Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51726

Summary

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Abstract

Meting van de visuele functie in de kikkervisjes van de kikker, Xenopus laevis, laat screenen op blindheid in levende dieren. Optokinetische reactie een-visie gebaseerde, reflexieve gedrag is waargenomen bij alle geteste vertebraten. Tadpole ogen zijn klein, zodat de staart flip respons werd gebruikt als alternatieve maatregel, die een vakman om de subtiele reactie opnemen vereist. We ontwikkelden een alternatief gedrag assay gebaseerd op het feit dat kikkervisjes liever zwemmen op de witte zijde van een tank wanneer geplaatst in een tank met zowel zwarte als witte zijkant. De hier gepresenteerde test is een goedkope, eenvoudige alternatief dat een reactie die gemakkelijk gemeten creëert. De opstelling bestaat uit een statief, webcam en geneste testen tanks, direct beschikbaar in de meeste Xenopus laboratoria. Dit artikel bevat een film die het gedrag van kikkervisjes, voor en na verbreken van de oogzenuw. Om de functie van een oog te testen hebben we ook vertegenwoordigers omvattenwoordiger resultaten van een kikkervisje waarbij elk oog onderging netvlies axotomy op opeenvolgende dagen. Toekomstige studies zouden een geautomatiseerde versie van deze test te ontwikkelen voor het testen van de visie van veel kikkervisjes in een keer.

Introduction

Xenopus laevis zijn gebruikt als modelorganisme om de vorming oog te bestuderen. De ogen snel te ontwikkelen, groeien naar volwassenheid in minder dan een week voor het testen van genen of wegen die een effect hebben op de visuele ontwikkeling en functie hebben. Om visuele functie te testen, heeft de optokinetische en optomotor respons gebruikt in zebravis en Xenopus kikkervisjes, respectievelijk 1,2. Omdat de ogen van Xenopus kikkervisjes zijn relatief kleiner dan de zebravis, deze test vereist het gebruik van gespecialiseerde apparatuur en opgeleid personeel om de subtiele staart-flip en oog-beweging te detecteren in Xenopus. Een meer robuuste gedrag in Xenopus is de voorkeur voor zwemmen in een tank met een witte achtergrond, die hierin 3 wordt beschreven. Bij het plaatsen van een kikkervisje in een half zwart / half-witte tank, het pre-metamorfe kikkervisje snel zwemt naar de witte kant van de tank. Hiervoor gebruikten we deze assay om te bepalen of pluripotente cel-afgeleideogen waren functioneel 4. Hier melden wij een gedetailleerde versie van deze test, die kan worden gebruikt om de visuele functie van premetamorphic Xenopus kikkervisjes testen.

Deze test is eenvoudiger dan de optomotor respons test, omdat het vereist slechts een gemonteerde digitale camcorder, digitale camera software en standaard uitrusting in de meeste Xenopus laboratoria. Bovendien, de geregistreerde respons vereist geen speciale training tally resultaten. Onze vertegenwoordiger resultaten tonen aan dat dezelfde groep van kikkervisjes, dubbele retinale axotomy hebben ondergaan, zwemmen willekeurig rond de tank. We hebben ook het gedrag test resultaten van een representatieve kikkervisje, toont hoe een oog kan worden getest visuele responsie. Een werkblad opgenomen zodat getallen tijdens de test verkregen kan worden ingebracht en geanalyseerd. Dit werkblad kan gebruikt worden om te bepalen of de geteste kikkervisjes hebben een visuele reactie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal Care

De Xenopus laevis kikkervisjes die in deze studie werden gekweekt, gehouden en behandeld volgens de procedures door Upstate Medical University IACUC en de Gids goedgekeurd voor de Zorg en gebruik van proefdieren.

. 1 Pre-gedrag instellen: Kikkervisjes

  1. Verkrijgen bevruchte Xenopus embryo van een commercieel beschikbare bron of in vitro bevruchten eicellen, zoals eerder beschreven 6.
  2. Plaats blastula om neurale plaat stadium embryo's bij 18 ˚ C in 60 mm platen met 0,1 x MMR [10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) oplossing voorraad (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7,5, geautoclaveerd en opgeslagen bij kamertemperatuur)] met 50 ug / ml gentamicine antibioticum. Wijzig 0,1 x MMR elke dag en verwijder alle dode embryo's.
  3. Zodra het embryo bereiken Nieuwkoop en Faber stadium ~ 27-30 juli, schakelen the embryo's in 0,1 x MMR zonder antibioticum darm bacteriële groei mogelijk te maken.
  4. Groeien de kikkervisjes tot ze de voeding stadium (fase 45) te bereiken en hen te verplaatsen naar 100 mm gerechten Petri gevuld met 0,1 x MMR. Voed ze brandnetel poeder supernatant om de andere dag voor een week, het veranderen van de 0,1 x MMR op de tussenliggende dag.
  5. Na een week in de 100 mm petrischaal, verplaats dieren halve liter tanks gevuld met kikker water [0,5 g / L direct oceaan en 2 mM natriumfosfaat dibasisch (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Voed ze zoals in stap 2.4, maar verander alleen water 2-3 keer per week als het water troebel. Handhaving van de dieren in een 12 uur light/12 donker licht cyclus met de lichten aanzetten om 06:00.
  6. Plaats de halve liter tank met de proefpersonen op een witte ondergrond, zoals een lab bankje underpad, ten minste 12 uur O / N, voorafgaand aan het testen.
  7. Test kikkervisjes in stadium 45 tot 50 zoals beschreven in stap 3 hieronder.

. 2 Pre-gedrag instellen: Equipment

  1. Vernietiging van een deel van het laboratorium voor het gedrag assay. Het moet in een rustige, weinig verkeer met standaard TL-verlichting.
  2. Bereid het testen tanks voor de dieren.
    De geneste halve gallon testen tanks zijn samengesteld uit twee delen: een binnenste tank die water en kikkervisjes zal houden; en een buitenste tank met de visuele stimulus.
    1. Voor de binnentank, een kleine markering op de buitenhoeken met een sharpie, 5 cm van de bodem; dit is de waterlijn (figuur 1A, groene stippellijn).
    2. Ook voor de binnentank, vul de Divets in de tank (op de hoeken en het midden) met een inerte stof, zoals Sylgard elastomeer. OPMERKING: De kikkervisjes zal blijven hangen in deze gebieden als ze niet ingevuld
    3. Voor de buitentank dekken precies een helft van de buitenkant van een tank met zwarte elektrische tape en de andere helft met de witte tissuepapier Figuur 1B.
  3. Plaats de tanks op hetinenten draaitafel.
  4. Stel de webcam / statief zodat het boven het testen tanks. Stel de camera visualisatie van het testgebied toe, zoals getoond in figuur 1C.
  5. Sluit de webcam aan op een computer met QuickTime Player geïnstalleerd 5. Zet de camera aan. In QuickTime Player, onder File, selecteer 'Nieuw voor filmopname.' Het gedrag test setup zal zichtbaar zijn op de computer meteen.
  6. Draperen een lichtgewicht katoenen doek over de gehele setup om externe stimuli die kikkervisje gedrag van invloed kunnen verminderen, evenals, verminderen gereflecteerd licht op het oppervlak van het water.
  7. Zorg ervoor dat de luminantie onder de doek maatregelen tussen 35-50 cd / m 2.

3. Gedrag Assay

  1. Vul het binnenste testen tank om de 5 cm water merk in stap 1.2.1 met kikker water.
  2. Met behulp van een kleine netto-, beweeg het dier in het binnenste testen tank.
  3. Open QuickTime software op de computer en met behulp van de buitenste tank als een gids, zorg ervoor dat de camera in staat om te visualiseren en registreren de testafdeling.
  4. Schrijf de naam dier, datum en tijd op een stuk papier en opnemen met de camera.
  5. Plaats het proefvat in de buitenste tank met de zwarte kant van de tank naar rechts Figuur 2.
  6. Start het opnemen van de film onmiddellijk na het regelen van de tank en de ingestelde timer gedurende 2 minuten.
  7. Als de timer piept, verwijder de binnenste testtank, draait de buitenste tank 180 ° en plaats het binnenste proef tank in de buitenste tank. Start de timer. Let op: de zwarte kant moet nu aan de andere kant.
  8. Herhaal stap 3.7, acht keer voor een totaal van tien studies. Gebruik figuur 2 als een gids, het controleren van elke proef.
  9. Herhaal het gedrag assay twee verschillende dagen.

4. Netvlies axotomy

  1. Plaats dier in 0,02% tricaïne tot ze niet meer reagereneen staart knijpen met een # 3 tang.
  2. Smelt 1% agarose in 0,1 x MMR en vervolgens toe te voegen aan een 60 mm petrischaal. Eenmaal afgekoeld, een kleine rechthoekige graszode in de agarose en voeg het kikkervisje de graszode met wat 0.02% tricaïne, zodat het dier gedeeltelijk is ondergedompeld in de vloeistof.
  3. Pierce de huid op een hoek van 45 graden achter de dorsale regio van het oog met een 25 G naald, terwijl schoren het dier tegen forceps aan de andere kant.
  4. Het verzorgen van de ader, die naast de oogzenuw ligt niet aan knip, zorgvuldig te bereiken in het gat met # 5 tang, knip de oogzenuw en draai het uit de weg. Als er ernstige bloeden vanwege ongeluk knippen de slagader, dan snel plaats het dier in 2% tricaïne te euthanaseren. LET OP: 2% tricaïne oplossing kan gevoelloosheid veroorzaken bij de mens. Deze oplossing moet worden behandeld met handschoenen.
  5. Om het dier herstellen na operatie, plaatst dier 100 mm petrischaal met 0.7X MMR en 50 ug / ml gentamicine gedurende 20 minuten. Next, overdracht kikkervisje naar vuilwatertank met kikker water. Laat dier rust O / N.
  6. De volgende ochtend, het testen van de visuele functie zoals hierboven beschreven (stappen 3,1-3,9).

5. Analyze Results

  1. Na de proeven worden afgewerkt, het meten van de hoeveelheid tijd die het kikkervisje blijft op de zwarte kant van de tank.
    1. Handmatig bekijk de video's met behulp van software die de tijd weergeeft en maakt veelvuldig pauzeren. Kijk naar de video display tijd. Noteer het begin van de twee min proces, dat is wanneer de binnentank succes genest binnen het buitenste reservoir en vierkante gezien de camera.
    2. Met de positie van de ogen van de kikkervisje te bepalen welke kant van de tank de dieren zwemmen op. Definieer oversteken van een kant van de tank naar de andere wanneer beide ogen zwart / witte lijn hebben overschreden.
  2. Noteer het begin en einde van elk interval (in seconden) dat het dier besteedt aan de zwarte kant. Pauzeren en opnieuwwind de video om nauwkeurigheid te garanderen. Totaal de sec binnen elke proef.
  3. Input deze nummers in de bijgevoegde Gedrag werkblad. Het werkblad zal de ratio van de tijd dat het dier besteed aan de witte kant door het aftrekken van de tijd besteed aan de zwarte kant van de tank van de totale 120 sec proef en delen door de totale tijd in seconden berekenen [(120 - totaal seconden besteed aan de zwarte kant) / 120 sec]. De gemiddelden werkblad deze ratio over alle 10 proeven.
  4. Gebruik een student T-test, gepaarde, tweezijdige verdeling te bepalen of de proeven tussen dagen zijn significant (p ≤ 0,05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eerdere rapporten is gebleken dat premetamorphic Xenopus kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank en noemde deze test, de achtergrondkleur voorkeur Assay 3 We hebben deze test veranderd om de visuele functie van beide ogen van kikkervisjes in te testen minder dan een week. Zo kunnen hun ogen worden verzameld voor histologisch onderzoek.

We zien hier hoe de reactie door visuele signalen. In Film 1, de kikkervisjes in de linker en rechter panelen zijn dezelfde dieren. Aan de linkerkant zijn de dieren voor de operatie en aan de rechterkant, de dieren na het doorsnijden van beide oogzenuwen. We gewerveld het water aan te tonen dat niets toegevoegd aan de dieren afstoten de zwarte kant of hen naar de witte zijde. In de film, bieden we een schema van de kikkervisjes in de onderste hoeken, waarin de stand van de oogzenuw geeft voor elke groep dieren. In Film 1, normaal, un bediende kikkervisjes reageren op de achtergrond kleur in minder dan 30 seconden in de test tank terwijl de blinde kikkervisjes zwemmen doelloos rond de tank. De snelheid van de films werd verhoogd en opgenomen de werkelijke tijd in de rechter bovenhoek.

Om de visie van een oog te testen, hebben we de resultaten van een dier waarvan oogzenuw was doorgesneden in een oog en getest in onze analyse opgenomen. De oogzenuw in het andere oog werd verbroken na twee dagen testen, en de visie-begeleide gedrag getest op de volgende dagen weer. In figuur 3, een grafiek de tijd de kikkervisje kozen zwemmen op de zwarte zijde van de tank. Dit werd gemeten aan zes opeenvolgende dagen Figuur 3A. Zoals hierboven beschreven, werd de juiste oogzenuw verbroken nadat gedrag werd getest op dag 2 en links na gedragstest op dag 4. Het kikkervisje voorkeur de witte zijde van de tank willekeurig 50% van de tijd Figuur 3C. Merk op dat het eeniMAL besteed meer tijd aan de witte kant van de tank gedurende de laatste 6 proeven op dag 1 tot en met 4. De hoeveelheid tijd besteed aan de zwarte kant was zelfs op dag 5 en 6, als het dier was blind aan beide ogen. De resultaten van elk van de twee dagen werden samen gemiddeld en gepresenteerd in een grafiek vorm figuur 3C.

Figuur 1
Figuur 1. Experimentele set-up van de visie geleid gedrag assay. (A) De binnenste testtank transparant blijft en wordt gekenmerkt waterstanden geven (groene stippellijnen op de hoek). (B) De buitenste testtank is bedekt met zwart elektrische tape op de ene helft witte tissuepapier anderzijds. (C) De larven worden gevisualiseerd met behulp van een webcam geplaatst op een statief en aangesloten op een draagbare computer. Het testen tanks rust op een inoculating draaitafel om gemakkelijk te kunnen draaien tussen studies. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voorstelling van hoe de visie-begeleide gedrag test wordt uitgevoerd. De rechthoeken geven de test tank, waaruit blijkt hoe de half wit / half zwart gebied verandert met elke proef. Dit kan worden gebruikt tijdens het gedrag test om het proces nummermarkering. De test tank aan de rechterzijde is een close-up van het kikkervisje en de verwachte gedrag tijdens de twee minuten test. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

hin-page = "altijd"> Figuur 3
Figuur 3. Een representatief experiment natellen het percentage van de tijd het kikkervisje zwom op de witte kant van de test tank. (A) Het bedrag van sec het kikkervisje besteed aan de zwarte kant van de tank wordt gemeten en in een tabel. (B ) De tabel in A wordt omgezet in het percentage van de tijd van de witte kant van de tank. Dit wordt gedaan door het aftrekken van de sec besteed aan de zwarte kant van de totale testtijd (120 sec) en delen door 120 sec. Kikkervisjes die onbehandeld waren (U), had een axotomy (SA) en vervolgens een dubbele axotomy (DA) werden getest. (C) De grafiek geeft het gemiddelde percentage van de tijd doorgebracht in de witte kant (witte balk) en zwarte kant ( zwarte balk). Het wordt gebruikt om de grafiek te maken tabel hieronder.g3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1. Behavioral reactie van slechtziende en blinde dieren in de witte achtergrond voorkeur assay. Kikkervisjes in de linker en rechter panelen zijn hetzelfde, maar degenen aan de rechter hebben dubbele retinale axotomy ondergaan. Een schema in de onderste hoeken geeft aan of de oogzenuw is intact of verbroken (blauwe balk). De timer in de rechterbovenhoek geeft de tijd. De film wordt versneld voor een betere weergave. Eenmaal in het witte gebied, merk op hoe de kikkervisjes zwemmen dicht bij de grens tussen wit en zwart en omgekeerde richting. Klik hier om deze video te bekijken.

<td> 1.00 height: 21px; "> Ratio 6
Day 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6
Trial 1 0 0 0 0 0 0
Trial 2 0 0 0 0 0 0
Trial 3 0 0 0 0 0 0
Trial 4 0 0 0 0 0 0
Trial 5 0 0 0 0 0 </ Td> 0
Trial 6 0 0 0 0 0 0
Trial 7 0 0 0 0 0 0
Trial 8 0 0 0 0 0 0
Trial 9 0 0 0 0 0 0
Trial 10 0 0 0 0 0 0
Ratio van de tijd besteed aan witte zijde
Ratio 1 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Verhouding 2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Ratio 3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Ratio 4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Ratio 5 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Ratio 6 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Ratio 7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Verhouding 8 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
9 Verhouding 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Verhouding 10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Gemiddelde 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6
Trial 1 0 0 0 0 69 69
Trial 2 0 3 0 88 68 58
Trial 3 7 0 28 0 58 47
Trial 4 0 0 11 0 59 72
Trial 5 0 0 7 22 57 57
Trial 6 1 98 4 56 69 53
Trial 7 0 13 33 24 44 57
Trial 8 0 113 38 24 36 64
Trial 9 0 0 4 43 60 57
Trial 10 1 21 0 32 63 80
Ratio van de tijd besteed aan witte zijde >
Ratio 1 100% 100% 100% 100% 43% 43%
Verhouding 2 100% 98% 100% 27% 43% 52%
Ratio 3 94% 100% 77% 100% 52% 61%
Ratio 4 100% 100% 91% 100% 51% 40%
Ratio 5 100% 100% 94% 82% 53% 53%
99% 18% 97% 53% 43% 56%
Ratio 7 100% 89% 73% 80% 63% 53%
Verhouding 8 100% 6% 68% 80% 70% 47%
9 Verhouding 100% 100% 97% 64% 50% 53%
Verhouding 10 99% 83% 100% 73% 48% 33%
Gemiddelde 99% 79% 90% 76% 51% 49%

Werkblad 1. Witte achtergrond voorkeur assay werkblad. Dit werkblad heeft de berekeningen ingebouwd zodat het kan worden gebruikt om getallen en tally resultaten invoeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij rapporteren hier een eenvoudige visie geleide gedrags test die gemakkelijk kan worden uitgevoerd in minder dan een week minimaal geschoold laboratoriumpersoneel. Terwijl andere testen vereisen gespecialiseerde apparatuur en expertise in het gedrag van dieren, deze test kan een snelle test om visuele functie te bepalen. Een andere gedrags assay Visual Avoidance test ontwikkeld om te bepalen hoe de tectum bijdraagt ​​aan visuele waarneming bij Xenopus 10. Deze test meet ruimtelijke afstemming en contrastgevoeligheid in reactie op een bewegende versus stabiel achtergrond en dus kunnen meer gespecialiseerde vision-based gedrag meten dan de eenvoudige test hier gerapporteerde. Een geautomatiseerd systeem gedrag is gemeld dat de hoeveelheid tijd besteed aan een zijde van de tank 8 kan meten. Er is ook commercieel verkrijgbare software (bijv. ALLES-doolhof software) die is gebruikt om de hoeveelheid tijd zebravis brengen in donkere of heldere omgevingen 9 meten. De eenssay melden wij hier niet de aankoop van dit soort dure apparatuur of software nodig, maar in plaats daarvan vertrouwt op alledaagse reagentia en apparatuur voor visuele functie te meten.

De visie-begeleide test wordt uitgevoerd op een dier om zijn visuele functie te testen. Bij vergelijking van de testresultaten gedrag van verscheidene kikkervisjes elkaar observeerden we geen statistisch verschil tussen dieren in behandelingsgroepen. We testten drie kikkervisjes op zes opeenvolgende dagen en getest eens vijf dieren op drie opeenvolgende dagen, lopen tien proeven per dag ook. In beide gevallen vonden we geen statistisch significante veranderingen bij de onbehandelde of enkelvoudige axotomie (p = 0,2067), maar verkregen een statistisch significante verandering bij deze dieren vergeleken met een dubbele axotomie (P = 0.002). Dit werd gemeten met Prism 6.0c software die een 2-weg ANOVA statistische test met Tukey's meervoudige vergelijkingstest (n = 8 kikkervisjes). De maximale hebbenhoeveelheid gegevens punten voor de operatie, raden wij het gebruik van de zesdaagse gedrag assay. Als resultaten moeten sneller worden verkregen met minder degeneratie van het weefsel, raden wij het gebruik van de driedaagse systeem.

Deze test test een dier tegelijk. We voerden modelstudies om te zien of twee kikkervisjes of meer gelijktijdig kon worden gemeten. Om te bepalen of hun voorkeur voor de witte kant van de tank met twee kikkervisjes in een tank getroffen, we elk kikkervisje getest afzonderlijk en dan samen. Aangezien de beelden boven de tank werden genomen, als de kikkervisjes zwommen boven of onder elkaar voor langere tijd, vonden we het moeilijk om ze uit elkaar. Als we gebruik larven van verschillende grootte, waargenomen dat de grotere zou beïnvloeden, wanneer het kleinere zwommen. Toekomstige technologieën kunnen worden ontwikkeld om genetisch merk kikkervisjes, die beter volgen van meerdere dieren van dezelfde grootte zou maken.

Bij het uitvoeren van deze test op tientallen tadpoles zagen we dat sommige kikkervisjes voorkeur de witte kant meer consequent dan anderen. Kikkervisjes, wier gedrag gevarieerd door meer dan 10% op twee opeenvolgende dagen, we nemen werden opnieuw getoetst op de derde dag voor de operatie. Dit kan zijn vanwege een andere opmerking: we hebben gemerkt dat het plaatsen van de dieren op een witte achtergrond ook een verschil in hun voorkeur voor de witte kant van de tank. Hebben van die extra dag kan hebben bijgedragen conditioneren enkele kikkervisjes aan de witte kant van de tank verkiezen. Een beperking van deze test is dat deze test alleen visuele functie. De variabiliteit we waargenomen kan te wijten zijn aan andere defecten in de ontwikkeling, naast verminderde visuele functie of blindheid. Daarom werden dieren die minder dan 60% de voorkeur voor de ingreep bleek niet verder getest.

We testten ook een scala van leeftijden van pre-metamorfe kikkervisjes. Wij vonden dat kikkervisjes jonger dan stadium 45 waren erg klein en hun ogen waren moeilijk op te sporen met behulp van onze weBCAM. Oudere kikkervisjes (stadia 51-55 +) waren meer afgeleid; hoewel ze uiteindelijk meer tijd doorgebracht op de witte kant van de tank, lijken ze langer duren om daar te zwemmen. Deze oudere dieren groter waren en derhalve gemakkelijker te volgen, maar moest testen voorafgaand aan de operatie zoals hierboven vermeld. In tegenstelling tot de meeste kikkervisjes in stadium 45 tot 50 gedragen zoals verwacht en dieren deze tijden beste zou zijn om in toekomstige studies.

Circadiane licht verandert is aangetoond dat-visie geleide gedragsreacties invloed in Xenopus 2. Consistent met deze waarneming, merkten we dat hetzelfde dier dat snel zwom naar de witte kant van de test tank in onderzoeken uitgevoerd in de ochtend, duurde veel langer tijdens de middaghandel gedragstesten. Na het uitvoeren van een aantal 'hetzelfde dier / andere tijd' proeven, hebben we de beste tijd voor het gedrag test was 6:00-13:00.

We hebben ook een digitale Handheld camcorder verbonden door firewire dieren te testen onder omstandigheden met weinig licht 5. Dit maakte het testen van nachtelijk of scotopic zicht, waarbij het dier gebruikt zijn staaf fotoreceptoren te bekijken. Voorwaarden zijn veranderd door gewoon het vinden van de minste hoeveelheid licht die nodig is voor het dier om de visie-begeleide test uit te voeren. De hier gepresenteerde analyse test fotopisch zien, waarin het dier gebruikt meestal zijn kegel fotoreceptoren te zien. Door het combineren van deze benaderingen, beide soorten van visie, scotopic en fotopisch, kan worden getest.

We gebruikten deze test om de visuele functie van de dieren te testen met een buitenbaarmoederlijke oog gekweekt uit pluripotente cellen overexpressie het intrinsiek uitgedrukt veld transcriptie oog factoren en de extrinsieke factor, Noggin. Ogen gegenereerd uit deze weefsels waren functioneel 4,11. Hersenpan speelt ook een rol in anterieure centrale zenuwstelsel ontwikkeling 12, maar met behulp van deze visie-begeleide test in combinatie met het dier dop transplant assay, zijn rol in de ontwikkeling van de ogen werd blootgelegd. Andere extrinsieke factoren die vroege vorming embryo beïnvloeden, maar zijn nog niet aangetoond dat een rol in de ontwikkeling van het oog kan het netvlies voorlopercellen formatie geïnduceerde pluripotente in dierlijke cellen cap 4,11. Met behulp van deze gedrags-test, zouden toekomstige studies de visuele functie van deze nieuw gegenereerde ogen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), en EY019517 (ASV). Dit werk werd ondersteund door het onderzoek ter voorkoming van Blindheid onbeperkte subsidie ​​aan de Oogheelkunde afdeling en de Leeuwen van Central New York. We willen ook graag onze dierlijke technicus, Matthew Mellini, bedanken voor zijn uitstekende verzorging van de dieren en voor de intensivering in de hoofdrol in deze video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/2 Gallon Flex-Tank with Cover eNasco SB19271M Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Black electrical tape
White tissue paper
Large inoculating turntable VWR 50809-022 Size: Dia 114.3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpad VWR 82004-836 Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
Kimwipe Krackeler Scientific, Inc. 1945-34155-CS
Standard tripod Various
iSight camera or webcam Apple M8817LL/A Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see
Portable computer Apple/PC Various We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV handycam camcorder SONY DCR-HC42 Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 
Handycam station SONY DCRA-C121 This can be used for connecting firewire to camera
QuickTime Player software Quicktime Version 10.1
26 G Needle (5/8" length) VWR BD305115
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Disposables
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific 17-528Z Stored at RT
Sylgard 184 silicone elastomer Fisher Scientific NC9644388
Instant ocean Doctors Foster and Smith CD-116528 Stock solution = 100 g/L stored at RT
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S0876 Stock solution = 0.4 M stored at RT
In vitro fertilized embryos eNasco LM00490MX 100 embryos/unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

Tags

Neurowetenschappen oog retina visie kleur voorkeur, Gedrag licht begeleiding visuele test
Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. AMore

Viczian, A. S., Zuber, M. E. A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (88), e51726, doi:10.3791/51726 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter