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Neuroscience

परीक्षण दृश्य समारोह में के लिए एक सरल व्यवहार परख Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51726

Summary

Xenopus tadpoles एक काला / सफेद टैंक की सफेद ओर स्विमिंग पसंद करते laevis. यह व्यवहार उनके दर्शन द्वारा निर्देशित है. इस व्यवहार के आधार पर हमने tadpoles के दृश्य समारोह का परीक्षण करने के लिए एक सरल परख उपस्थित थे.

Abstract

मेंढक की tadpoles में दृश्य समारोह के मापन, Xenopus laevis, जीवित पशुओं में अंधापन के लिए स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. optokinetic प्रतिक्रिया परीक्षण सभी रीढ़ में देखा गया है कि एक दृष्टि आधारित, कर्मकर्त्ता व्यवहार है. इसलिए पूंछ फ्लिप प्रतिक्रिया सूक्ष्म प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रशिक्षित तकनीशियन की आवश्यकता है जो वैकल्पिक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था टैडपोल आंखों छोटे हैं. हम tadpoles काले और सफेद दोनों पक्षों के साथ एक टैंक में रखा गया जब एक टैंक की सफेद ओर तैरना पसंद करते हैं कि इस तथ्य पर आधारित एक वैकल्पिक व्यवहार परख विकसित की है. यहाँ प्रस्तुत परख आसानी से मापा जाता है कि एक प्रतिक्रिया पैदा करता है कि एक सस्ता, सरल विकल्प है. सेटअप सबसे Xenopus प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध एक तिपाई, वेब कैमरा और नेस्टेड परीक्षण टैंक, के होते हैं. इस लेख से पहले और ऑप्टिक तंत्रिका विच्छेद के बाद, tadpoles के व्यवहार दिखा एक फिल्म भी शामिल है. एक आंख के समारोह का परीक्षण करने के लिए, हम भी प्रतिनिधि शामिलहर आंख लगातार दिन पर रेटिना axotomy लिया जिसमें एक मेढक का सरीखे परिणाम. भविष्य के अध्ययन के लिए एक बार में कई tadpoles की दृष्टि परीक्षण के लिए इस परख के लिए एक स्वचालित संस्करण विकसित कर सकता है.

Introduction

Xenopus laevis आंख गठन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है. आंखों दृश्य विकास और समारोह पर एक प्रभाव है कि परीक्षण के जीन या रास्ते के लिए कम से कम एक सप्ताह में परिपक्वता के लिए बढ़ रहा है, जल्दी से विकसित करना. दृश्य समारोह का परीक्षण करने के लिए, optokinetic और optomotor प्रतिक्रिया क्रमश: 1,2, zebrafish और Xenopus tadpoles में इस्तेमाल किया गया है. Xenopus tadpoles की आंखों zebrafish से अपेक्षाकृत छोटे होते हैं, इस परख Xenopus में सूक्ष्म पूंछ फ्लिप और आँख आंदोलन व्यवहार का पता लगाने के लिए विशेष उपकरणों का उपयोग करें और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है. Xenopus में एक और अधिक मजबूत व्यवहार के साथ साथ 3 में वर्णित है जो एक सफेद पृष्ठभूमि के साथ एक टैंक में तैर के लिए पसंद है. एक आधा काला / आधे सफेद टैंक में एक मेढक रखने, पूर्व रूपांतरित टैडपोल जल्दी टैंक की सफेद पक्ष को तैरती है. हम पहले से pluripotent सेल व्युत्पन्न निर्धारित करने के लिए इस परख इस्तेमाल कियाआँखों 4 कार्यात्मक थे. यहाँ, हम premetamorphic Xenopus tadpoles के दृश्य समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो इस परख की एक विस्तृत संस्करण, रिपोर्ट.

यह केवल सबसे Xenopus प्रयोगशालाओं में पाया एक घुड़सवार डिजिटल camcorder, डिजिटल कैमरा सॉफ्टवेयर और मानक उपकरणों की आवश्यकता है क्योंकि यह परख, optomotor प्रतिक्रिया परख की तुलना में आसान है. इसके अलावा, दर्ज की प्रतिक्रिया मिलान परिणामों के लिए किसी विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है. हमारे प्रतिनिधि परिणाम डबल रेटिना axotomy आया होने tadpoles के एक ही समूह, टैंक के आसपास बेतरतीब ढंग से तैरना बताते हैं कि. हम भी एक आंख दृश्य प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया जा सकता है कि कैसे दिखा, एक प्रतिनिधि मेढक से व्यवहार परख परिणामों को शामिल किया है. परख के दौरान अर्जित संख्या डाला और विश्लेषण किया जा सकता है, ताकि एक वर्कशीट शामिल किया गया है. यह वर्कशीट परीक्षण किया tadpoles एक दृश्य प्रतिक्रिया है कि यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

पशु की देखभाल

Xenopus इस अध्ययन में इस्तेमाल tadpoles प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए Upstate चिकित्सा विश्वविद्यालय IACUC और गाइड द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार, बड़े हो उठाया और इलाज किया गया laevis.

1. पूर्व व्यवहार सेटअप: टैडपोल

  1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोत से निषेचित Xenopus भ्रूण या प्राप्त पहले 6 वर्णित के रूप में इन विट्रो में, oocytes खाद.
  2. 20 मिमी KCl, 20 मिमी 2 CaCl, 50 मिमी HEPES 0.1X एमएमआर [10 एक्स मार्क संशोधित घंटी (एमएमआर) समाधान शेयर (10 मिमी 2 MgCl युक्त 60 मिमी पेट्री डिश में 18 ˚ सी में तंत्रिका प्लेट चरण भ्रूण को ब्लासटुला रखें; 1 एम NaCl, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin एंटीबायोटिक के साथ]), 7.5 पीएच को समायोजित autoclaved और आरटी पर संग्रहीत. प्रत्येक दिन 0.1X एमएमआर बदलें और किसी भी मृत भ्रूण को हटा दें.
  3. भ्रूण ~ 27 Nieuwkoop और फैबर चरण तक पहुँचते - 30, 7 वीं स्विचएंटीबायोटिक के बिना 0.1X एमएमआर में ई भ्रूण पेट बैक्टीरियल वृद्धि की अनुमति है.
  4. वे खिला चरण (चरण 45) जब तक tadpoles बढ़ो और 0.1X MMR से भरा 100 मिमी पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरित. मध्यवर्ती दिन को 0.1X एमएमआर बदल रहा है, एक सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन उन्हें बिछुआ पाउडर सतह पर तैरनेवाला फ़ीड.
  5. 100 मिमी पेट्री डिश में एक सप्ताह के बाद, मेंढक पानी से भरा आधा गैलन टैंक को जानवरों हटो [0.5 ग्राम / एल तत्काल महासागर और 2 मिमी सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय (ना 2 4 HPO: 141.96 मेगावाट) पीएच 6.8]. 2.4 चरण में के रूप में उन्हें फ़ीड, लेकिन पानी बादल है जब पानी प्रति सप्ताह केवल 2-3 बार बदलते हैं. रोशनी 6 बजे पर मोड़ के साथ एक 12 घंटा light/12 अंधेरे प्रकाश चक्र में पशुओं को बनाए रखने.
  6. एक प्रयोगशाला बेंच Underpad, कम से कम 12 घंटा ओ / एन, पहले परीक्षण के लिए की तरह एक सफेद सतह पर परीक्षण विषयों के साथ आधा गैलन टैंक जगह.
  7. चरणों में 45 से 50 टेस्ट tadpoles के रूप में नीचे चरण 3 में वर्णित है.

2. पूर्व व्यवहार सेटअप: Equipmenटी

  1. व्यवहार परख के लिए प्रयोगशाला के एक क्षेत्र को अलग निर्धारित करें. यह मानक फ्लोरोसेंट प्रकाश व्यवस्था के साथ एक शांत, कम यातायात के क्षेत्र में होना चाहिए.
  2. जानवरों के लिए परीक्षण टैंक तैयार करें.
    नेस्ट, आधा गैलन परीक्षण टैंक दो भागों से बना रहे हैं: पानी और tadpoles का आयोजन करेगा कि एक आंतरिक टैंक; और दृश्य उत्तेजना के साथ एक बाहरी टैंक.
    1. भीतरी टैंक के लिए, एक Sharpie, नीचे से 5 सेमी के साथ बाहर कोने पर एक छोटा सा निशान बना; इस पानी की लाइन (चित्रा 1 ए, हरी बिंदीदार रेखा) है.
    2. इसके अलावा, भीतरी टैंक के लिए, Sylgard इलास्टोमेर तरह निष्क्रिय एक यौगिक, साथ (कोनों और केंद्र में) टैंक में divets भरें. नोट: वे अंदर कोई टिप्पणी नहीं कर रहे हैं अगर tadpoles इन क्षेत्रों में घूमती रहेंगी
    3. बाहरी टैंक के लिए, सफेद टिशू पेपर चित्रा 1 बी के साथ काले बिजली के टेप और अन्य आधे के साथ एक टैंक के बाहर से ठीक एक आधा कवर.
  3. पर टैंक जगहturntable inoculating.
  4. सेटअप वेब कैमरा / तिपाई यह परीक्षण टैंक ऊपर है कि इतनी. चित्रा 1C में दिखाया गया है, परीक्षण क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देने के लिए कैमरे को समायोजित.
  5. 5 स्थापित QuickTime प्लेयर सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर के लिए वेब कैमरा से कनेक्ट करें. कैमरा चालू करें. QuickTime Player, फ़ाइल के तहत, 'नई मूवी रिकॉर्डिंग.' का चयन व्यवहार परख सेटअप सही दूर कंप्यूटर पर देखा जा सकेगा.
  6. मेढक का व्यवहार प्रभावित हो सकता है कि बाह्य संकेत को कम करने, और साथ ही, पानी की सतह पर परिलक्षित प्रकाश को कम करने के लिए पूरे सेटअप पर एक हल्के सूती कपड़े कपड़ा.
  7. सुनिश्चित करें कि 35-50 सीडी / एम 2 के बीच कपड़ा उपायों के तहत luminance.

3. व्यवहार परख

  1. मेंढक पानी के साथ कदम 1.2.1 में की गई 5 सेमी पानी चिह्नित करने के लिए आंतरिक परीक्षण के टैंक को भरने.
  2. एक छोटे से शुद्ध का उपयोग करना, धीरे आंतरिक परीक्षण के टैंक में पशु चाल है.
  3. ओपन क्यूकंप्यूटर और, एक गाइड के रूप में बाहरी टैंक का उपयोग करने पर uickTime सॉफ्टवेयर, कैमरा परीक्षण क्षेत्र के लिए कल्पना और रिकॉर्ड करने में सक्षम है बनाना.
  4. कैमरे के साथ कागज और रिकॉर्ड के एक टुकड़े पर जानवर के नाम, तारीख और समय लिखें.
  5. सही चित्रा 2 के लिए टैंक के काले पक्ष के साथ बाहरी टैंक में परीक्षण टैंक जगह.
  6. टंकी की व्यवस्था के बाद तुरंत फिल्म शुरू रिकॉर्डिंग और 2 मिनट के लिए टाइमर सेट.
  7. टाइमर beeps, आंतरिक परीक्षण टैंक निकालते हैं, तो बाहरी टैंक 180 डिग्री बारी बारी से और बाहरी टैंक के अंदर आंतरिक परीक्षण टैंक जगह है. टाइमर प्रारंभ करें. नोट: काला पक्ष अब दूसरे पक्ष पर होना चाहिए.
  8. दस परीक्षणों की कुल के लिए कदम 3.7, आठ से अधिक बार दोहराएँ. प्रत्येक परीक्षण के बंद की जाँच, एक गाइड के रूप में चित्रा 2 का प्रयोग करें.
  9. दो अलग दिनों पर व्यवहार परख दोहराएँ.

4. रेटिना axotomy

  1. वे अनुत्तरदायी हैं जब तक 0.02% tricaine में पशु रखेंएक # 3 संदंश के साथ एक पूंछ चुटकी करने के लिए.
  2. 0.1X एमएमआर में 1% agarose पिघल और फिर एक 60 मिमी पेट्री डिश में जोड़ें. पशु आंशिक रूप से तरल में डूब जाता है ताकि एक बार ठंडा, agarose में एक छोटे आयताकार divot बनाने के लिए और एक छोटे से 0.02% tricaine साथ divot को टैडपोल जोड़ें.
  3. पियर्स एक 25 जी सुई के साथ आंख की पृष्ठीय क्षेत्र के पीछे एक 45 डिग्री के कोण पर त्वचा, विपरीत दिशा में संदंश के खिलाफ पशु ताल्लुक़ है.
  4. ऑप्टिक तंत्रिका के बगल में स्थित है जो नस, कटाव को नहीं ख्याल रख रही है, ध्यान से, # 5 संदंश के साथ छेद में पहुँच ऑप्टिक तंत्रिका कटाव और जिस तरह से बाहर फ्लिप. गंभीर रक्तस्राव के कारण गलती से धमनी snipping के लिए है, तो जल्दी से euthanize को 2% tricaine में जानवरों की जगह. चेतावनी: 2% tricaine समाधान मानव में सुन्नता पैदा कर सकता है. यह समाधान दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए.
  5. जानवर को ठीक करने के लिए सर्जरी के बाद, 0.7x एमएमआर के साथ 100 मिमी पेट्री डिश है और 20 मिनट के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin में जानवरों की जगह. NeXT, मेंढक पानी के साथ वसूली टैंक को हस्तांतरण टैडपोल. पशु बाकी हे / एन दो.
  6. अगली सुबह, (3.1-3.9 कदम) के रूप में ऊपर वर्णित दृश्य समारोह का परीक्षण.

5. परिणाम विश्लेषण

  1. परीक्षण खत्म हो रहे हैं, मेढक टैंक के काले पक्ष पर रहता है समय की मात्रा को मापने.
    1. मैन्युअल समय प्रदर्शित करता है और अक्सर रोक देता है कि सॉफ्टवेयर का उपयोग वीडियो देखने. वीडियो डिस्प्ले समय को देखो. भीतरी टैंक सफलतापूर्वक बाहरी टैंक के अंदर घोंसले और कैमरे की निगाह में चुकता है जो है, जब दो मिनट परीक्षण की शुरुआत लिखो.
    2. जानवरों पर तैर रहे हैं टैंक के पक्ष में परिभाषित करने के लिए मेढक की आंखों की स्थिति का प्रयोग करें. दोनों आँखों काला / सफेद लाइन पार कर दी है केवल जब अन्य के लिए टैंक के एक तरफ से पार परिभाषित करें.
  2. पशु काले पक्ष पर खर्च करता है कि (एसईसी) में प्रत्येक अंतराल की शुरुआत और अंत लिखो. रोकें और फिर सेसटीकता सुनिश्चित करने के लिए वीडियो हवा. प्रत्येक परीक्षण के भीतर सेकंड का कुल.
  3. संलग्न व्यवहार वर्कशीट में निवेश इन नंबरों. वर्कशीट पशु सेकंड में कुल समय से कुल 120 सेकंड परीक्षण और विभाजन से टैंक के काले पक्ष पर बिताए समय को घटाकर की सफेद पक्ष पर बिताए समय का अनुपात की गणना करेगा [(120 - कुल सेकंड पर खर्च काले पक्ष) / 120 सेकंड]. सभी 10 परीक्षणों से अधिक कार्यपत्रक मूविंग इस अनुपात.
  4. दिन के बीच परीक्षण (0.05 ≤ पी) महत्वपूर्ण हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए एक छात्र की टी परीक्षण, बनती, दो पूंछ वितरण का प्रयोग करें.

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Representative Results

पिछली रिपोर्टों से इस परख, हम tadpoles की आंख में या तो के दृश्य समारोह का परीक्षण करने के क्रम में इस परख बदल दिया है पृष्ठभूमि रंग पसंद परख 3 premetamorphic Xenopus tadpoles एक काला / सफेद टैंक की सफेद ओर तैरना पसंद करते हैं कि दिखाया गया है और कहा जाता है एक सप्ताह से भी कम. इस तरह, उनकी आँखों ऊतकीय परीक्षा के लिए एकत्र किया जा सकता है.

हम प्रतिक्रिया दृश्य cues की वजह से है कि कैसे यहां दिखा. मूवी 1 में, बाएँ और दाएँ पैनल में tadpoles वही जानवर हैं. बाईं तरफ सर्जरी से पहले और सही पर जानवरों, दोनों ऑप्टिक नसों विच्छेद के बाद जानवर हैं. हम कुछ भी नहीं काले पक्ष से जानवरों को पीछे हटाना या सफेद ओर करने के लिए उन्हें आकर्षित करने के लिए जोड़ दिया जाता है कि दिखाने के लिए पानी swirled. फिल्म में, हम जानवरों के प्रत्येक सेट के लिए ऑप्टिक तंत्रिका के राज्य से पता चलता है जो नीचे कोने में tadpoles के एक योजनाबद्ध, प्रदान करते हैं. मूवी 1, सामान्य, यू मेंअंधा tadpoles टैंक के चारों ओर aimlessly तैर जबकि एन संचालित tadpoles परीक्षण टैंक में कम से कम 30 सेकंड में पृष्ठभूमि रंग का जवाब. फिल्मों की गति ऊपरी दाहिने कोने में वृद्धि हुई है और वास्तविक समय दर्ज किया गया था.

एक आंख की दृष्टि परीक्षण करने के लिए, हम जिसका ऑप्टिक तंत्रिका एक आंख में कटे और हमारे परख में परीक्षण किया गया था एक जानवर से परिणामों को शामिल किया है. दूसरी आँख में ऑप्टिक तंत्रिका परीक्षण के दो दिन बाद कटे, और दृष्टि निर्देशित व्यवहार फिर बाद के दिनों पर परीक्षण किया गया था. चित्रा 3 में, एक ग्राफ टैडपोल टैंक के काले पक्ष पर तैरने के लिए चुना है समय की राशि से पता चलता है. यह लगातार छह दिनों चित्रा 3A पर मापा गया था. जैसा कि ऊपर वर्णित व्यवहार दिन 2 और बाईं तरफ परीक्षण किया गया था, के बाद सही ऑप्टिक तंत्रिका 4 दिन पर व्यवहार का परीक्षण करने के बाद, कटे किया गया था. मेढक का समय चित्रा -3 सी के 50% पर बेतरतीब ढंग से टैंक की सफेद पक्ष को प्राथमिकता दी. सूचना है कि एकimal 1 से 4 दिनों पर पिछले 6 ट्रायल के दौरान टैंक की सफेद पक्ष पर अधिक समय बिताया. काले पक्ष पर खर्च समय की राशि पशु दोनों आंखों में अंधा था जब दिन 5 और 6, पर और भी अधिक था. दो दिनों में से प्रत्येक से परिणाम एक साथ औसत और एक ग्राफ के रूप चित्रा -3 सी में प्रस्तुत किए गए.

चित्रा 1
चित्रा 1. दृष्टि निर्देशित व्यवहार परख का सेट अप प्रायोगिक. (ए) आंतरिक परीक्षण टैंक पारदर्शी रहता है और (हरे कोने में लाइनों धराशायी) पानी का स्तर इंगित करने के लिए चिह्नित किया गया है. (बी) के बाहरी परीक्षण टैंक काले रंग में कवर किया जाता है एक दूसरे पर आधा और सफेद टिशू पेपर पर बिजली के टेप. (सी) tadpoles एक तिपाई पर रखा और एक पोर्टेबल कंप्यूटर से जुड़ा एक वेब कैमरा का उपयोग करते हुए कल्पना कर रहे हैं. परीक्षण टैंकपरीक्षणों के बीच आसान बदल के लिए अनुमति देने के लिए एक inoculating turntable पर है बाकी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. दृष्टि निर्देशित व्यवहार परख प्रदर्शन किया है कैसे योजनाबद्ध. आयतों प्रत्येक परीक्षण के साथ कैसे आधा सफेद / आधा काला क्षेत्र में परिवर्तन दिखा, परीक्षण टैंक का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस परीक्षण संख्या चिह्नित करने के लिए व्यवहार परख के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है. सही पर परीक्षण टैंक दो मिनट परख के दौरान मेढक और अपने व्यवहार की उम्मीद की एक बंद हुआ है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

हिन पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 3
चित्रा 3. एक प्रतिनिधि प्रयोग परीक्षण टैंक की सफेद ओर टैडपोल तैरा समय का प्रतिशत tallying. (ए) सेकंड की राशि की टंकी के काले पक्ष पर खर्च मेढक एक तालिका में मापा और रख दिया गया है. (बी ) एक में तालिका टैंक की सफेद पक्ष की बिताए समय का प्रतिशत में बदल जाती है. इस कुल परीक्षण समय (120 सेकंड) से काले पक्ष पर खर्च सेकंड घटाकर और 120 सेकंड से विभाजित करके किया जाता है. (यू) अनुपचारित थे कि टैडपोल, एक एकल axotomy (एसए) था और फिर एक डबल axotomy (डीए) का परीक्षण किया गया. (सी) ग्राफ (सफेद पक्ष (सफेद पट्टी) और काले पक्ष में बिताए समय का औसत प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है काली पट्टी). ग्राफ बनाने के लिए इस्तेमाल मेज के नीचे दिखाया गया है.g3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 1. छोड़ दिया और सही पैनल में सफेद पृष्ठभूमि वरीयता परख. टैडपोल में देखे और अंधा जानवरों के व्यवहार प्रतिक्रिया वही कर रहे हैं, लेकिन सही पर लोगों को डबल रेटिना axotomy आया है. नीचे कोने में एक योजनाबद्ध ऑप्टिक तंत्रिका बरकरार या कटे (नीली पट्टी) है कि क्या इंगित करता है. ऊपरी दाएँ हाथ के कोने में टाइमर समय इंगित करता है. फिल्म आसान देखने के लिए ऊपर निकल जाता है. एक बार सफेद क्षेत्र में, tadpoles करीब सफेद और काले रंग और विपरीत दिशा के बीच सीमा को तैरना नोटिस कैसे. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीडी> 1.00 ऊँचाई: 21px; "> अनुपात 6
दाY 1 दिन 2 3 दिन 4 दिन 5 दिन दिन 6
ट्रायल 1 0 0 0 0 0 0
2 ट्रायल 0 0 0 0 0 0
3 ट्रायल 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 4 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 5 0 0 0 0 0 </ P> 0
ट्रायल 6 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 7 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 8 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 9 0 0 0 0 0 0
ट्रायल 10 0 0 0 0 0 0
समय का अनुपात सफेद पक्ष पर खर्च
अनुपात 1 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
5 अनुपात 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 6 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 7 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 8 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 9 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
अनुपात 10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
औसत 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
दिन 1 दिन 2 3 दिन 4 दिन 5 दिन दिन 6
ट्रायल 1 0 0 0 0 69 69
2 ट्रायल 0 3 0 88 68 58
3 ट्रायल 7 0 28 0 58 47
ट्रायल 4 0 0 11 0 59 72
ट्रायल 5 0 0 7 22 57 57
ट्रायल 6 1 98 4 56 69 53
ट्रायल 7 0 13 33 24 44 57
ट्रायल 8 0 113 38 24 36 64
ट्रायल 9 0 0 4 43 60 57
ट्रायल 10 1 21 0 32 63 80
समय का अनुपात सफेद पक्ष पर खर्च >
अनुपात 1 100% 100% 100% 100% 43% 43%
अनुपात 2 100% 98% 100% 27% 43% 52%
अनुपात 3 94% 100% 77% 100% 52% 61%
अनुपात 4 100% 100% 91% 100% 51% 40%
5 अनुपात 100% 100% 94% 82% 53% 53%
99% 18% 97% 53% 43% 56%
अनुपात 7 100% 89% 73% 80% 63% 53%
अनुपात 8 100% 6% 68% 80% 70% 47%
अनुपात 9 100% 100% 97% 64% 50% 53%
अनुपात 10 99% 83% 100% 73% 48% 33%
औसत 99% 79% 90% 76% 51% 49%

वर्कशीट 1. सफेद पृष्ठभूमि वरीयता परख वर्कशीट. यह वर्कशीट यह संख्या और मिलान के परिणाम दर्ज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इतने में बनाया गणना है.

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Discussion

हम यहाँ आसानी न्यूनतम प्रशिक्षित प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा एक सप्ताह के अंतर्गत में प्रदर्शन किया जा सकता है कि एक साधारण दृष्टि निर्देशित व्यवहार परख रिपोर्ट. अन्य assays पशुओं के व्यवहार में विशेष उपकरणों और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, इस परख एक त्वरित परीक्षण दृश्य समारोह का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. एक और व्यवहार परख, दृश्य परिहार परख, tectum Xenopus 10 में दृश्य धारणा के लिए योगदान कैसे निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है. एक स्थिर पृष्ठभूमि बनाम चलती है, और इस प्रकार, सरल परख की तुलना में अधिक विशिष्ट दृष्टि आधारित व्यवहार उपाय कर सकते हैं के जवाब में यह परख उपायों स्थानिक ट्यूनिंग और विपरीत संवेदनशीलता यहाँ की सूचना दी. एक स्वचालित व्यवहार प्रणाली टैंक 8 के एक तरफ खर्च समय की मात्रा उपाय कर सकते हैं कि सूचित किया गया है. काले या चमकीले वातावरण 9 में खर्च समय zebrafish की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (जैसे किसी भूलभुलैया सॉफ्टवेयर) भी है. एकssay हम महंगे उपकरण या सॉफ्टवेयर के इन प्रकार की खरीद की आवश्यकता नहीं है यहाँ रिपोर्ट, लेकिन बजाय दृश्य समारोह को मापने के लिए हर रोज अभिकर्मकों और उपकरणों पर निर्भर करता है.

दृष्टि निर्देशित परख अपने दृश्य समारोह का परीक्षण करने के लिए एक जानवर पर किया जाता है. एक दूसरे को कई tadpoles के व्यवहार परख परिणामों की तुलना करते हैं, तो हम उपचार समूहों के भीतर पशुओं के बीच कोई अंतर सांख्यिकीय मनाया. हम लगातार छह दिनों पर तीन tadpoles का परीक्षण किया है और यह भी प्रति दिन दस परीक्षण चल रहा है, लगातार तीन दिनों पर एक और पांच पशुओं का परीक्षण किया. या तो मामले में, हम अनुपचारित या एकल axotomy समूहों के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिवर्तन (पी = 0.2067) पाया है, फिर भी इन जानवरों डबल axotomy समूह (पी = 0.002) की तुलना में थे जब एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिवर्तन प्राप्त की. यह एक Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण (एन = 8 tadpoles) के साथ एक 2 तरह से एनोवा सांख्यिकीय परीक्षण चल चश्मे 6.0c सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया था. अधिक से अधिक है करने के लिएडेटा बिंदुओं की राशि सर्जरी से पहले, हम छह दिन के व्यवहार परख का उपयोग कर सुझाव देते हैं. परिणाम ऊतक की कम अध: पतन के साथ जल्दी प्राप्त करने की आवश्यकता है, तो हम तीन दिवसीय प्रणाली का उपयोग कर सुझाव देते हैं.

यह परख एक समय में एक पशु परीक्षणों. हम दो tadpoles या अधिक एक साथ मापा जा सकता है देखने के लिए पायलट अध्ययन का प्रदर्शन किया. एक टैंक में दो tadpoles होने टैंक की सफेद पक्ष के लिए उनकी पसंद को प्रभावित किया, तो यह निर्धारित करने के लिए, हम एक साथ अलग अलग और फिर एक मेढक का परीक्षण किया गया. छवियों टैंक से ऊपर ले जाया गया बाद से tadpoles समय के किसी भी लम्बाई के लिए एक दूसरे के ऊपर या नीचे तैरा, तो हम यह मुश्किल उन्हें अलग बता पाया. हम विभिन्न आकारों की tadpoles प्रयोग किया जाता है, तो हम बड़े से एक है, जहां छोटे से एक तैरा को प्रभावित करती है कि मनाया. भविष्य प्रौद्योगिकियों में एक ही आकार के कई पशुओं की बेहतर ट्रैकिंग की अनुमति होगी जो आनुवांशिक रूप से निशान tadpoles, को विकसित किया जा सकता है.

Tadpo के दर्जनों पर इस परख प्रदर्शन मेंलेस, हम कुछ tadpoles अधिक लगातार दूसरों की तुलना में सफेद ओर वरीय कि मनाया. जिसका व्यवहार लगातार दो दिनों में अधिक से अधिक 10% द्वारा विभिन्न टैडपोल, हम ले सर्जरी से पहले एक तीसरे दिन फिर से परीक्षण किया गया होगा. इस वजह से एक और अवलोकन के लिए किया गया हो सकता है: हम एक सफेद पृष्ठभूमि पर पशुओं को रखने में भी टैंक की सफेद पक्ष के लिए उनकी वरीयता में एक फर्क पड़ा देखा. कि अतिरिक्त दिन होने टैंक की सफेद पक्ष को पसंद करते हैं कुछ tadpoles हालत में मदद कर सकते हैं. इस परख की एक सीमा है कि यह केवल दृश्य समारोह परीक्षण है. हम मनाया परिवर्तनशीलता कम दृश्य समारोह या अंधापन के अलावा अन्य विकास संबंधी दोषों के कारण हो सकता है. इस कारण से, सर्जरी से पहले कम से कम 60% वरीयता पता चला है कि जानवरों को आगे परीक्षण नहीं किया गया.

हम भी पूर्व रूपांतरित tadpoles की उम्र की एक श्रृंखला का परीक्षण किया. हम चरण 45 की तुलना में छोटी tadpoles बहुत छोटे थे और उनकी आंखों हमारे हम प्रयोग को ट्रैक करने के लिए मुश्किल थेbcam. वृध्द tadpoles (51 चरणों - 55 +) अधिक विचलित थे; वे अंततः टैंक की सफेद पक्ष पर अधिक समय बिताया है, वे वहाँ तैरने के लिए लंबे समय तक लेने लगते हैं. इन बड़े जानवरों बड़ा थे, और इसलिए, आसान ट्रैक करने के लिए, लेकिन जैसा कि ऊपर कहा सर्जरी से पहले परीक्षण की जरूरत. उम्मीद और इन उम्र के जानवरों के भविष्य के अध्ययनों में उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा होगा के रूप में इसके विपरीत, 50 को चरण 45 में tadpoles के बहुमत व्यवहार किया.

Circadian प्रकाश परिवर्तन Xenopus 2 में दृष्टि निर्देशित व्यवहार प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है. इस अवलोकन के अनुरूप, हम जल्दी सुबह में किए गए परीक्षणों में परीक्षण टैंक की सफेद पक्ष को तैरा कि एक ही पशु, दोपहर व्यवहार परीक्षण के दौरान ज्यादा समय लगा देखा. 'एक ही पशु / अलग समय' परीक्षणों के एक नंबर का आयोजन करने के बाद, हम 6:00-1:00 था व्यवहार परख के लिए सबसे अच्छा समय निर्धारित किया.

हम यह भी एक डिजिटल handh का इस्तेमाल किया हैवृद्धावस्था Camcorder कम रोशनी की स्थिति 5 के तहत जानवरों के परीक्षण करने के लिए FireWire के द्वारा जुड़ा हुआ है. रात या Scotopic दृष्टि से यह अनुमति दी परीक्षण, जिसमें पशु को देखने के लिए अपनी छड़ी photoreceptors का उपयोग करता है. स्थितियां बस दृष्टि निर्देशित परख प्रदर्शन करने के लिए पशु के लिए प्रकाश की आवश्यकता कम से कम राशि खोजने के द्वारा बदल दिया गया. यहाँ प्रस्तुत परख photopic दृष्टि से परीक्षण, पशु ज्यादातर देखने के लिए अपनी कोन फोटोरिसेप्टर का उपयोग करता है जिसमें. इन तरीकों के संयोजन से, दृष्टि, Scotopic और photopic के दोनों प्रकार के परीक्षण किया जा सकता है.

हम आंतरिक रूप से व्यक्त की आंख क्षेत्र प्रतिलेखन कारक और बाह्य कारक, नोगिन overexpressing pluripotent कोशिकाओं से हो गई एक अस्थानिक आँख के साथ पशुओं के दृश्य समारोह का परीक्षण करने के लिए इस परख इस्तेमाल किया. इन ऊतकों से उत्पन्न आंखें 4,11 कार्यात्मक थे. नोगिन भी पूर्वकाल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के 12 में एक भूमिका निभाता है, लेकिन पशु टोपी tr के साथ संयोजन के रूप में इस दृष्टि निर्देशित परख का उपयोगansplant परख, आंख के विकास में अपनी भूमिका का पर्दाफाश किया गया था. जल्दी भ्रूण गठन को प्रभावित लेकिन है कि अन्य बाह्य कारकों अभी तक आंख के विकास में एक भूमिका pluripotent जानवर टोपी कोशिकाओं 4,11 में रेटिना पूर्वज गठन प्रेरित हो सकता है नहीं दिखाया गया है. इस व्यवहार परख का उपयोग करना, भविष्य के अध्ययनों से इन नव सृजित आंखों के दृश्य समारोह का निर्धारण कर सकता.

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Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया: EY015748, EY017964 (MEZ), और EY019517 (ASV). यह काम भी नेत्र विज्ञान विभाग और केन्द्रीय न्यूयॉर्क के लायंस को दृष्टिहीनता अप्रतिबंधित अनुदान को रोकने के लिए अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया. हम भी जानवरों के बारे में उनकी उत्कृष्ट सेवा के लिए और इस वीडियो में अभिनय करने में घुसने के लिए हमारे पशु तकनीशियन, मैथ्यू Mellini, धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/2 Gallon Flex-Tank with Cover eNasco SB19271M Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Black electrical tape
White tissue paper
Large inoculating turntable VWR 50809-022 Size: Dia 114.3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpad VWR 82004-836 Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
Kimwipe Krackeler Scientific, Inc. 1945-34155-CS
Standard tripod Various
iSight camera or webcam Apple M8817LL/A Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see
Portable computer Apple/PC Various We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV handycam camcorder SONY DCR-HC42 Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 
Handycam station SONY DCRA-C121 This can be used for connecting firewire to camera
QuickTime Player software Quicktime Version 10.1
26 G Needle (5/8" length) VWR BD305115
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Disposables
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific 17-528Z Stored at RT
Sylgard 184 silicone elastomer Fisher Scientific NC9644388
Instant ocean Doctors Foster and Smith CD-116528 Stock solution = 100 g/L stored at RT
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S0876 Stock solution = 0.4 M stored at RT
In vitro fertilized embryos eNasco LM00490MX 100 embryos/unit

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References

  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 88 आंख रेटिना दृष्टि रंग पसंद, व्यवहार प्रकाश मार्गदर्शन दृश्य परख
परीक्षण दृश्य समारोह में के लिए एक सरल व्यवहार परख<em&gt; Xenopus laevis</em
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Viczian, A. S., Zuber, M. E. AMore

Viczian, A. S., Zuber, M. E. A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (88), e51726, doi:10.3791/51726 (2014).

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