इस प्रोटोकॉल में वर्णित तीन आयामी संस्कृति विधि एक branched अंग में उनकी पर्याप्त विस्तार, भेदभाव और morphogenesis सहित छितरी भ्रूण माउस अग्न्याशय विनियमन से अग्न्याशय विकास स्मरण दिलाता है. इस विधि इमेजिंग, आला के कार्यात्मक हस्तक्षेप और हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
अंग संस्कृति विवो जांच में जटिल लेकिन बहुत प्रासंगिक बीच अंतराल और सेल लाइन मॉडल के सुविधाजनक लेकिन लगभग सिमुलेशन कि पुल एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराता है. अग्न्याशय के मामले में, एंडोक्राइन और बहि कोशिकाओं का अनुकरण सेल लाइनों से बदल रहे हैं, हालांकि अग्न्याशय progenitors के लिए पूरी तरह से बराबर कोई सेल लाइन है. वयस्क पूरे अग्न्याशय सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता; पृथक अंत: स्रावी टापू सेल प्रसार के बिना कुछ हफ्तों के लिए रखा जा सकता है और ऊतक स्लाइस कुछ घंटे 5 के लिए इन विट्रो में रखा जा सकता है. भ्रूण अग्न्याशय संस्कृति को व्यापक रूप से इसके विकास का अध्ययन करने के लिए न केवल इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी 8 प्रक्रियाओं छवि को, उपकला-mesenchymal बातचीत 4,6,7 जांच करने के लिए या रासायनिक उन्हें 9 के साथ हस्तक्षेप करने के लिए. दो अंग संस्कृति तरीकों मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं: पहला conve है जो fibronectin लेपित प्लेट 2, पर अग्नाशय कलियों संवर्धन में होते हैंइमेजिंग प्रयोजनों के लिए nient; दूसरा विकल्प संस्कृति को सर्वश्रेष्ठ morphogenesis को बरकरार रखता है, जो हवा तरल इंटरफेस 3,4 पर फिल्टर पर अंगों है. बहुत उपयोगी हालांकि, इन तरीकों सपाट की एक निश्चित डिग्री करने के लिए नेतृत्व; सामान्य विकास की तुलना में और शुरू जनसंख्या अग्नाशय कोशिकाओं और mesenchymal कोशिकाओं के सभी प्रकार के शामिल जटिल है के रूप में progenitors के विस्तार बहुत सीमित है.
संस्कृति करने की क्षमता और छितरी प्राथमिक कोशिकाओं का विस्तार वंश संबंधों का अध्ययन करने और पृथक सेल प्रकार 10 के आंतरिक गुणों को उजागर करने के लिए मूल्यवान है. सुगियामा एट अल. 11 अग्न्याशय progenitors और फीडर परतों पर संस्कृति में 3-5 दिनों के लिए कुछ कार्यात्मक पात्रों को बरकरार रखा कि अंत: स्रावी progenitors बनाए रखने सकता है. Progenitors की प्रकृति / स्टेम कोशिकाओं हालांकि neurospheres 12 और 13 mammospheres करने जैसा Pancreatospheres, वयस्क टापू और ductal कोशिकाओं से विस्तारित किया गया हैइन क्षेत्रों उत्पन्न कि स्पष्ट नहीं है. इसके अलावा, शारीरिक विकास के साथ इसके विपरीत, pancreatospheres कुछ न्यूरॉन्स 14,15 निहित. क्षेत्रों में भी हाल ही में भ्रूण अग्न्याशय progenitors 16,17 और अच्छा पूर्वज विस्तार और बाद में भेदभाव के साथ pancreata 18 regenerating से उत्पादित लेकिन morphogenesis पुनरावृत्ति करने में विफल रहे थे.
छोटी अंगों में स्वयं को संगठित कि फैलाया और अक्सर परिभाषित कोशिकाओं से 3D मॉडल हाल ही में विकसित हुई और इस तरह आंत 19,20, पेट 21, जिगर 22, प्रोस्टेट 23 और ट्रेकिआ के रूप में कई अंगों के विकास या वयस्क कारोबार अनुकरण किया है 24. ऑप्टिक कप 25, आंत 26 या मस्तिष्क 27 के मामले के रूप में कुछ मामलों में, विकास morphogenesis और भेदभाव, ES कोशिकाओं से 3 डी में recapitulated किया गया है.
यहाँ, हम desवे अंतर और स्वयं को संगठित कर सकते हैं एक 3 डी Matrigel पाड़ में अलग multipotent अग्नाशय के progenitors विस्तार करने के लिए एक विधि cribe.
इन विट्रो में कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर उत्पादन अभी भी 1 अप्रभावी है. इस चुनौतीपूर्ण संदर्भ में, विकास जीव विज्ञान के अध्ययन कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं के भेदभाव के लिए आवश्यक ह?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम डेट frie Forskningsråd / Sundhed ओग Sygdom से एक जेनेटिक्स पायलट पुरस्कार में NCCR फ्रंटियर्स, किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान 41-2009-775 और अनुदान 12-126875 से क्रमिक रूप से वित्त पोषित किया गया. लेखकों वीडियो शूटिंग की मेजबानी के लिए स्पैगनॉली प्रयोगशाला धन्यवाद.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |