Maya, Saccharomyces cerevisiae, endozomal sistemin biogenezi ve fonksiyonlarını düzenleyen genleri tanımlamak ve incelemek için bir anahtar bir model organizma olmuştur. Burada ince yapı çalışmaları için endozomal bölmelere spesifik etiketlenmesi için detaylı bir protokol mevcut.
Endosomlar ökaryotik hücrelerde kontrol noktaları sıralama önemli membran biri olan ve daha çok plazma zarı ve Golgi proteinlerin geri dönüştürülmesi ya da imha düzenler. Bunun bir sonucu olarak endozomal sistemi, hücre homeostazın sürdürülmesinde bir rol oynar ve veziküler taşıma araçları ile birbirine organel bu ağa ait olan genlerdeki mutasyonlar, kanser ve nörobiyolojik bozukluklar da dahil olmak üzere ciddi bir probleme yol açar. Bu endozomal sisteminin biogenezi ve organizasyon altında yatan mekanizmaları anlamak için bu nedenle asal öneme sahiptir. Maya Saccharomyces cerevisiae bu görevde önemli olmuştur. Özellikle etiket ve ultrastrüktürel düzeyde bu model organizmanın endozomal sistemi analiz etmek için, biz burada bir gümüş güçlendirme reaksiyonu ile bu parçacıkların görselleştirme ardından spheroplastlar tarafından pozitif yüklü nanogold alımı için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yöntem, aynı zamanda, bir çok değerli olduğuendozomal kaçakçılığı kusurları ile mutantların morfolojik inceleme için l. Ayrıca, sadece elektron mikroskobik inceleme için geçerlidir, ama aynı zamanda protein lokalizasyonu araştırmalar için immünolojik labelings ile kombine edilebilir.
Endozomal Sistem 1,2 reseptörleri lizozomal enzim ayırma reseptörlerinin ticareti ve plazma membranı (PM) geri dönüşüm de dahil olmak üzere çok sayıda çok önemli hücresel rol oynayan önemli bir zar sıralama aletidir. Endosomlar üç farklı bölümlerinde, yani ayrılır. Erken endozomlar (EE), geç endozomlar (LE) ve geri dönüşüm endozomlar. Bu sınıflandırma da spesifik bir işaretleyici proteinler ve onların morfolojisi üzerine, onlara ulaşmak için endositeze malzeme için gereken zaman dayanmaktadır. PM den içselleştirilmiş membranlar, yani protein ve lipid çift, iki bozulması için Endozomlar yoluyla lızozomlara teslim edilebilir ya da geri dönüştürülebilir. Membranlar da lızozomlara devam veya geri Golgi'ye alınmak ya, benzer Golgi'ye gelen Endozomlar taşınan ve edilmektedir. Ayrıca, protein endozomal sınırlayıcı zarın oluşumuna yol açan bir işlem içeri doğru tomurcuklanma lümen vezikülleri içine sıralanabilirLE bir alt kategori, multiveziküler organları.
Maya endozomal sistemi göreceli olarak daha az karmaşık, yüksek ökaryotik hücrelerin olandan. Maya endozomlar EE ve LE ayrılır. Bu geri dönüşüm endozomları değil, aynı zamanda dokuya özel lizozom ilgili organellere içermeyen memeli hücrelerinin tersine. Dolayısıyla onlar endozomal kaçakçılık yollarının 3,4 daha az karmaşık bir ağ var. Bu nedenle, maya temsil hala endozomal sistemindeki temel ilkeler zar trafiğin bir çalışma için avantajlı bir deneysel sistem temsil vardır. Bu avantaj, endozomal yollarıyla ilgili çok sayıda gen başlangıçta 5 maya genetik ekranlar ile izole edilmiş gerçeği ile vurgulanmıştır. Vahşi tip ve mutant maya hücrelerinde endozomal sisteminin kapsamlı biyokimyasal ve floresan mikroskobu yaklaşımlar kullanılarak incelenmiştir da, ultra-yapı seviyesinde bu araştırma tek olmuşturminimal. Endozomal organellerin çoğunun kesin tanımlama 6 zorlaştırır floresan mikroskobu ile noktasal yapılar olarak tespit edilir, çünkü Şekil incelemesi maya içinde özellikle önemlidir. Ne yazık ki maya endozomal protein belirteçlerinin tanıma antiserumların sadece sınırlı sayıda (IEM) preparatları 7-10 immün elektron-mikroskopi çalışıyor. Bazı proteinleri için, bu sorun, ilgi konusu genin endojen etiketleme ve 7,11,12 tespit etmek için etiketi tanıyan bir antikorun kullanılması engellenebilecektir edilmiştir. Ancak genellikle, proteinler, bunların düşük sentezleme seviyeleri IEM ile tespit edilemez. Bu yaklaşım, morfoloji / fonksiyonları yanlış lokalizasyonu ve / veya değişiklik oluşturabileceği nedeniyle aşırı ifadesi bir çözüm değildir. Böylece elektron mikroskobu EM tarafından saptanabilen bir prob ile endositik bölmelerin etiketleme etkili bir seçenektir. Bu, özellikle eğer iyi bir çözüm değildir prObe belirli bir organelini 6 işaretlemek ne zaman bilmek sağlayan bir zamana bağlı bir şekilde endositik güzergahı giriyor.
Maya spheroplastlar (hücre duvarı enzimatik kaldırılmıştır, yani. Maya) ile pozitif yüklü nanogold alımı, başarılı bir şekilde, maya endozomal 10 bölmeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu partiküller biyolojik zarların oluşturan negatif yüklü lipidler bağlanır. Böylece AM ile pozitif yüklü nanogold ortakları, endositoz ile hücre nüfuz eder ve vakuol ulaşmadan önce EE ve LE geçer. Bu küçük altın partikülleri, ancak, EM tarafından görülecek uygun bir büyüklüğe sahip değildir. Onları görünür kılmak için, boyutları altın prob yaklaşık 13-15 gümüş ya da altın çökelmesi yol açan kimyasal reaksiyonlar ile büyütülebilir. Biz geliştirdik ve başarıyla subsellüler gerçekleştirmek için Tokuyasu yöntemine dayalı bir IEM yaklaşım uyguladıkyerelleştirme 8,16 çalışmalar. Bu yöntem, morfolojisi 8,17-24 mükemmel bir çözünürlüğe sahip maya hazırlıkları immunogold etiketleme performans sağlar. Biz de 6 bölmeleri maya endozomal sisteminin nanogold etiketleme ile bu IEM protokolü birleştirerek bir prosedür kurduk. Biz morfolojik kusur 6,25 bir endozomal kaçakçılığı ile mutantlar endozomların farklı alt sınıflarını karakterize ve ultrastruktural inceleyen bu yaklaşımı kullanarak. Ayrıca, bu nanogold etiketleme immünolojik etiketleri en farklı endozom alt grupları üzerinde ilgi konusu bir proteinin dağılımını keşfetmek için imkanı sağlayan kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Burada, pozitif yüklü nanogold ile maya endozomal sisteminin etiketleme pratikte nasıl gerçekleştirildiğini mevcut.
Immuno-elektron-mikroskopisi, bu proteinlerin bulunan taşıyıcıları ve organellerin ultrastrüktürel çözünürlüğe sahip proteinlerin birleştirilmesi lokalizasyonu sağlayan bir tekniktir. Onun bölmeleri floresan mikroskobu olarak noktasal yapıları görünür, çünkü maya endozomal sistemini inceleyerek bu özellikle önemlidir. Bu, onları ayırmak için zordur. Bu nedenle EM tarafından algılanabilir ve bir zaman bağlı bir şekilde endositik yol giren için çok önemlidir bir probun kullanılması, …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Şekil hazırlanması ile yardım için Rene Scriwanek ederiz. FR ALW Açık Programı (821.02.017 ve 822.02.014), DFG-NWO işbirliği (DN82-303) ve ZonMW VICI (016.130.606) hibeler, ECHO (700.59.003) tarafından desteklenmektedir.
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |