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Biology

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

Introduction

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Cultura órgão fornece um modelo útil que preenche as lacunas entre o complexo, mas altamente relevante em investigações in vivo ea simulação conveniente, mas aproximado de modelos da linha celular. No caso do pâncreas, não existe uma linha de células perfeitamente equivalente a progenitores pâncreas embora existam linhas de células transformadas que simulam células endócrinas e exócrinas. Todo o pâncreas adulto não podem ser cultivadas; ilhotas isoladas endócrinos pode ser mantida durante algumas semanas, sem proliferação celular e fatias de tecidos podem ser mantidos in vitro durante 5 horas. Cultura pâncreas embrionário tem sido amplamente utilizado, não só para estudar o seu desenvolvimento, mas também para investigar interacções epiteliais mesenquimais 4,6,7, a imagem processa 8 ou para interferir quimicamente com eles 9. Dois métodos de cultura de órgãos são usados ​​principalmente: a primeira consiste na cultura de gomos pancreáticas em placas revestidas com fibronectina 2, que é convenient para fins de imagem; a segunda opção é a cultura dos órgãos de filtros na interface ar-líquido 3,4 que melhor preserva a morfogênese. Apesar de muito úteis, estes métodos levam a um certo grau de achatamento; a expansão de células progenitoras é muito limitado em comparação com o normal desenvolvimento e a população de partida é complexo que compreende todos os tipos de células pancreáticas e células mesenquimais.

A capacidade de cultura e expandir células primárias dispersas é valioso para estudar relações de linhagem e descobrir as propriedades intrínsecas dos tipos de células isoladas 10. Sugiyama et al. 11 poderia manter progenitores pâncreas e progenitores endócrinas que retiveram alguns personagens funcionais por 3-5 dias em cultura em camadas alimentadoras. Pancreatospheres, semelhante ao neurospheres 12 e mammospheres 13, foram ampliados a partir de ilhotas adultas e células ductais embora a natureza dos progenitores / células-troncoque geram essas esferas não é clara. Além disso, em contraste com o desenvolvimento fisiológico, os pancreatospheres continha alguns neurónios 14,15. Spheres também foram recentemente produzidos a partir de células progenitoras embrionárias pâncreas 16,17 e regenerar pancreata 18 com boa expansão e diferenciação de células progenitoras subseqüente, mas não conseguiu recapitular morfogênese.

Modelos 3D a partir de células dispersas e, muitas vezes definidos que se auto-organizam em órgãos miniaturizados recentemente floresceu e simular desenvolvimento ou adulto o volume de negócios de vários órgãos, como o intestino 19,20, o estômago 21, o fígado 22, a próstata 23 e traquéia 24. Em alguns casos, a morfogénese e diferenciação de desenvolvimento foram recapitulado em 3D a partir de células ES, como é o caso dos copos óptica 25, 26 do intestino ou do cérebro 27.

Aqui, desCribe um método para expandir progenitores multipotentes pancreáticas dissociadas em um andaime Matrigel 3D onde podem diferenciar e se auto-organizar.

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Protocol

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Este protocolo destina-se a crescer organoids pancreáticas derivados de E10.5 de murino dissociadas células pancreáticas epiteliais.

O protocolo exige aprovação ética para experimentação animal.

1. Dissecção da Dorsal pâncreas Bud de E10.5 embriões de camundongos

  1. Sacrifício camundongos cronometrado grávidas no dia embrionário (E) 10,5, abrir o abdômen com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos e coloque-os em um prato de 10 centímetros de Petri cheia de fosfato frio salina tampão (PBS) ou Dulbecco modificado meio essencial (DMEM) conservados em gelo. O experimento total a partir do sacrifício a semeadura de células é feito em 60-90 min para evitar danos nas células.
  2. Separe o útero em segmentos de embriões individuais usando uma tesoura pequena. Transferência de um embrião para um prato de 35 milímetros Petri com PBS frio e visualizá-lo sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Com uma pinça de dissecção remover o músculo, decídua e gema em torno sac e expor o embrião. Coloque o embrião de volta para o meio de DMEM frio. Os embriões podem ser facilmente transferidas usando um 3 ml de transferência de pipeta de plástico / conta-gotas. Isolar cada embrião indivíduo de uma forma semelhante, antes de continuar.
  3. Coloque um embrião em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS.
    1. Use uma pinça fina (largura 0,05 mm) para remover o membro anterior. Suavemente inserir a pinça na abertura para retirar o tracto digestivo da região da medula espinhal (Figura 1). Opcional: Para ver mais convenientemente o estômago, remover a parte superior do corpo do embrião, para baixo para o coração e a região da cauda a seguir a haste de gema.
    2. Localize o estômago, fígado e intestino. Usando fórceps, isolar o tracto gastrointestinal a partir do estômago para o intestino e colocá-lo em DMEM frio em gelo (Figura 1). O botão de pâncreas dorsal está ligado dorsalmente, posterior ao estômago (Figura 1).
    3. Isolar cada trato gastrointestinal individual em um similar forma antes de continuar. Se os embriões precisam ser genotipados, recolher a cauda no momento do esvaziamento e manter cada tracto gastrointestinal num indivíduo bem diferente em uma placa de 24 poços com DMEM frio em gelo.
  4. Coloque um trato gastrointestinal em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS frio. Agora use iluminação abaixo em campo claro de visualizar e dissecar o dorsal gemas pancreático sob o microscópio de dissecação. Estas condições irão optimizar a visualização de volumes. Usando agulhas de tungstênio eletroliticamente-afiadas ou 20 g de agulhas de seringa, isolar o broto pancreático com tão pouco quanto possível mesenchyme ao redor do epitélio (Figura 1).
    1. Transferir o botão isolado em uma placa de Petri contendo uma solução fria de dispase (1,25 mg / ml) durante 2-3 min. A partir deste ponto, a transferência pode ser realizada mais convenientemente com capilares de vidro de 50 mL puxou-chamas ligados a um tubo flexível controlada aftosa. Em alternativa, mas com mais risk de perder pela raiz, use a 10 mL pipeta automática (Pipetman) com pontas de plástico apropriados.
    2. Realize bud aspiração e ejeção de pâncreas sob controle microscópico. Coloque o broto pancreático volta em PBS. Além disso limpar a gema de pâncreas isolado do mesênquima com as agulhas e aspiração suave usando o capilar de vidro (Figura 1).
    3. Quando todo o mesênquima é removido, lave o broto pancreático em PBS frio; transferir cada broto de DMEM frio em poços individuais (60 poços mini-bandejas cheias com 10 ml de DMEM frio). É importante não remover o mesênquima em dispase, o que torna o tecido muito pegajosa.

2. Chapeamento e Cultura de células dispersas

  1. Transfira o epitélio dissecado de todos os embriões com um capilar de vidro, puxado-chama em poços cônicos de 60 poços mini-bandejas cheias de 10 mL PBS para enxaguar.
    1. Transferir o botão em 10 ul de tripsina a 0,05% de umnd deixe incubar a 37 ° C durante 4 min. Inactivar a tripsina pela transferência do broto para um poço com 10 mL de DMEM + 10% soro fetal bovino (FCS).
    2. Dissociar a suspensão de células por aspiração através de um capilar fino puxado com um puxador de pipeta. É importante evitar bolhas nesta fase, enquanto pipetando para cima e para baixo para dissociar as células. Organoids Pâncreas optimamente começar a partir de pequenos grupos de 5-15 células e, portanto, a dissociação parcial é recomendada (Figura 1).
  2. Reunir as células de vários embriões para um tubo Eppendorf, a fim de minimizar as diferenças devidas ao processamento individual. Dilui-se a suspensão de células em Matrigel refrigerados a uma razão de 1:3. Aliquota desta mistura para uma placa de 96 poços, 8 ul / poço ou numa placa optimizado para imagiologia (ver abaixo).
  3. Incubar a placa a 37 ° C durante 5 minutos, permitindo que o Matrigel para engrossar. Preencha os poços com 70 mL de meio de escolha (organóides ou esfera, consulte Tables 1 e 2) e deixar em um ambiente humidificado contendo 5% de CO 2 e 95% de ar a 37 ° C.
  4. Substituir o meio de cada 4 º dia. Monitorar as crescentes colônias pancreáticas diário e documentar o processo de geração de imagens.
  5. As moléculas pequenas ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao meio, nesta fase, para as experiências de interferência, como relatado anteriormente 28.

Tabela 1: médio organóides.

Nome de Materiais Banco de Concentração Concentração na mídia final Volume de estoque
Penicilina-Estreptomicina 100% 1% 50 ul
KnockOut substituição Serum (suplemento) 100% 10% 500 ul
2-mercaptoetanol 14,3 M 0,1 mM 1 ul
Phorbol Myristate acetato (PMA) 16 uM 16 nM 5 ul
Y-27632 (inibidor ROCK) 50 mM 10 uM 1 ul
EGF 50 ng / mL 25 ng / mL 2,5 mL
Recombinante Humana R-espondina 1 250 ug / ml 500 ng / mL 10 ul
- Ou -
Recombinante do rato R-espondina 1 250 ug / ml 500 ng / mL 10 ul
Recombinante FGF1 humano (aFGF) 100 ug / ml 25 ng / mL 1,25 mL
A heparina (Liquemine) 2500 U / ml 2,5 U / mL 2 ul
RecomFGF10 Humano binant 100 ug / ml 100 ng / mL 5 ul
DMEM/F-12 4,412.25 mL
Total 5000 mL

Tabela 2: médio Sphere.

Nome de Materiais Banco de Concentração Concentração na mídia final Volume de estoque
Penicilina-Estreptomicina 100% 1% 50 ul
B27 x50 (suplemento) 100% 10% 100 ul
Recombinante FGF2 humano (bFGF) 100 ug / ml 64 ng / mL 3,2 mL
Y-27632 (inibidor ROCK) 50 mM 10 uM 1 ul
DMEM/F-12 4845,8 mL
Total 5000 mL

3. Imagem da Progressão de Desenvolvimento organoide

  1. Imagem organoids quer diárias ou por microscopia de lapso de tempo usando um microscópio fluorescente time-lapse. Por lapso de tempo de imagem, use um XY (Z) microscópio de fluorescência invertido automatizado.
  2. Depósito pequenas gotículas de 3 mL em placas de 4 poços ou placas com fundo de vidro preenchidos com 2-5 ml médio. Imagem com um objetivo de longa distância 10x. Nota: Os ratinhos transgénicos que expressam marcadores fluorescentes podem ser usados. Filme 1 mostra, por exemplo, a expansão inicial de organoids de Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + camundongos 4. A GFP nuclear permite ao utilizador controlar as células como objectos individuais, mas os mesmos princípios podem ser aplicados para controlar as células com fluorescência de membrana taiscomo MT / MG camundongos 29.
  3. Comece lapso de tempo de imagem de 3 horas após a semeadura das células a fim de evitar desvios de foco e definir a automação controlar software para tirar uma foto / h por 3 ou mais dias, em posições definidas manualmente. Para cada posição, adquirir uma interferência diferencial contraste da imagem (DIC) bem como o sinal de GFP, a expressão do marcador fluorescente relatórios.

4. Recuperação de Organóides para Histologia

  1. Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio, substitui-lo com PBS gelado. Este despolimeriza parcialmente Matrigel.
  2. Gentilmente aspirar cada organoide individual, removendo o Matrigel circundante usando uma ponta 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura geral. Transferir cada organóide para um poço com PBS gelado. Manter a placa de gelo. Fixação direta em Matrigel também é possível.
  3. Fixe o organoide por 15 min em 4% paraformaldeído (PFA), criopreservar-lo em sacarose e incorporá-lo em gelatina. Processar cadaorganóide para cryosectioning e histologia, como descrito anteriormente (Johansson et al., 2007) 4.

5. Recuperação de Organóides por PCR e Bioquímica

  1. Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio. Adicionar 60 ul de RNAlater por poço, de modo a estabilizar e proteger o ARN celular.
  2. Interromper o gel em cada poço mecanicamente por despolimerização que parcialmente em gelo. Ou recuperar organoids individuais usando uma ponta de 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura global ou recuperar todo o bem (com Matrigel) por perturbar o gel mecanicamente com um mL ponta 200. Utilizar uma ponta 1000 ul de transferir o conteúdo do poço para um tubo Eppendorf livre de não-pegajoso RNAse mantido em gelo.
  3. Lavar os poços com 60 ul RNAlater e adicionar o restante conteúdo para o mesmo tubo de Eppendorf.
  4. Girar os tubos durante 5 min a 500-1000 x g a 4 ° C.
  5. Remover o sobrenadante, deixando apenas 20-30 mLde RNAlater no tubo juntamente com o pellet. Para bioquímica, armazenar as amostras o mais seco possível.
  6. Não congelar amostras em RNAlater imediatamente; armazenar a 4 ° CO / N (para permitir RNAlater para penetrar profundamente no tecido). O tecido pode ser armazenada a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e pode ser posteriormente processado para a ruptura de tecido e a extracção de pequenas quantidades de ARN.

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Representative Results

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E10.5 dorsais progenitores pancreáticas dissociadas e semeadas em Matrigel 3D recapitular desenvolvimento pâncreas. Progenitores pode ser mais fácil de ser seguido com repórteres fluorescentes. No nosso caso, usamos um camundongo transgênico que expressa uma proteína GFP nuclear controlada por Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Filme 1), na ausência de tamoxifeno e, portanto, sem ativar Neurog3 4 (Figura 2).

Com o meio de organóide, uma compactação inicial de pequenos aglomerados de células ocorre nas primeiras horas. A expansão pode ser então detectada por o alargamento dos aglomerados nos primeiros 4 dias (Figura 2A). A partir do dia 5, formam ramos nas 20% maiores organoids. Células individuais não se expandem e perdem expressão Pdx1 enquanto os grandes aglomerados conservar a expressão Pdx1 28.

Nestas condições, os progenitores sofrer uma especificaçãotacular morfogênese com o surgimento de estruturas epiteliais ramificadas. Este processo ocorre somente quando os progenitores são semeadas em ≥ 4 células-agrupamentos, indicando uma forte exigência de sinais da comunidade. A análise histológica revela que após o dia 7 de cultura, as mini-órgãos resultantes são compostos de células progenitoras pancreáticas (+ / células SOX9 HNF1B + / +: Pdx1 Figura 3B) e células diferenciadas que expressam ou exócrino (Amilase +) ou endócrino (+ ou insulina glucagon +) marcadores (Figura 3A, C). A diferenciação em células endócrinas é menor do que no pâncreas endógeno (cerca de 0,1%), mas é aumentada para 1% quando FGF1 não é adicionado ao meio de cultura 28. Notavelmente, não só os progenitores semeados diferenciar em linhagens pancreáticas esperados, mas eles também adotam espontaneamente a arquitetura pancreática normal. Embora E10.5 progenitores multipotentes pâncreas não são polarizados, as células em cultura polarizar como demonstrado pela segregação de Mucina1 e aPKC na membrana voltado para o lúmen central e que se organizam em uma rede tubular ramificado. Regionalizados "tip e do tronco" domínios emergir: HNF1B + progenitores e células endócrinas são localizadas na região central, enquanto que as células acinares estão localizados na periferia como uma coroa parcial ou completa de células. Os organoids podem ser mantidas em cultura durante 10 dias; após este período, eles geralmente perdem a sua organização arquitectónica e tornar-se cística (não mostrado). Passaging pode ser feito após a dissociação parcial mas rapidamente leva a formação de cistos, um fenómeno que é reduzido pela adição do inibidor de BMP Noggin 28.

Com o meio de esfera, a expansão é mais freqüente e é visto a partir de 2% de células individuais; no entanto, a eficiência de formação de esfera se correlaciona com o tamanho da seeded aglomerados 28. No dia 2/3, uma luz for detectada nos pequenos aglomerados e expande-se, posteriormente, em grande parte, levando a esferas ocas de mono-camadas com áreas ocasionais em multicamadas locais (Figura 2B). Estas esferas de colapso quando recuperados a partir de Matrigel (Figura 3D-H). Sob estas condições, as estruturas resultantes são compostos principalmente de células progenitoras do pâncreas, com uma pequena percentagem de células exócrinas e endócrinas diferenciadas no dia 7 (Figura 3D-H). Progenitores nas esferas também tornar apicalmente polarizada, como demonstrado pela segregação de aPKC na membrana voltado para o lúmen central de todas as células (Figura 3F). Pancreatospheres podem ser passadas, pelo menos, duas vezes (não mostrado).

Figura 1
Figura 1. Representação esquemática do procedure. do tracto gastro-intestinal é inicialmente dissecado a partir do embrião e, subsequentemente, o botão de pâncreas dorsal é isolado. O mesênquima é removida e as células progenitoras pancreáticas são dissociados utilizando tripsina. As células parcialmente dispersas resultantes são então semeadas a baixa densidade em crescimento empobrecido factor Matrigel. Escala: bares. 1,00 milímetros, exceto para a imagem organoide resultando em que a barra de escala é de 200 mM Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Progresso da cultura ao longo do tempo. (A) Um pequeno grupo de células progenitoras pancreáticas cultivadas com o meio organoide e seguiram com microscopia de lapso de tempo de 3 horas após o plaqueamento, por 60 horas. No bopainéis ttom, um organoide após 7 dias de cultura. Barra de escala: 200 um; aplica-se a todos os painéis em A. (B) Exemplo de uma esfera seguida em um 60 horas time-lapse e capturado no dia 7 de cultura. Barra de escala: 200 um; aplica-se a todos os painéis em B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Histologia. (AC) Cortes seriados de 7 dias organoide manchado por progenitor (B - HNF1B) e diferenciação (A - amilase, C - insulina) marcadores. O organoide é composto de epitélio (A - E-caderina) e apical polarizada (B - Mucina1) células. A linha tracejada corresponde à região central não-acinares (A), ondeHNF1B (B) e endócrina (C), as células são detectados (DH) Secções de esferas de 7 dias coradas para progenitor. (G - HNF1B, H - SOX9) e endócrinas (D - insulina e glucagon) marcadores. As esferas são compostas de apical polarizada (D, F - aPKC) epitelial (E - E-caderina) células. Barra de escala:. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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A produção em grande escala de células beta funcionais in vitro ainda é ineficaz 1. Neste contexto desafiador, estudos de biologia do desenvolvimento pode ajudar a decifrar os sinais exatos que são necessários para a diferenciação das células beta funcionais. Este protocolo permite a manutenção, expansão e diferenciação de células progenitoras pancreáticas embrionárias in vitro. Isso inclui a formação de células beta produtoras de insulina que não co-expressar outros hormônios endócrinas, têm altos níveis de Pdx1, expressar os pró-convertases que vencem insulina e têm a insulina processado 28. Fatores-chave importantes dentro do sistema são a atividade de FGF (exogenamente estimulada por FGF adicionado potenciado pela heparina) e Notch (endógena) vias de sinalização, bem como ROCK-inibição por Y-27632: na ausência desses fatores, nenhum ou muito um número limitado de organoids e esferas foram geradas 28. O requisito para o FGF e Nãoatividade ch é facilmente compreendida com base em sua importância para o desenvolvimento do pâncreas in vivo 28. ROCHA inibidor pode ser substituído por blebbistatin, revelando assim que hiperactivação dinâmica Microfilamentos mediante dissociação conduz ao aumento da morte celular, uma forte inibição do factor de transcrição Pdx1 progenitoras e uma falta de expansão. Interessantemente, muitos componentes adicionais do meio organóide foram provado ser individualmente desnecessária, mas a sua ausência combinada resultou na perda de células epiteliais de ramificação 28. Além de certos componentes essenciais do meio, que é importante para controlar o nível de dissociação de células progenitoras. De facto, a proliferação de células progenitoras e de manutenção Pdx1 são significativamente promovida em grupos de mais de quatro células. A compactação pode ser observado nas primeiras 12 horas e falta de resultados compactos em falha em manter Pdx1 e expandir. O inibidor ROCHA é essencial para esteprocesso.

Nos organoids momento não se formam após a triagem FACS, mas a eficiência do sistema poderia ser melhorada por reaggregating um número controlado de células progenitoras. Um outro componente essencial do presente sistema de cultura é a matriz 3D. Células colocar em Matrigel ou no Matrigel muito perto da parte inferior da placa propagação e perder expressão Pdx1. Matrigel provavelmente fornece componentes bioquímicos, nomeadamente laminina, bem como pistas mecânico 28. Com efeito, a rigidez da matriz desempenha um papel fundamental. Hidrogéis Stiff não são permissivo para progenitores pancreáticas manutenção e expansão 28 e diluído Matrigel também não é. Quando Matrigel é diluído 1:10 pâncreas progenitoras não podem ser cultivadas.

O sistema organóide pode ser usado para testar os efeitos de pequenas moléculas e proteínas recombinantes em células progenitoras pancreáticas em termos de sobrevivência, a proliferação, diferenciação, de polarização e de ramificação28. Ele também pode ser usado para testar a cooperação de diferentes tipos de células durante o desenvolvimento do pâncreas 28. Estamos confiantes de que a acessibilidade de células progenitoras do pâncreas também permitirá que as manipulações genéticas, como a segmentação viral, como visto em outros sistemas organoide 17,27. Isto poderia ser usado para o rastreio de 17 com um sistema que permite a morfogénese em contraste com as esferas descritas anteriormente, bem como aqui 16,17,28. As condições de cultura que também desenvolvidos apresentam a vantagem de ser isento de soro, e desprovida de mesênquima e vasos sanguíneos, reduzindo assim a complexidade celular e bioquímico livre de alimentador. No entanto, existe uma limitação na capacidade de passagem e, assim, os organoids para obter grandes quantidades de células progenitoras. Isso poderia ser evitado no futuro por adaptações do protocolo para fases posteriores de desenvolvimento, onde os progenitores são mais abundantes, a fontes de progenitores pancreáticas produzidos a partir de embryonic-tronco células (ES) ou tronco pluripotentes induzidas (iPS). Isso abre o caminho para um modelo 3D de desenvolvimento de pâncreas humano.

Este sistema também pode ser potencialmente utilizado para a produção de células pancreáticas na perspectiva da terapia futura. Neste contexto, a produção de células beta funcionais para transplante seria potencialmente ajudar na terapia de diabetes. As adaptações do sistema para ES humanos ou células iPS seria importante para essa finalidade. Ainda não está claro se deve ser utilizado nas condições organoide ou esfera. As condições organóide permitir a produção de células que têm várias características das células beta maduras, mas a sua função permanece para ser testado. No entanto, estas células não são actualmente numerosos e são misturados entre outras células. É também provável que o aparecimento precoce de heterogeneidade no sistema organóide leva a sinalização descontrolada entre células e é, portanto, prejudiciais para a produção.

Tele sistema de esfera que mantém progenitores é preferível, em princípio, para a expansão controlada e de passagens em células progenitoras, mas a sua diferenciação subsequente continua a ser controlado. Outros produziram recentemente pancreatospheres que pode ser eficientemente diferenciadas. Será importante comparar a natureza das esferas obtidas no protocolo de corrente desprovida de alimentadores e soro para esferas obtidas com os outros protocolos 16,17. De um ponto de vista terapêutico, a complexidade e origem biológica de Matrigel pode constituir uma questão de reprodutibilidade, saúde e escalabilidade. Os resultados preliminares mostraram que os hidrogéis macios funcionalizadas com laminina são permissivas para a expansão de células progenitoras pancreática in vitro. Optimização adicional é necessária uma vez que estes geles ainda não são tão eficientes quanto Matrigel 28.

A produção de células beta em seu contexto natural também pode ser potencialmente útil para testar drogas que aumentam a betaa actividade de células ou aumentar a sua sobrevivência ou proliferação, mas para este fim, será importante para a primeira testar o grau de maturidade das células beta, para aumentar a eficiência da sua diferenciação e para testar se as condições de cultura aqui apresentados manter melhor do que a actual ilhotas As culturas em suspensão. Produzindo o pâncreas exócrino também poderia ser útil para o desenvolvimento de medicamentos para atingir os cancros do pâncreas e pancreatite. Aqui, novamente, o grau de maturidade das células exócrinas produzidos precisa ser minuciosamente investigadas.

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Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma seqüência Fronteiras NCCR em Genética prêmio piloto, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 e Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Os autores agradecem o laboratório Spagnoli por sediar a gravação de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>In Vitro</em> Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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