Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Astrocytomer er den mest almindelige primær hjernesvulst og glioblastom (GBM), en grad IV astrocytoma, er den mest almindelige og aggressiv undertype med en median overlevelse på 12-15 måneder 1,2. Invasion af diffuse astrocytomer, især GBM, er til hinder for komplet kirurgisk resektion, begrænser effektiviteten af adjuverende behandlinger, og uundgåeligt fører til efterbehandling gentagelse 3. Patienter oprindeligt til stede enten med de novo (primære) GBM eller med lavere lønklasse astrocytomer der uundgåeligt udvikler sig til (sekundær) GBM 4. GBM er genomisk heterogen og præget af gensidigt udelukkende og co forekommende mutationer i gener, der styrer tre centrale signalveje: G 1 / S (RB) cellecyklus checkpoint, receptor (RTK) og TP53 veje 5-7. GBM består af fire genomiske undertyper med særskilte udtryk profiler, der ligner forskellige hjerne celletyper, hvilket tyder på, at GBM subtype Influket af sin celle af oprindelse 6,8,9. Bedre astrocytom modeller er forpligtet til at definere den rolle, specifikke kombinationer af mutationer i bestemte celletyper under astrocytom patogenese. Udnyttelse af disse modeller for en mere effektiv præklinisk udvikling lægemiddel vil i sidste ende bidrage til at forbedre patienternes resultater. Aktuelle astrocytom modeller omfatter etablerede humane cellelinjer, patient afledt xenografter (PDX), genetisk modificerede normale humane astrocytter og neurale stamceller (NSC), og genetisk modificerede mus (GEM) 10-14. Vi udviklede et alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) model 15 udnytte primære hjerneceller – kortikale astrocytter og NSC – høstet fra GEM huser forskellige kombinationer af floxet onkogene alleler. Målet var at skabe astrocytom modeller med genetisk definerede celler, der kan fænotypisk karakteriseret både in vitro og in vivo og potentielt udnyttes til præklinisk udvikling af lægemidler i jegmmune-kompetente mus.
Etablerede humane cellelinjer er de mest almindeligt anvendte model af astrocytoma patogenese og lægemiddelrespons in vitro og in vivo. De er teknisk set ligetil, bredt tilgængelige, og har defineret kinetik og tumorigenicitet upon orthotopisk xenografting i immunsvækkede mus 10,11,16-18 . Deres ulemper indbefatter den manglende evne til at generere etablerede cellelinjer fra lav kvalitet astrocytomer, begrænser undersøgelsen kun high-grade astrocytomer; Manglen på en defineret celle oprindelse; tilstedeværelsen af komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomiske profiler, som afviger markant fra den oprindelige patientprøve; og modtagelighed for fænotypiske og genotypiske respons må i løbet seriel kultur i serum 11,17,19-22. De fænotypiske konsekvenser af de enkelte onkogene mutationer i etablerede humane GBM cellelinjer kan maskeres ved de mange abnormiteter, der faktisk er til stede, hvilket ofte er til hinder elucsering af direkte genotype-fænotype konsekvenser.
PDX genereres gennem subkutan passage af patient-isolerede astrocytomceller i immunsvækkede mus eller gennem deres kultur som ikke-klæbende sphæroider i defineret, serum-frit medium forud for orthotopisk injektion i hjernerne hos immunsvækkede mus 12,23. PDX mere præcist opretholde genomisk landskab af menneskelige astrocytomer, men magen til etablerede humane cellelinjer, kan den fænotypiske effekt af de enkelte onkogene mutationer være maskeret på grund af deres genomiske kompleksitet 19,24. At definere de fænotypiske konsekvenser af specifikke onkogene mutationer, især som reaktion på nye behandlingsformer, er paneler af etablerede humane cellelinjer eller PDX ofte udnyttes til at etablere genotype-fænotype korrelationer viser generaliserbarhed, og minimere sandsynligheden for cellelinje-specifikke effekter. Mens PDX nøjagtigt rekapitulere de histopatologiske kendetegnende for menneskelig astrocytomer, including invasion, ortotopisk xenotransplantater af etablerede humane cellelinjer generelt ikke 21,23,25. Derudover normale humane astrocytter og NSC er blevet genetisk manipuleret med definerede onkogene mutationer at modellere astrocytom tumorigenese in vitro og in vivo 13,14,26. Disse celler mangler det genomiske kompleksitet etablerede humane cellelinjer og PDX og præcist rekapitulere menneskelige astrocytom histopatologi, men kræver xenografting i immunsvækkede gnavere in vivo. Fordi alle menneskelige celle modeller kræver immundefekte gnaver værter til at forhindre immunmedieret xenotransplantatafstødning, disse modeller undlader at rekapitulere de native tumor-stroma interaktioner af et syngen system, og mangler et intakt immunsystem, begrænsning præklinisk undersøgelse af stroma-målrettet og immun-modulerende terapier 10,11.
GEM tillader undersøgelse af fænotypiske konsekvenser af forudbestemte kombinationer af onkogene mutationer in vivo under in situ tumorigenese. Mens ikke-betinget GEM har mutationer i alle væv i hele udvikling, har betinget GEM floxet onkogene alleler, der muliggør målretning af mutationer ved at begrænse Cre-medieret rekombination til specifikke celletyper ved anvendelse af celletype-specifikke promotorer 10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM er blevet anvendt til at belyse de funktionelle roller onkogene mutationer i forskellige celletyper i en intakt hjerne 11. Den prækliniske nytte af in situ gliomagenesis brug af betinget GEM er begrænset af en række faktorer, herunder 1) manglen på en in vitro-korrelat, 2) svært ved at generere store grupper af mus med komplekse genotyper, 3) lang latenstid in situ tumor udvikling , 4) og stokastisk tumorprogression. Fordi in situ tumorgenese mangler en tilsvarende in vitro-model, kan narkotika-test in vitro ikke udføres wed konventionelle betingede GEM modeller. I modsætning til andre kræftformer, er betingede GEM modeller af astrocytomer sjældent fremkaldt af enkelte onkogene mutationer 11. Således er komplekse avlsplaner skal generere betinget PERLE med flere onkogene mutationer. Desuden forekommer astrocytoma initiering med variabel penetrans efter en lang latensperiode i disse modeller, mens progression til high-grade astrocytomer generelt sker i en ikke-ensartet, stokastisk måde og i sidste ende giver anledning til tumorer med komplekse genomiske landskaber og hurtige vækstkinetik 27, 28. Den variable penetrans og stokastiske natur malign progression i betingede GEM-modeller kræver, at de enkelte mus screenes ved radiografisk billeddannelse til at detektere tilstedeværelsen og placeringen af high-grade astrocytomer før deres indskrivning i prækliniske lægemiddelforsøg. Tilsammen disse begrænsninger hindrer generering og test af de store kohorter af betinget GEM kræves for PReClinical narkotika testning.
Den RCAS-TVA GEM system, som udnytter aviær retrovirale (RCAS) vektorer at inficere GEM manipuleret til at udtrykke den virale receptor (TVA) på specifikke neurale celletyper, er blevet ekstensivt anvendt til at modellere astrocytom tumorigenese 11. I modsætning til betinget GEM dette modelsystem, gør indførelsen af flere onkogene mutationer i specifikke celletyper uden behov for komplekse avlsplaner. Det er imidlertid begrænset af variabel penetrans, kravet om aktivt delende celler for at opnå viral integration, og tilfældig indsættelse af transgener i værtsgenomet 29.
Ikke-kimlinie GEM (nGEM) modeller, der anvender celler høstes fra GEM, bliver mere og mere vigtige, fordi de overvinde mange af de begrænsninger af andre modelsystemer 15. Rolle indlede celletype og co forekommende mutationer i astrocytoma patogenese er vanskelige at afskrækkeminen ved anvendelse af etablerede humane GBM cellelinjer eller PDX, fordi de stammer fra slutstadiet tumorer, der har akkumuleret omfattende genetiske mutationer i udefinerede celletyper i løbet af malign progression. I modsætning hertil kan alle kvaliteter af astrocytomer modelleres ved hjælp nGEM ved at inducere definerede genetiske mutationer inden for specifikke oprensede hjerne celletyper 11,30. Således kan bestemmes indflydelsen af specifikke genetiske mutationer og celletype på cellulære og molekylære fænotyper in vitro og in vivo. Svarende til etablerede humane GBM-cellelinjer kan indledende in vitro test af lægemidler i at bruge nGEM anvendes til at prioritere lægemidler til in vivo-test, der anvender de samme celler. Tumorigenese in vivo kan derefter bestemmes ved allografting nGEM celler orthotopisk i hjernen på immun-kompetente syngene kuld 30. Disse ortotopisk allotransplantat modellerne tillader derfor in vivo-test ikke kun af konventionel cytotoksisk ennd målrettede behandlinger, men immun-modulerende og stroma målrettede behandlinger så godt. Endelig kan rolle mikromiljøet på tumorinitiering og progression bestemmes ved at sammenligne resultaterne mellem nGEM og konventionelle GEM modeller under anvendelse af de samme mutationer i de samme celletyper.
Vi og andre har udviklet astrocytoma nGEM med primære celler – astrocytter, NSC eller oligodendrocyt prækursorceller (OPC) – høstet fra GEM 30-34. Rationalet bag udviklingen af en astrocytoma nGEM var at skabe en model til at bestemme de fænotypiske konsekvenser af onkogene mutationer i specifikke celletyper, der potentielt kan bruges til præklinisk test af lægemidler in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstede fænotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre udtrykker, betinget GEM vedligeholdes på en> 94% C57 / BL6 baggrund med floxet RB vej – RB1 loxP / loxP eller TgGZT121 – og floxet RTK / RAS / PI3K vej – NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – generne i forskellige kombinationer 35-39. Vi induceret genetisk rekombination in vitro ved anvendelse adenovirale vektorer, der koder Cre-rekombinase. Fordi kortikale astrocyt høst indeholder en blanding af celletyper, vi anvendte Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, såsom TgGZT 121 drevet fra den humane GFAP promotor, at berige for GFAP + corticale astrocytter i disse kulturer. Vi definerede fænotypiske konsekvenser af G 1 / S (Rb), MAPK, og PI3K pathway mutationer i corticale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K-forløb-aktiveret G1 / S-defekte astrocytter molekylært efterlignede menneskelige proneural GBM og efter orthotopisk injektion, dannet tumorer i en foruddefineret placering med ensartede vækstkinetik, korte latenstider og histopatologiskeal kendetegnende for human GBM 30. Longitudinal overvågning af tumorvækst in vivo hjælpemidler præklinisk stof gennem normalisering af behandlingsmuligheder kohorter og kvantitativ analyse af tumorvækst i respons på behandlingen 40. Vi fast tumor vækstkinetik af langsgående bioluminescens billeddannelse af mus injiceret med luciferase udtrykke corticale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC afledt betinget PERLE give en medgørlig model system til definition af funktionelle konsekvenser af astrocytom-associerede mutationer og en mulig model for præklinisk lægemiddeludvikling.
De mest kritiske trin for at sikre korrekt høst og dyrkning af corticale astrocytter er 1) at udskære cortex uden at væv under corpus callosum, 2) at fjerne meninges, 3) til grundigt at adskille celler, og 4) for at berige for GFAP + astrocytter. Selvom vi brugte mekanisk (rysten) og genetiske (begrænsning af genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller udnyttelse af en dominerende transformerende transgen (TgGZT 121) under GFAP promotor kontrol) metoder til at berige…
The authors have nothing to disclose.
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |