O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
Cultura órgão fornece um modelo útil que preenche as lacunas entre o complexo, mas altamente relevante em investigações in vivo ea simulação conveniente, mas aproximado de modelos da linha celular. No caso do pâncreas, não existe uma linha de células perfeitamente equivalente a progenitores pâncreas embora existam linhas de células transformadas que simulam células endócrinas e exócrinas. Todo o pâncreas adulto não podem ser cultivadas; ilhotas isoladas endócrinos pode ser mantida durante algumas semanas, sem proliferação celular e fatias de tecidos podem ser mantidos in vitro durante 5 horas. Cultura pâncreas embrionário tem sido amplamente utilizado, não só para estudar o seu desenvolvimento, mas também para investigar interacções epiteliais mesenquimais 4,6,7, a imagem processa 8 ou para interferir quimicamente com eles 9. Dois métodos de cultura de órgãos são usados principalmente: a primeira consiste na cultura de gomos pancreáticas em placas revestidas com fibronectina 2, que é convenient para fins de imagem; a segunda opção é a cultura dos órgãos de filtros na interface ar-líquido 3,4 que melhor preserva a morfogênese. Apesar de muito úteis, estes métodos levam a um certo grau de achatamento; a expansão de células progenitoras é muito limitado em comparação com o normal desenvolvimento e a população de partida é complexo que compreende todos os tipos de células pancreáticas e células mesenquimais.
A capacidade de cultura e expandir células primárias dispersas é valioso para estudar relações de linhagem e descobrir as propriedades intrínsecas dos tipos de células isoladas 10. Sugiyama et al. 11 poderia manter progenitores pâncreas e progenitores endócrinas que retiveram alguns personagens funcionais por 3-5 dias em cultura em camadas alimentadoras. Pancreatospheres, semelhante ao neurospheres 12 e mammospheres 13, foram ampliados a partir de ilhotas adultas e células ductais embora a natureza dos progenitores / células-troncoque geram essas esferas não é clara. Além disso, em contraste com o desenvolvimento fisiológico, os pancreatospheres continha alguns neurónios 14,15. Spheres também foram recentemente produzidos a partir de células progenitoras embrionárias pâncreas 16,17 e regenerar pancreata 18 com boa expansão e diferenciação de células progenitoras subseqüente, mas não conseguiu recapitular morfogênese.
Modelos 3D a partir de células dispersas e, muitas vezes definidos que se auto-organizam em órgãos miniaturizados recentemente floresceu e simular desenvolvimento ou adulto o volume de negócios de vários órgãos, como o intestino 19,20, o estômago 21, o fígado 22, a próstata 23 e traquéia 24. Em alguns casos, a morfogénese e diferenciação de desenvolvimento foram recapitulado em 3D a partir de células ES, como é o caso dos copos óptica 25, 26 do intestino ou do cérebro 27.
Aqui, desCribe um método para expandir progenitores multipotentes pancreáticas dissociadas em um andaime Matrigel 3D onde podem diferenciar e se auto-organizar.
A produção em grande escala de células beta funcionais in vitro ainda é ineficaz 1. Neste contexto desafiador, estudos de biologia do desenvolvimento pode ajudar a decifrar os sinais exatos que são necessários para a diferenciação das células beta funcionais. Este protocolo permite a manutenção, expansão e diferenciação de células progenitoras pancreáticas embrionárias in vitro. Isso inclui a formação de células beta produtoras de insulina que não co-expressar outros hor…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma seqüência Fronteiras NCCR em Genética prêmio piloto, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 e Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Os autores agradecem o laboratório Spagnoli por sediar a gravação de vídeo.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |