen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. In allen drei Tests waren die untersuchten Proben Puffer allein, TrCel5A nach thermischer Fällungsreinigung, NTEP (WT Nt) nach der thermischen Fällungsreinigung und einer im Handel erhältlichen Mischung von T. reesei Cellulasen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinante Expression von Cellulasen ist ein Feld von großem Interesse, auf den Wunsch nach effizienteren Produktion von Biokraftstoffen Systeme ein. Pflanzen bieten viele Möglichkeiten für eine erfolgreiche Cellulaseproduktion, mit Funktionen wie wirtschaftliche Erntetechniken und Methoden Autohydrolyse sehr wünschenswerte Eigenschaften für eine groß angelegte Produktion von Biokraftstoffen. Ferner ist die Verwendung von verschiedenen Lokalisierungen zur Herstellung von Proteinen erlauben, falls erforderlich, posttranslationale Modifikationen 20. Ändern Pflanzen konstitutive Expression von Cellulasen zu ermöglichen, und bietet offensichtliche Vorteile, ist eine zeitaufwendige Methode, die möglicherweise nicht erfolgreich sein kann. Techniken wie die Sequestrierung der exprimierten Proteine ​​und induzierbare Expression Mechanismen erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Cellulaseproduktion in Pflanzen, aber diese immer noch nehmen viele Monate zu etablieren. Hier werden transiente Expression Methoden nachgewiesen, um das Potenzial für eine bestimmte Cellulase zu veranschaulichendurch Anlagensysteme innerhalb von wenigen Tagen hergestellt werden.

Eine Fusion mit dem fluoreszierenden Protein mCherry wurde hier verwendet, um den Erfolg der transienten Proteinexpression Methoden zu demonstrieren. TrCel5A-mCherry wurde deutlich von der Mehrzahl der Blätter, die mit dem Vektor-enthaltenden Agrobakterien infiltriert worden war, verteilt. Lokalisierung an das endoplasmatische Retikulum ermöglicht posttranslationale Modifikationen des exprimierten Proteins. Die Fähigkeit eines Expressionssystems zu ermöglichen, z. B. Glykosylierung ist besonders wichtig für solche Cellulasen, die ursprünglich von Pilzorganismen abgeleitet sind, wie T. reesei 21. Hefe-Expressionssysteme, die zunehmend populär für die heterologe Expression Cellulase sind, häufig zu hyper-Glykosylierung der Enzyme, die diskutiert wird, um eine potentielle Behinderung Voll Cellulaseaktivität 22 sein. Pflanzen Glykosylierung Mechanismen einwieder ohne den Nachteil von hyper-Glykosylierung. Zusätzlich ermöglicht die Expression in Pflanzensystemen zur Lokalisierung auf Bereiche, welche erlauben oder nicht posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, so dass eine Anpassung an die Quelle des Proteins. Das hier gezeigte System kann auch verwendet werden, durch die Anwendung von unterschiedlichen Signalfolgen 14, für die Lokalisierung zu den Apoplasten, Chloroplasten, Cytosol oder Golgi-Vesikeln. Die Verwendung von Fluoreszenz-Protein-Fusionen, wie TrCel5A-mCherry, kann den Erfolg der Proteinexpression sowie die Lokalisierung des Proteins zu zeigen. Jedoch sind solche Konjugate nicht für weitere Aktivitätstests erforderlich. So empfiehlt es sich, ein nicht-mCherry TrCel5A Konstrukt für alle weiteren Versuche verwendet werden, wie es hier gezeigt ist, um genauere Daten Aktivität des exprimierten Cellulase erhalten. In Bezug auf Kontrollen für weitere Experimente werden Proben aus nicht-transient infiltrierten Pflanzen allgemein angesehen, um angemessene Kontrollen sein.

5. Zymographie Analyse der Aktivität gegen CMC angegeben, dass die verbleibende Peptid war als einer Endoglucanase. Während SDS-PAGE und Western-Blotting-Assays sind sehr weit verbreitet ist CMC Zymographie eine viel spezifischer Test für Cellulase (insbesondere Endoglucanase-) Aktivität. Einige wichtige Faktoren zu beachten für eine erfolgreiche Zymographie Ergebnisse zu halten sind), dass das Substrat (in diesem Fall CMC) muss vollständig gelösten sein und gleichmäßig verteilt im gesamten Gel; b) dass das Protein erfolgreich rückgefaltet werden, vorzugsweise in einem kurzen Zeitraum, um die Menge an Protein Diffusion durch das Gel zu begrenzen braucht; und c) daßAktivitätstest sollte bei der optimalen Temperatur für das zu bestimmende Enzym (für TrCel5A zwischen 50 und 60 ° C) sein und kurze schärfere Banden Abbau zu ermöglichen.

Quantitative Analyse der Aktivität des exprimierten Cellulase TrCel5A gezeigt, dass das Enzym aktiv gegen eine Vielzahl von Substraten, einschließlich 4-MUC, CMC und Filterpapier. Jedes der Substrate wurde unter Verwendung eines anderen spektroskopischen Test entweder über einen Fluorophor (4-MU) oder durch Lichtstreuungsanalyse einer Farbreaktion (Azo-Farbstoff oder PAHBAH) untersucht. Alle drei Substrate und Assays werden häufig für die Beurteilung der Cellulase-Aktivität verwendet, und sind relativ einfach Assays. 4-MUC wird als Basissubstrat Glycosyl-Hydrolase-Aktivität zu bestimmen, wie eine Vielzahl von diesen Enzymen (Endoglucanasen, Exoglucanasen und β-Glucosidasen) gegen sie aktiv sind. Die Geschwindigkeit des Tests begrenzt Reihe von Anforderungen, hohe Empfindlichkeitund die Fähigkeit vieler Cellulasen, um das Substrat zu spalten, ist dies ein nützliches Screening-Assay zur allgemeinen für Cellulasen, oder zum Prüfen des Erfolgs eines Expressionslauf. Ein Punkt bei der Verwendung von 4-MUC im Auge zu behalten ist, dass dieses Substrat ist besonders geeignet, um die Aktivität von β-Glucosidasen, dass die Aktivität von Endoglucanasen (wie TrCel5A) oder Exoglucanasen schwach erscheinen im Vergleich zur Enzymmischungen oder β-Glucosidasen die enthalten β-Glucosidasen. Bei der Durchführung einer 4-MUC-Assay mit geringen Proteinkonzentrationen oder sonst geringer Aktivität ist es empfehlenswert, den Zusatz von Glycin (pH 10) als Anschlag-Lösung zu verwenden, da der pH-Änderung erhöht die Fluoreszenz von 4-MU. CMC ist ein spezifisches Substrat für das Enzym hier ausgedrückt wird, wie es nur durch Endoglucanasen abgebaut. Die Azo-CMC-Assay ist komplizierter als für 4-MUC, aufgrund der Notwendigkeit zur Ausfällung von Zink Cellulose (und Methanol). Der große Vorteil dieses Substrats und damit Assay, Ist, dass es spezifisch für Endoglucanase-Aktivität, so dass es sehr nützlich, um die Art der Cellulase produziert. Filterpapier Abbau ist eine weitere gemeinsame Test für Gründung Cellulase-Aktivität. Die Menge an Abbau beobachtet variiert beträchtlich in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Cellulase beurteilt, und es ist ein bevorzugtes Substrat für die Untersuchung der Aktivität der Enzymmischungen. Die PAHBAH Test hier verwendet, um Filterpapier Abbau zu untersuchen, erkennt die Menge an Zucker nach Verzuckerung freigegeben und so ist auch für eine Vielzahl von Modellsubstraten hier nicht nachgewiesen, einschließlich CMC, Lichenan, β-Glucan, α-Cellulose, AVICEL , Xylan und Xyloglukan. Für diesen Test sollte darauf geachtet werden, Standards auf der gleichen Platte (oder im gleichen Durchlauf) umfassen, wie die Proben, die untersucht, wie Variation der Inkubationszeiten können die Unterschiede in den Ergebnissen führen. Es ist daher auch wichtig, den Test zu wiederholen, um die Genauigkeit zu gewährleisten. ZusätzlichEine Proben-Kontrolle sollte immer ausgeführt werden, wo die Probe ohne die Zellulosesubstrat inkubiert, um jegliche reduzierende Zucker natürlich in den Proben, die von der PAHBAH identifiziert werden könnten vorliegenden steuern, und sonst falsch-positiven Ergebnissen.

Abschließend werden Methoden für die transiente Expression und Charakterisierung eines rekombinanten Cellulase deutlich gezeigt. Diese Techniken bieten eine einfache Möglichkeit, ausreichende Mengen an Protein zur weiteren Untersuchung einer oder mehrerer Cellulasen erzeugen, unter Verwendung von Aktivitätstests, wie sie hier gezeigt. Insbesondere sind diese Methoden bieten einen schnellen Weg, um das Potenzial der bezeichneten Cellulasen für die Produktion in der Pflanze zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das BMBF Forschungsinitiative unterstützt "BioEnergie 2021 - Forschung für sterben nutzung von Biomasse" und der Exzellenzcluster "Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse", die durch die Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder gefördert wird, die Wissenschaft zu fördern und Forschung an deutschen Hochschulen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Umweltwissenschaften heterologe Expression endoplasmatischen Retikulum Endoglukanase Zellulose Glycosyl-Hydrolase- Fluoreszenz- Cellulase, Tabakpflanzen
Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter