Summary
Denne filmen artikkelen beskriver en in vitro mikromatrisebasert metode for å bestemme de genet mål og bindingsseter for to-komponent-system respons regulatorer.
Abstract
In vivo metoder som chip-chip er veletablerte teknikker som brukes for å fastsette den globale genet mål for transkripsjonsfaktorer. Men de er av begrenset bruk i å utforske bakterielle to komponent reguleringssystemer med uncharacterized aktiveringsforhold. Slike systemer regulere transkripsjon kun ved aktivering i nærvær av unike signaler. Siden disse signaler er ofte ukjente, kan de in vitro mikromatrisebasert metode som er beskrevet i denne video artikkelen brukes til å bestemme genet mål og bindingsseter for respons regulatorer. Dette DNA-affinitetsrenset-chip-metoden kan anvendes for en hvilken som helst renset regulator i en hvilken som helst organisme med en sekvens genom. Protokollen omfatter å la den rensede merkede protein å binde seg til skåret genom-DNA og så affinitet rensing av proteinbundet DNA, etterfulgt av fluorescerende merking av DNA og hybridisering til en tilpasset flislegging array. Foregående fremgangsmåter kan benyttes for å optimalisere assay for spesific regulatorer er også beskrevet. Toppene som genereres av matrisedataanalyse blir brukt til å forutsi binding site motiv, som deretter eksperimentelt validert. Motivet spådommer kan videre brukes til å bestemme genet mål av ortologe respons regulatorer i nært beslektede arter. Vi demonstrerer anvendelsen av denne metoden ved å bestemme genet mål og bindende site motiver og dermed forutsi funksjon for en sigma54 avhengig respons regulator DVU3023 i miljø bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.
Introduction
Bakterienes evne til å overleve og trives er kritisk avhengig av hvor godt de er i stand til å oppfatte og svare på forstyrrelser i sine miljøer, og dette i sin tur er avhengig av sine signaltransduksjonsveiene systemer. Antallet signalanlegg en bakterie koder har blitt kalt sin "mikrobiell IQ", og kan være en indikasjon på både variasjon av sitt miljø og sin evne til å oppfatte flere signaler og finjustere sitt svar en. To komponent signaltransduksjonsveiene systemer (TCS) er de mest utbredte signalsystemer som brukes av bakterier, og de består av en histidin kinase (HK) som registrerer eksternt signal og sender via fosforylering til en effektor respons regulator (RR) 2. RR kan ha en rekke utgangs domener og dermed ulike effektor moduser, men det vanligste svaret er transkripsjonsregulering via en DNA bindende domene en. Signalene som registreres og de tilsvarende funksjoner av de vast fleste overlevende er fortsatt ukjent.
Selv om in vivo-metoder som for eksempel chip-chip blir rutinemessig brukt for bestemmelse av genomisk bindingsseter for transkripsjonsfaktorene 3, kan de bare anvendes for bakterielle tokomponent-system hvis RR aktiveringsbetingelser eller signaler er kjent. Ofte de miljømessige signaler som aktiverer en TCS er vanskeligere å fastslå enn sine genet mål. Den in vitro mikromatrisebasert assay som er beskrevet her kan brukes for effektivt og raskt bestemme de genet mål og forutsi funksjoner av overlevende. Denne analysen tar fordel av det faktum at RR kan bli fosforylert og dermed aktiveres in vitro ved hjelp av små molekyl givere som acetyl fosfat 4..
I denne fremgangsmåten, kalt DAP-chip for DNA-affinitetsrenset-chip (figur 1), blir RR genet av interesse klonet med en His-tag i E. coli, og en etterfølgende renset merket protein tillates å bind å skåret genomisk DNA. Den proteinbundet DNA blir deretter anriket ved affinitets-rensing, blir den anrikede og inngangs DNA amplifisert, fluorescensmerkede, samles sammen og hybridisert til en flislegging array som er spesiallaget for organismen av interesse (fig. 1). Microarray eksperimenter er gjenstand for artefakter og derfor ytterligere trinn benyttes for å optimalisere assay. Et slikt trinn er å forsøke å finne en target for RR som studeres ved hjelp av elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA) (se arbeidsflyt i figur 2). Deretter, etter binding til genomisk DNA, og de DAP trinn, blir proteinbundet og inngangs DNA undersøkt av qPCR for å se om den positive målet er anriket på protein-bundet fraksjon i forhold til inngangs fraksjon, noe som bekrefter optimale bindingsbetingelser for RR (figur 2). Etter at matrisen hybridisering, blir dataene analyseres for å finne toppene av høyere intensitet signal som indikerer genomiske loci hvor proteinet hAnnonsen bundet. Funksjonene kan forutsies for en RR basert på genet mål oppnådd. De mål-genomiske loci blir brukt til å forutsi binding site motiv, som deretter eksperimentelt validert ved hjelp EMSAs (figur 2). De funksjonelle prediksjoner og genet mål for strømlikeretteren kan deretter bli utvidet til nært beslektede arter som koder ortologe RR ved å skanne de genomer for tilsvarende bindingsmotiver (figur 2). DAP-chip metoden kan gi et vell av informasjon for en TCS der det tidligere var det ingen. Fremgangsmåten kan også brukes for en hvilken som helst transcriptional regulator hvis proteinet kan renses, og DNA-bindingsforhold kan bestemmes, og for en hvilken som helst organisme av interesse med et genom-sekvens er tilgjengelig.
Figur 1. DNA-affinitetsrenset-chip (DAP-chip) strategi 7. RR-genet fra organismen av interesse er klonet med carboxy-terminalt His-tag i en E. coli uttrykk belastning. Renset His-merket protein som blir aktivert ved fosforylering med acetyl-fosfat, og blandet med skåret genom-DNA. En aliquot av bindingsreaksjon blir lagret som input DNA, mens resten er utsatt for affinitetsrensing ved hjelp av Ni-NTA harpiks. Den inn-og RR-bundet DNA er hele genomet amplifisert og merket med Cy3 Cy5 og hhv. Det merkede DNA blir samlet sammen og hybridisert til en flislegging matrise, som så blir analysert for å bestemme de genet mål. Figur modifisert og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra 7.
Figur 2. Oppsummering av arbeidsflyt. For noen renset tagget Proteinkonn, begynne med å bestemme et mål ved hjelp av EMSA. Tillat protein å binde genomisk DNA og deretter DNA-affinitet-renser (DAP) og hele genomet forsterke (WGA) beriket og innspill DNA. Dersom et gen mål er kjent, bruker qPCR for å sikre at den kjente målet er anriket med protein-bundne fraksjon. Hvis ingen mål kunne fastslås, gå direkte til DNA merking og rekke hybridisering. Hvis berikelse av qPCR ikke kunne observeres, deretter gjenta protein-gDNA bindende og DAP-WGA trinn ved hjelp av ulike protein mengder. Bruk rekke analyse for å finne topper og kart dem til å målrette gener. Bruk oppstrøms regioner i målgener å forutsi bindingssetet motiver. Validere motivene eksperimentelt ved hjelp av EMSAs. Bruk motiv for å skanne genomene til beslektede arter som koder orthologs av RR under studien, og spår gener målrettet i disse artene også. Basert på genet mål som oppnås, kan den fysiologiske funksjon av RR og dets orthologs forutsies. Figur modifisert og gjengitt ved hjelp av kreative commons lisens fra 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Protokollen nedenfor er skreddersydd for bestemmelse av genet mål av RR DVU3023 fra bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Den kan tilpasses til en hvilken som helst annen transcriptional regulator av interesse.
En. Clone og rense RR
- Klone RR genet, spesielt DVU3023, fra D. vulgaris Hildenborough inn i en Escherichia coli-ekspresjonsvektor slik at genet er C-terminalt His-tagget og ekspresjon er under kontroll av en T7-promoter.
Merk: Flere kloningsmetoder kan brukes, og bestemmes av forskeren. Alternative affinitet tagger kan også brukes. - Transform uttrykket konstruere inn E. coli BL21 (DE3) uttrykk belastning.
- Vokse opp en L av BL21 uttrykk belastning ved 37 ° C. Ved midt-log fase, tilsett IPTG til 0,5 mM for å indusere proteinekspresjon. Fortsett vekst ved romtemperatur i 24 timer.
- Sentrifuger cellene ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C. Resuspender celler i lysis buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol, 1 mg / ml lysozym, 1x benzonase nuklease). Lyse-celler ved hjelp av en fransk presse ved 4 ° C.
- Sentrifuger ved 15.000 xg lysat i 30 min ved 4 ° C. Filtrer ved hjelp av en 0,45 mikrometer sprøyte filter.
- Vask en 1 ml Ni Sepharose-kolonnen på et FPLC-instrument ved anvendelse av 10 ml vaskebuffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol).
- Laste lysatet på kolonnen. Vask kolonnen med 20 ml vaskebuffer.
- Elute DVU3023 anvendelse av en gradient på 0-100% elueringsbuffer (20 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol).
- Laste eluerte fraksjoner på en avsalting kolonne og vask med avsalting buffer (20 mM natriumfosfat pH 7,4, 100 mM NaCl).
- Sentrifuger proteinprøve i en høy molekylvekt cutoff sentrifuge-filter for å konsentrere proteinet. Legg DTT til 0,1 mM og glycerol til 50% og store protein ved -20 ° C.
Merk: rensemetoder må optimaliseres individuelt for hvert protein under studien.
To. Bestem Gene Target for RR Bruke Elektro Mobility Shift analysen (EMSA)
- PCR forsterke 400 bp region oppstrøms for kandidat målgen DVU3025, ved hjelp av D. vulgaris Hildenborough genomisk DNA som mal, og en forward umerkede primer og en omvendt 5'-biotin-merket primer.
Merk: Tips for å velge en kandidat målgenet: Ofte RR binde oppstrøms regioner i sitt eget gen / operon, eller de kan regulere proximally kodede gener. Hvis RR har orthologs i andre arter, se etter gener som er bevart i nabolaget. Alternative metoder omfatter velger kandidat gener basert på regulon spådommer (f.eks RegPrecise 5), eller forutsi sigma54 avhengige arrangører 6 for RR som er seg selv sigma54 avhengig. - Kjør PCR produktet på en 1% agarosegel, kutte ut 400 bp størrelse produkt, og rense DNA-gel ved hjelp av en ekstraksjon rydde opp kit.
- Bland DVU3023 protein (0.5 pmol) av 100 fmol av biotinylert DNA-substrat i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25% glyserol og 1 ug / ml poly dI.dC (non spesifikke konkurrent DNA) i et totalt volum på 20 pl. Også sette opp en reaksjon uten protein som en kontroll. Inkuber reaksjonene ved romtemperatur på benken til 20 min.
- Merk: Dette er standardbetingelser som er oppført, og andre reaksjonskomponenter kan tilsettes avhengig av RR er av interesse. Ved aktivering er ønskelig til 50 mM acetyl fosfat til reaksjons (ofte RR vil binde DNA in vitro uten aktivering).
- Pre-kjøre en precast mini 6% polyakrylamid-0.5x TBE gel i 0.5x TBE buffer på 100 V i 30 min. Tilsett 5 pl av 5x loading buffer (0,1% bromfenolblått, 0,1% xylen-cyanol, 30% glycerol i 1 x TBE) til bindingsreaksjoner og last 18 pl av reaksjonene for å g-el. Løpe ved 100 V i 2 timer.
NB: For å unngå overoppvarming, noe som kan føre til disassociation av protein-DNA-komplekser, fyller den ytre bufferkammeret i elektroforese-system med rennende buffer slik at mesteparten av gelen er isolert med buffer. Alternativt kan gelen bli kjørt ved 4 ° C. - Skjær en ladet nylonmembran til størrelsen av gelen og suge den i 0,5 x TBE i minst ti minutter. Fjern gelen fra kassetten. Skjær noen rygger av gelen og sandwich gelen og membranen mellom to tykke filterpapirer dynket i 0,5 x TBE, og plasser i en semi-tørrblotting apparater og drives ved 20 V i 30 minutter.
- Plasser membran inne i en kommersiell UV lys crosslinker instrument og angi tiden til 3 min.
Merk: Membranen kan nå lagres tørt ved romtemperatur i flere dager før man går videre til neste trinn. - Bruk en kommersielt tilgjengelig chemiluminescent deteksjon kit som sysselsetter en streptavidin-pepperrot peroxidaSE konjugat å utvikle blot i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bilde-blot ved bruk av en datamaskin koblet til et CCD-kamera utstyrt og ser etter et skifte i DNA-substrat mobilitet i nærvær av RR, noe som indikerer at RR binder DNA som blir testet.
Merk: spesifisiteten av protein-DNA forskyvning kan testes ved å ta med i reaksjonen av et overskudd av umerket konkurrent DNA, som skal eliminere eller redusere forskyvning sett.
Tre. Kontroller Target Enrichment etter Genomisk DNA-proteinbinding
- Genomisk DNA-protein binding reaksjon
- Skjær genomisk DNA med en gjennomsnittlig størrelse på 500 bp ved sonicating 100 ul genomisk DNA (i konsentrasjoner på 100 til 200 ng / mL) i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør ved hjelp av en mikrotip med 9 lave amplitude-pulser av 1 sek, med 2 sek gap imellom hver.
Merk: Hvis DNA spruter til sidene av røret, spinne ned innholdet etter hvert tre pulser. De eksakte betingelser som benyttesvil variere med sonicator instrument som brukes. Skjærpåvirkede DNA-fragmentene kan variere fra 100-1000 bp, men den gjennomsnittlige størrelse bør være innenfor 400 til 600 bp. For mye klipping kan føre til færre intakte bindingssteder, og enten for mye eller for lite klipping vil påvirke bibliotek forberedelse løpet nedstrøms hele genomet forsterkning trinn. - Bland 2-3 ug skåret genom-DNA med RR protein (0,5 pmol av DVU3023) i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 25% glycerol og 50 mM acetyl fosfat. Inkuber reaksjoner ved 25 ° C i 30 min. Overfør 10 ul av denne reaksjon til et 1,5 ml rør og etikett som input DNA.
Merk: Acetyl fosfat tilsettes for å aktivere protein ved in vitro-fosforylering. Fosforylering stimulerer DNA-binding, men mange RR også binde DNA in vitro uten aktivering 7.. Mengden av protein tilsatt til reaksjonen, vil avhenge av aktiviteten av proteinet prep. EMSA kan brukes til å velgeimize dette beløpet.
- Skjær genomisk DNA med en gjennomsnittlig størrelse på 500 bp ved sonicating 100 ul genomisk DNA (i konsentrasjoner på 100 til 200 ng / mL) i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør ved hjelp av en mikrotip med 9 lave amplitude-pulser av 1 sek, med 2 sek gap imellom hver.
- Affinity rense proteinbundet DNA
- Tilsett 30 pl av Ni-NTA agarose-harpiks til et 0,6 ml mikro-sentrifugerør. Sentrifuger ved 100 x g i 1 min for å samle opp harpiksen i bunnen, og fjern supernatanten. Tilsett 100 ul vaskebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 25% glyserol), flick røret for å blande og sentrifuger ved 100 x g i 2 min. Fjern supernatanten.
- Tilsett de gjenværende 90 ul av bindingsreaksjon til den vaskede Ni-NTA-harpiks og inkuberes på en rotasjonsrister i 30 min.
- Sentrifuger ved 100 x g i 2 min, og fjern supernatanten (ubundet DNA). Tilsett 100 ul vaskebuffer, beveger røret for å blande innholdet, og sentrifuger ved 100 x g i 2 min. Fjern supernatanten. Gjenta vasketrinn to ganger til.
- Legg 35 pl elueringsbuffer (20 mM natriumfosfatbuffer pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) til harpiksen, og bland ved virvling. Inkuber i benk ved RT i 5 min. Sentrifuger ved 100 x g i 2 min. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør og etikett som proteinbundet DNA-fraksjon.
- Også legge 35 pl av elueringsbuffer til inngangen DNA.
- Rens det inn-og proteinbundet DNA-fraksjoner ved hjelp av en PCR-rensing kit.
- Hele genom forsterker inngangs-og proteinbundne DNA-prøver.
- Tilsett 10 pl av den inn-og proteinbundet DNA for å separere PCR-rør. Til 1 pl av 10 x Fragmentering buffer, 2 pl av Library Fremstilling buffer og 1 pl av Library Stabilisering oppløsning til hver prøve. Bland godt av virvling. Heat i en thermocycler ved 95 ° C i 2 min, og chill på is.
Bemerk: utgangs-mengde av DNA bør være minst 10 ng for å unngå å introdusere forsterkning bias. - Legg 1 mL av Library Fremstilling Enzyme, blandes ved pipettering, og inkuber i termosykler ved 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C i 20 min, 75 ° C / 5 min, Og hold ved 4 ° C.
- Til hvert rør, tilsett 47,5 ul vann, 7,5 ul av 10 x forsterkning konsentrat-blanding, og 5 pl av polymerase. Bland godt og oppvarmning ved 95 ° C / 3 min, etterfulgt av 20 sykluser av 94 ° C/15 sek, 65 ° C / 5 min. Hold reaksjoner ved 4 ° C.
- Rens de forsterkede DNA-prøver ved hjelp av en PCR rensing kit og måle DNA konsentrasjon spektrofotometrisk.
- Tilsett 10 pl av den inn-og proteinbundet DNA for å separere PCR-rør. Til 1 pl av 10 x Fragmentering buffer, 2 pl av Library Fremstilling buffer og 1 pl av Library Stabilisering oppløsning til hver prøve. Bland godt av virvling. Heat i en thermocycler ved 95 ° C i 2 min, og chill på is.
- Bekreft target berikelse i proteinbundet DNA ved hjelp av qPCR
- Design qPCR primere for å forsterke 200 bp i oppstrømsområdet av EMSA-verifisert målgenet (DVU3025) ved hjelp av en hvilken som helst fritt tilgjengelig primer utforming programvare.
- Sett opp tredoble qPCR reaksjoner for hver DNA mal med hver primer sett. Forbered en master mix for hver primer sett. 1x mester blandingen inneholder 10 mL av 2x SYBR Grønn qPCR mix, 0,5 mikrometer av hver primer og vann til totalt 18 pl. Delmengde 18 pl av konsentrat-blanding per brønn av en 96-brønners PCR-plate.
- Fortynnete den forsterkede og renset inngang og proteinbundne DNA-prøver til 5 ng / mL med vann og brukes som DNA-templat. Legg 2 mL av DNA mal til brønnene.
- Tett plate med en ultra klar qPCR tetting film, spinne ned plate i en sentrifuge ved 200 xg / 1 min. Sett platen i en sanntid qPCR maskin. Syklus som følger ved bruk av tilhørende qPCR programvare: 95 ° C / 1 min, og 40 sykluser på 95 ° C/10 sek, 59 ° C/15 sek, og 70 ° C/35 sek.
- Også satt opp tre eksemplarer qPCR reaksjoner med primere til å forsterke oppstrøms regioner av en uavhengig genet (negativ kontroll).
- Beregn A C T T C ved å trekke verdien av proteinbundet DNA fra den i inn-DNA. Beregn fold anrikning av målgen i proteinbundet DNA som 2 A C T.
Merk: Hvis målet oppstrømsområdet var anriket på den proteinbundet DNA vs input DNA, indikerer det at bindingsreaksjoner og affinitetsrensing ble successful. Gå videre til trinn fire. Hvis berikelse av målet oppstrømsregion ikke ble observert, gjentar bindende reaksjoner (trinn 3,1) med forskjellig mengde protein.
4. DNA Merking og Array Hybridisering
- Etikett Input DNA med Cy3 og Beriket DNA med Cy5
ote: Cy3 og Cy5 fargestoffer er lysfølsom og omsorg bør tas for å holde lys eksponering til et minimum.- Bland 1 mikrogram DNA med 40 mL Cy3/Cy5-labeled 9-mers og justere volumet til 80 ml med vann.
- Varme denaturere ved 98 ° C i 10 min i mørket (i et thermocycler). Hurtig kulden på is i 2 min.
- Tilsett 2 pl Klenow-polymerase (3'-5'-ekso -, 50 000 U / ml), 5 mM dNTPs, og 8 mL vann for hver reaksjon, bland godt og inkuber ved 37 ° C i 2 timer i mørket (i en thermocycler).
- Legg EDTA til 50 mM for å stoppe reaksjonen, og NaCl-løsning til 0,5 M.
- Overfør prøvene til 1,5 ml rør fortsaining 0.9 volum av isopropanol, inkuberes i mørket i 10 min, og sentrifuger ved 12 000 xg i 10 min. Pelleten bør være rosa for Cy3-merket DNA og blått for Cy5-merket DNA.
- Vask pelleten med 80% etanol (500 mL) og sentrifuger ved 12 000 x g i 2 min. Air-tørr pellets for 5-10 min i mørket.
Merk: Pellets kan lagres ved -20 ° C. - Resuspender pellet i 25 mL vann. Mål DNA konsentrasjon spektrofotometrisk.
- Pool sammen 6 ug hver av de Cy3 Cy5-og-merket DNA i et 1,5 ml rør og vakuumtørke i sentrifugen ved svak varme i mørket (dekke sentrifugen lokket om den er gjennomsiktig).
Merk: Pellets kan oppbevares ved -20 ° C inntil klar for hybridisering.
- Microarray Hybridisering
- Drei hybridisering system på 3-4 timer før bruk og sette temperaturen til 42 ° C.
- Forbered en hybridisering løsning mester mix slik at 1x løsning inneholder 11,8 mL 2x Hybridiseringsbestemmelsessystemetnings-buffer, 4,7 ul Hybridisering-komponenten A, og 0,5 pl oligo innretting.
- Suspender pellets i 5 mL vann. Legg 13 pl av denne blandingen til prøven. Vortex i 15 sekunder, Inkuber ved 95 ° C i et tørr-bad i 5 min. Hold prøvene ved 42 ° C i hybridiserings-systemet til den er klar for lasting.
- Forbered microarray slide-mikser forsamlingen, i henhold til produsentens protokoll.
- Sett blande-glidende inne i hybridiserings-systemet. Belastnings 16 pl av prøven inn i fylleåpningen, forsegle porter med en selvklebende film, slår blanding på i systemet, og hybridisere til 16 til 20 timer ved 42 ° C.
- Forbered 1X vaskebuffere I (250 ml), II (50 ml) og III (50 ml) ved fortynning av 10 x kommersielt tilgjengelige buffere i vann, og til hver legg DTT til 1 mM. Varm Buffer I til 42 ° C.
- Skyv blandebatteri-lysbilde i en demontering verktøy, og plass inne i en skål med varm Buffer I. Peel for armaturet, mens kraftig shaking demonteringsverktøyet for hånd.
- Plasser lysbildet i en beholder med 50 ml vaskebuffer I og ristes kraftig i 2 min for hånd.
- Overføring lysbilde inn i en andre beholder med 50 ml vaskebuffer II og rist kraftig i 1 min for hånd.
- Overføring lysbilde i en tredje beholder med 50 ml vaskebuffer III, og ristes kraftig i 15 sekunder for hånd.
- Raskt klatt kantene på lysbildet på et papirhåndkle, og plasser i en lysbilde rack. Sentrifuger ved 200 xg for 2 min å tørke lysbildet. Plasser innen lysbilde tilfelle, pakk den inn i folie, og oppbevar i en eksikkator.
- Skanning av Array
- Plasser lysbildet i microarray scanner henhold til instrumentets instruksjoner.
- Bruk en skanner programvare for å sette de bølgelengdene som 532 nm = Cy3 og 635 nm = Cy5, og de innledende fotomultiplika gevinster mellom 350 og 400.
- Viser lysbilde å finne matrisen på lysbildet. Velg matrisen regionen for skanning. Skann matrisen og justere fotomultiplika innstillingene slik at matrisefunksjoner er for det meste gul. Histogrammet bør vise de røde og grønne kurver overlagret eller så nær hverandre som mulig. Kurvene bør ende over 10 -5 normaliserte tall ved metning.
- Spar både 532 og 635 nm bilder separat.
- Array Data Analysis
- Importere bildene inn i en rekke analyse programvare. Ved hjelp av programvaren, lage to par-rapporter (. Pair) for hver matrise (for Cy3 og Cy5 bilder). Lag skalert log 2 ratio filer ved hjelp av paret filer. Bruk log 2 ratio filer å søke etter topper ved hjelp av en skyvevindu på 500 bp. Kart topp loci til oppstrøms regioner i genet mål.
- Sjekk om det positive målet (bestemmes ved hjelp av EMSA og bekreftet av qPCR, DVU3025 i dette eksempelet) vises innenfor de beste toppene.
Merk: Hvis den positive målet er ikke blant de beste hits, er det mulig at RR i henhold consideration har flere genet mål og replikere DAP-chips kan gjennomføres, og topper som er felles for alle replikater kan brukes til å generere en target-listen.
5. Bindende nettstedet Motif Tippe og validering
- Hent sekvenser for oppstrøms regioner (400 bp) for de beste genet mål som genereres av DAP-chip analyse. Påfør MEME på disse sekvensene gjennom Mikrober Online (meme.nbcr.net) å forutsi motiver.
Merk: Enhancer bindende proteiner slik som sigma54-avhengige regulatorer kan binde flere hundre basepar oppstrøms for startsetet. For andre transcriptional regulator, en kortere region slik som 200 bp oppstrøms vil være tilstrekkelig. - Design topp og bunn strand DNA oligomerene som inneholder spådd bindingsstedet motiv flankert av 10 baser på hver ende. Bestill toppen strand 5 'bitinylert.
- Bland de øvre og nedre tråd oligoer i 1:1,5 forholdet i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, og 50 mM NaCl iet totalt reaksjonsvolum på 20 pl i PCR-rør. Oppvarm til 95 ° C i 5 min i en termosykler, etterfulgt av langsom avkjøling til 25 ° C. Tynn ut ti ganger og bruke som villtype dsDNA substrat for EMSA.
- Forbered modifiserte underlag ved hjelp av den samme fremgangsmåten som ovenfor, men motiv oligomerene å bære 4-6 erstatninger i de bevarte baser av bindende motiv.
- Sett opp bindende reaksjoner med RR og villtype eller modifiserte substrater og undersøke ved hjelp av EMSA som beskrevet i trinn to.
- Merk: Den predikerte motiv er validert hvis RR binder villtype-substrat, men ikke den modifiserte.
6. Bevaring av Motif i Andre relaterte bakteriearter
- Velg genomer av interesse som inneholder orthologs av DVU3023. Skaff sekvens og merknadsfiler for genomene fra NCBI nettstedet.
- Bruk et programmeringsspråk som Perl å skrive skript som vil bruke de motiv sekvenser fra DAP-chip mål å bygge en position vektet matrise og bruke matrisen til å score lignende motiver som finnes i andre sekvenserte genomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennevnte metode ble brukt for å bestemme de globale genet mål av RRS i modellen sulfat reduserende bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denne organisme har et stort antall overlevende representert ved over 70 RR, som indikerer den store variasjonen av mulige signaler som den registrerer og reagerer på. In vivo-analyser for funksjonene til disse signalsystemer er vanskelig å utføre siden deres signaler og dermed deres aktiveringsbetingelser er ukjent. Her DAP-chip metoden ble brukt til å bestemme genet mål og dermed forutsi mulige funksjoner for et representativt RR DVU3023.
DVU3023 er en sigma-54-avhengige RR kodet i et operon med kognatreseptoren HK (figur 3A). Den C-terminal His-tagget-genet ble klonet inn i og renset fra E. coli. For første mål-bestemmelse, ble det renset RR testet for binding til dens nedstrøms operon som er en ti gene-operon (DVU3025-3035) consisting av laktat opptak og oksidasjon gener. RR DVU3023 forskjøvet oppstrømsområdet av DVU3025 (figur 3B). Neste RR DVU3023 fikk lov til å binde seg til skåret D. vulgaris Hildenborough genomisk DNA. Selv om fosforyleringen ikke var nødvendig for å binde seg til promotor-regionen i DVU3025, ble acetyl fosfat tilsatt til reaksjons i tilfelle det var nødvendig for binding til andre promotorer. Etter affinitetsrensing av proteinbundet DNA-fraksjon, ble qPCR brukt til å vise at oppstrømsområdet av DVU3025 er beriket (8,45 ganger) i protein-bundet fraksjon (C T = 6,9) i forhold til inngangs DNA (C t = 9.98 ) (figur 3C), noe som indikerer at bindingsbetingelser som ble brukt var egnet for RR DVU3023. Mangel på anrikning av promotorregionen av en tilfeldig valgt gen (DVU0013) ble anvendt som en negativ kontroll.
Det proteinbundne og inngangs DNA-prøver ble deretter merket fluorescensmerket og hybridisert tilen D. vulgaris Hildenborough flislegging array som hadde en høy sonde tetthet i de intergenic regioner. De fire øverste toppene ble valgt som de mest sannsynlige mål for DVU3023 (Figur 3D). Disse fire topper ble etterfulgt av flere andre, som også ble identifisert i DAP-chip-analyser for flere andre RR og dermed ut til å være klebrig DNA (tabell 1). Figur 3E er en skjematisk fremstilling av genene regulert av DVU3023. Den positive mål DVU3025 var den første toppen som oppnås med den høyeste poengsummen. To genet mål er to andre enkeltvis kodede laktat permeases (DVU2451 og DVU3284). Den fjerde genet målet ligger ikke i et oppstrømsregion, men i intergenic regionen mellom to convergently transkriberte gener / operoner (DVU0652 og DVU0653). Dette er en stor intergenic region, og i tillegg koder også en predikert sigma54-avhengige promotor. Det er mulig at det er en uoppdaget Srna kodet i dette området som er regulert av RR DVU3023.
Ved hjelp av oppstrøms-regioner av mål oppnådd ved DAP-chip, ble MEME brukes til å forutsi et bindingssete motiv (figur 3F, tabell 2). EMSA substrater med den spesifikke motiv oppstrøms DVU3025 ble utformet for å bekrefte at RR DVU3023 gjenkjenner og binder spådd motiv. Motivet ble videre validert ved å lage erstatninger i de konserverte baser innenfor motiv som eliminert bindende shift (Figur 3G). Dette validert motiv så ble brukt i Perl-genererte skriptene å skanne genomsekvenser av andre nært beslektede sulfat reduserende bakterier som hadde orthologs for DVU3023. Loci ble valgt som mulige genet mål når motiv ble plassert i oppstrøms-regioner av åpne leserammer (tabell 3). Bruke motiv sekvenser spådd for de ortologe RR, var en konsensus bindingssete motiv generert (Figur 3F) som lignet den one innhentet for D. vulgaris Hildenborough alene.
Figur 3. Bestemme genomisk mål for D. vulgaris respons regulator DVU3023. A. DVU3023 er kodet i et operon med kognatreseptoren HK. Den nedstrøms operon har en sigma54-avhengige promotor (bøyd sort pil) og ble brukt som en kandidat målgenet. B. Renset RR DVU3023 bundet og forskjøvet oppstrøms regionen DVU3025 7.. C. q-PCR av oppstrøms regioner av DVU3025 (positiv target) og DVU0013 (valgt som en negativ kontroll). E er proteinbundet beriket DNA brøkdel, er jeg innspill DNA. D. Topp fire topper innhentet etter DAP-chip analyse. Start og avslutt referere til DNA-koordinater ved starten og slutten av peaks; stillingen refererer til log 2 R forholdet mellom den fjerde høyeste sonden i toppen; Fdr = false funnraten; cutoff_p er cutoff prosentandelen der toppen ble identifisert. E. Skjematisk fremstilling av genet mål for DVU3023 basert på DAP-chip topper. Tall i esker angir det høyeste antallet i D. HK-RR gener er i grønt, målgener i blått og andre gener i grått. Svart bøyde pilene er sigma54-avhengige arrangører, er grønne fylte sirkler spådd bindingssetet motiver. Gene navn er som følger: por - pyruvat ferredoxin oxidoreductase; LLP - laktat permeaseproteiner; GLCD-glykolat oxidase; glpC-Fe-S klynge bindende protein; PTA - phosphotransacetylase; luftvern acetate kinase; lldE - laktat oxidase subenhet; lldF / G - laktat oxidase subenhet; MCP -. Metyl-akseptere kjemotaksis protein F. Weblogo 8 bilder av predicted bindingssetet motiv. Top - avledet fra DAP-chip mål; Bunn - avledet fra bindingssteder stede i genomer med orthologs av DVU3023 7 G. Validering av spådd bindingssetet motiv ved hjelp av EMSA.. DVU3023 forskjøvet villtype motiv (w), men ikke den modifiserte motiv (m). Sekvenser for w og m motivene er vist på høyre syv. Figur modifisert og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra Rajeev et al 7.
Tabell 1. Topp 20 topper fra DAP-chip rekke analyse. Tabellen er delt inn i tre seksjoner. Peak attributter viser detaljer av toppene som genereres av rekke analyse programvare, hvor Sted refererer til om toppen ble funnet i genomet eller ekstrakromosomalt plasmid, start og slutt referere til de sterte og slutten loci for toppen, Score refererer til log 2 R forholdstall for den fjerde høyeste sonde i toppen, refererer FDR til den falske funnraten verdi, og cutoff_p er cutoff prosentandelen der toppen ble identifisert. De andre to seksjoner Begynn koordinere kartlegging og End koordinere kartlegging kart starten og slutten loci, henholdsvis, av toppen til genet. I disse seksjoner Gene tråd refererer til tråden som koder for genet, forskyvning indikerer avstanden fra begynnelsen av genet (positive verdier indikerer loci er oppstrøms for genet, mens negative verdier indikerer loci er innenfor genet), er SANN Overlap genet verdi dersom locus lapper et gen, refererer DVU til DVU # av genet som koordinatene kart til, og Beskrivelse indikerer genet merknader. Tabell endret og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra Rajeev et al 7. Vennligst klikk her for å se alArger versjon av denne tabellen.
Tabell 2. Sekvenser brukes til å bygge konsensus DAP-chip mål basert motiv i figur 3. Tabell endret og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra Rajeev et al 7.
Tabell 3.. Bindingssetet motivene for DVU3023 orthologs stede i andre sekvensert Desulfovibrio og beslektede arter. For hver genom skannet, er organismen navn er angitt, etterfulgt av locus signal for den DVU3023 ortholog og dets prosent identitet til DVU3023 i parentes. Resultat indikerer verdien tilordnet av Perl program basert på likhet til inngangs frekvensvisCES. Beskrivelse sier genet merknader for genene i målet operon. Tabell endret og gjengitt ved hjelp av Creative Commons-lisens fra Rajeev et al 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DAP-chip metoden beskrevet her ble brukt til å bestemme genet mål for flere RR i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 av hvilken som er vist her som en representant resultat. For RR DVU3023, velger en kandidat genet målet var grei. DVU3025 er lokalisert umiddelbart nedstrøms for RR-genet, og RR og målgener er konservert i flere Desulfovibrio arter, og i tillegg DVU3025 har en predikert sigma54-avhengige promotor. Den EMSA gir en enkel metode for å teste hurtig RR for binding til kandidat målgen, og tillater evaluering av aktiviteten av det rensede protein prøven, samt bestemme optimale protein-DNA-bindingsforhold også.
Den DNA-bindende aktivitet kan også bli testet i nærvær og fravær av acetyl fosfat for å se om fosforylering er nødvendig for DNA-binding. Ikke alle RR fosforyleres av små molekyl givere9, i slike tilfeller det rensede kognat sensor kinase, hvis tilgjengelig, kan anvendes for å aktivere protein. Det er også atypiske RR kjent som mangler sentrale aktive site rester i mottakeren domenet og er ikke aktivert ved fosforylering 10. For flertallet av RR studert, stimulerer fosforylering DNA bindende 11. Men det finnes eksempler på at fosforylering ikke angriper in vitro DNA-bindende 12, og det finnes eksempler på at fosforylering er nødvendig for binding 13, og også de tilfeller hvor undergruppe av promotorer som er bundet øker med fosforylering 14.. DAP-chip-metoden kan utføres med og uten fosforylering å finne ut om det er forskjeller i settet av arrangører som er bundet av RR. Det bør imidlertid også bemerkes at noen RR kan bli renset i et funksjonelt fosforylert form fra E. coli 13.
Protokollen er beskrevet her er for en Hans-merket Proteinkonn slik at proteinbundet DNA er affinitet renset ved anvendelse av Ni-NTA agarose-harpiks, men det kan lett tilpasses til en hvilken som helst form for kodede protein ved å bruke passende affinitet harpiks for rullegardin. Etter DAP-WGA trinn, gir qPCR trinn en ytterligere kontroll for å sikre at de protein-gDNA bindingsforholdene var passende og at proteinbundet DNA ble vellykket anriket ved affinitetsrensing. Mer enn tre ganger anrikning er tilstrekkelig til å fortsette med hybridiseringstrinnet. I motsetning til den EMSA reaksjonen, er det ingen ikke-spesifikk konkurrent DNA som poly-dI.dC tilsatt til gDNA bindende reaksjonen, siden det forstyrrer WGA-trinnet. På grunn av dette hvis proteinprøven har ikke-spesifikk DNA-bindingsaktivitet deretter klar anrikning av den klare, mål-DNA vil ikke bli observert av qPCR. Således qPCR styre trinn kan anvendes for å optimalisere mengden av protein som brukes i gDNA bindende reaksjon. Kommersielt tilgjengelige kits for hele genomet forsterkning hevder å introduce ingen forsterkning skjevhet når den følger sine retningslinjer for minimum start DNA-materiale og lavt antall forsterkning sykluser. Forsterkningen skjevhet kan kontrolleres ved hjelp av qPCR med ulike primer sett på forsterket versus unamplified DNA. Enhver effekt på nedstrøms oppstillingen hybridisering kan også bli bestemt ved forskjellig merking og hybridisering samlet forsterket og uforsterket genomisk DNA.
Listen over toppene som genereres følgende rekke dataanalyse er vanligvis lang med flere topper å ha en falsk funnrate verdi på 0. Derfor en kombinasjon av andre peak attributter som høy log 2 R score og cutoff_p verdier (som genereres av rekke analyse programvare som brukes i denne undersøkelsen) blir brukt til å velge ut en liste ned til høyeste tillit genet mål. Tilstedeværelsen av den forhåndsbestemt genet mål blant de fem beste hits i stor grad styrker tilliten i datasettet. Utføring av denne analysen for et antall regulatoriske proteiner from samme organisme vil også bidra til å identifisere "sticky" DNA-sekvenser som vises i flere datasett 7. I tillegg hvis et bindingssete motiv kan forutsies og validert, og tilstedeværelsen av den motiv i toppene senke ned i listen kan også benyttes til å velge en konservativ målgenet listen. Anrikning av DNA andre enn Promoterregionene sekvenser kan være gjenstander av matrisen hybridisering, eller kan indikere at reguleringen av tidligere identifiserte åpne leserammer eller små RNA 7. For regulatorer, hvor et gen som mål ikke kunne forutbestemt ved hjelp av EMSA, kan DAP-chip assay bli utført "blind" 7. I slike tilfeller også vil identifikasjonen av et bindingssete motiv forbedre valg av genet mål. Å bestemme proteinkonsentrasjonen som skal benyttes i analysen er avhengig av ikke-spesifikk binding aktivitet av proteinet, som kan vurderes av EMSA hjelp av tilfeldig valgte DNA-substrater. Lavere konsentrasjoner fungere bedre for tslange proteiner med høy spesifikk binding aktivitet. Påliteligheten av en blind DAP-chip kan forbedres ved å utføre gjentatte analyser med ulike proteinkonsentrasjonen. For RR med noen mål, kan bare to eller til og med et enkelt assay være tilstrekkelig til å generere et mål liste som kan valideres ved å bruke etterfølgende EMSAs. De DAP-chip data for slike RR vanligvis viser et klart hopp i loggen to R score eller cutoff_p verdier utover de første par topper. For RR med flere mål, kan data fra tre gjentak bli analysert for å generere en liste over vanlige topper, noen som kan velges for EMSA validering.
Evnen til å forutsi binding site motiver basert på DAP-chip-mål bidrar til verdien av denne fremgangsmåte og vesentlig øker informasjon oppnådd. EMSA gir igjen en effektiv protokoll til eksperimentelt verifisere spådommer. Programvare scripts i Perl eller andre programmeringsspråk kan brukes til å raskt søke gjennom tilgjengelige genom SequeNCE. Resultatene vil identifisere både ortologe målgener samt målgener unikt regulert i genomene søkte. I det representative resultatet vist her, tre av de fire oppstrøms målrettingsregioner identifisert for DVU3023 har kommentert genfunksjoner knyttet til laktat opptak og oksidasjon. I tillegg siden bindingsstedet motiv for DVU3023 ble validert, kan andre genomer søkes etter lignende motiv sider. Sammen tyder resultatene på at den DVU3022-3023 TCS er godt bevart i Desulfovibrio og andre beslektede sulfatreduserende bakterier, og at den regulerer gener for laktat transport og oksidasjon til acetat. Siden laktat er den primære karbon og elektronkilde som brukes av disse organismene, sannsynligvis spiller DVU3023 en nøkkelrolle i sin fysiologi. Blant de beste DAP-chip topper for RR DVU3023, det var også en intergenic regionen. Selv om et bindingssete motiv ikke ble funnet i dette området, er tilstedeværelsen av en forutsagt sigma-54-avhengige promotor antyder that det kan være en uidentifisert ORF eller Srna kodet, og at det kunne være en sann mål for DVU3023. Denne oppdagelse fremhever verdien av den eksperimentelle DAP-chip metode kombinert med bindingssetet forutsigelser i motsetning til å bestemme mål-områder basert på beregnings prediksjoner alene.
Lignende in vitro metoder slik som den er beskrevet her har bare vært brukt i noen få tilfeller 15-17 og svært sjelden for en tidligere unstudied regulator. Optimalisering EMSA og qPCR trinn før matrisen hybridisering vil vesentlig hjelp ved analysering av resultater når fremgangsmåten skal anvendes for en ny regulator. Hvis matrise utskrift blir et hinder, kan DAP skritt kombineres med neste generasjons sekvensering for å få bindingssteder 18,19. Ettersom flere matrisebaserte metoder blir erstattet med sekvensbaserte strategier, som for fremtidig tilpasning av metoden omgår behovet for å utforme tilpassede flislegging mikromatriser for organism av interesse. Chip-Seq teknologier resultere i større følsomhet og spesifisitet for påvisning av toppene i forhold til chip-chip metoder, og er også raskt å bli mer kostnadseffektive 20. Selv om denne artikkelen fokusert på to komponent respons regulatorer, kan denne metoden brukes til noe prokaryote eller eukaryote transkripsjonsfaktor 15. Nukleosom occupancies har ofte en effekt på mål som er regulert og sammenligne målet bindingssteder for eukaryote transkripsjonsfaktorer ved in vivo-og in vitro-analyser kan avsløre disse effektene 21..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Amy Chen for hennes hjelp i forberedelsene til video skyte og for å demonstrere teknikken. Dette arbeidet ble utført av ENIGMA: Økosystemer og nettverk Integrert med gener og molekylære forsamlinger (http://enigma.lbl.gov), en vitenskapelig fokusområde Program ved Lawrence Berkeley National Laboratory, ble støttet av Office of Science, Office of Biological and Environmental Research, av US Department of Energy i henhold til kontrakt nummer DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
| Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
| PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
| Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used. |
| Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A |
References
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
- Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
- McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
- Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
- Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
- Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
- Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
- Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
- Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
- Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
- Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
- Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
- Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
- Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
- Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
- Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).
