En enkel Behavioral analys för Testa Visual Function i<em> Xenopus laevis</em
Summary
Xenopus laevis grodyngel föredrar bada på den vita sidan av en svart / vit tank. Detta beteende styrs av sin vision. Utifrån detta beteende, presenterar vi ett enkelt test för att testa synen av grodyngel.
Abstract
Mätning av synfunktionen i grodyngel i grodan, Xenopus laevis, möjliggör screening för blindhet i levande djur. Den optokinetic svaret är en vision-baserade, reflexivt beteende som har observerats i alla ryggradsdjur testade. Tadpole ögon är små så svansen flip svar användes som alternativ åtgärd, som kräver en utbildad tekniker för att registrera den subtila svar. Vi utvecklade ett alternativt beteende analys baserad på det faktum att grodyngel föredrar att simma på den vita sidan av en tank när den placeras i en tank med både svarta och vita sidor. Analysen som presenteras här är ett billigt, enkelt alternativ som skapar ett svar som lätt mäts. Installationen består av ett stativ, webbkamera och kapslade testa tankar, lätt tillgängliga i de flesta Xenopus laboratorier. Denna artikel innehåller en film som visar beteendet hos grodyngel, före och efter avskiljande synnerven. För att testa funktionen hos ett öga, vi inkluderar även representativa resultatet av ett grodyngel i vilken varje öga gick retinal axotomi på varandra följande dagar. Framtida studier skulle kunna utveckla en automatiserad version av denna analys för att testa visionen om många grodyngel på en gång.
Introduction
Xenopus laevis har använts som modellorganism för att studera ögonbildning. Ögonen utvecklas snabbt, växer till mognad på mindre än en vecka för att testa gener eller vägar som har en effekt på visuell utveckling och funktion. För att testa synen, har optokinetic och optomotor svar använts i zebrafisk och Xenopus grodyngel, respektive 1,2. Eftersom ögonen på Xenopus grodyngel är relativt mindre än zebrafisk, kräver denna analys användning av specialutrustning och utbildad personal för att upptäcka subtila svans-flip och ögonrörelsebeteende i Xenopus. En mer robust uppträdande i Xenopus är preferensen för simning i en tank med en vit bakgrund, som beskrivs häri 3. Vid placering av ett grodyngel i en halv svart / halv-white tank, simmar pre-metamorphic grodyngel snabbt till den vita sidan av tanken. Vi använde tidigare denna analys för att avgöra om pluripotenta cell-derivedögon var funktionella 4. Här rapporterar vi en detaljerad version av denna analys, som kan användas för att testa den visuella funktion premetamorphic Xenopus grodyngel.
Denna analys är enklare än optomotor svarsanalysen, eftersom det bara kräver en monterad digital videokamera, digitalkamera programvara och standardutrustning finns i de flesta Xenopus laboratorier. Dessutom kräver den inspelade svar ingen särskild utbildning för att Tally resultat. Vår representativa resultat visar att samma grupp av grodyngel som genomgått dubbel retinal axotomy, simmar slumpmässigt runt tanken. Vi har också tagit med de beteendeanalysresultat från ett representativt grodyngel, som visar hur ett öga kan testas för visuell respons. Ett kalkylblad har tagits så att siffrorna som förvärvats under analysen kan sättas in och analyseras. Detta arbetsblad kan användas för att bestämma huruvida de testade grodyngel ha en visuell respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi redovisar här en enkel syn-guidad beteendeanalys som lätt kan utföras på mindre än en vecka efter minimalt utbildad laboratoriepersonal. Medan andra analyser kräver specialutrustning och kompetens inom djurs beteende, gör denna analys ett snabbt test för att fastställa visuell funktion. En annan beteendeanalys, Visual Undvikande analysen, har utvecklats för att bestämma hur tectum bidrar till visuell perception i Xenopus 10. Denna analys mäter spatial inställning och kontrastkänsligh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats genom anslag från National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), och EY019517 (ASV). Detta arbete stöddes också av den forskning för att förebygga blindhet Fritt Grant till Ophthalmology avdelningen och Lions i centrala New York. Vi vill även tacka vår djurtekniker, Matthew Mellini, för hans utmärkta hand om djuren och för att kliva in till stjärna i den här videon.
Materials
| 1/2-gal. Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large Inoculating Turntable | VWR | 50809-022 | size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb Underpad | VWR | 82004-836 | size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kim wipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard Tripod | various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV Handycam Camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam Station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 Gauge Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps Biology | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin Sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at room temperature |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant Ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at room temperature |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at room temperature |
| Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma Aldrich | A5040 | Stock solution = 10% stored at -20˚C |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
