Abstract
后期胚胎发育中的果蝇， 果蝇的显著部分，需要在一组囊样结构，称为成虫盘的地方。这些光盘引起成人结构的成年果蝇中发现的高百分比。在这里，我们描述了优化，回收这些光盘并准备分析的抗体，记者转录和蛋白质陷阱的协议。此过程是最适合用于薄的组织像成虫盘，但可以很容易地修改为用较厚的组织使用，如幼虫脑和成年卵巢。书面协议和相应的视频将通过三龄幼虫，组织固定和治疗成虫盘与抗体的夹层引导读者/观众。该协议可以用于解剖成虫盘从年轻的第一和第二龄幼虫为好。这个协议的优点是，它是比较短的，它有可连接优化的高品质保存的解剖组织。另一个优点是，所采用的固定方法可以很好地承认果蝇蛋白质的抗体的数量相当多。根据我们的经验，有极少数不以这个程序很好地敏感的抗体。在这种情况下，补救似乎是使用替代固定的鸡尾酒，同时继续遵循我们提出的解剖步骤和抗体孵育的准则。
Introduction
一个多世纪的果蝇， 果蝇 ，一直是首屈一指的系统来研究发展，行为和生理。发展中的苍蝇可分为两大阶段：胚胎和胚后得多，后者正在发生的范围内的单层上皮称为成虫盘1-3。 成虫盘的图纸首次出版于1864年八月魏斯曼作为他的专着广泛的昆虫开发1份 。这些光盘胚胎发育过程中开始了他们的发展，在幼虫阶段进行构图，生存下来的早期蛹阶段的大规模histolysis，最终导致成年结构被发现在成人中飞往1-14比例很高。在幼虫发育每张光盘公司对于命运，形状和大小的几个关键决策。在第一和第二龄幼虫，光盘的任务是采取主的命运，establis兴隔室的边界，采取了正确的形状和单元格生成15-16的必要数量。在第三龄幼虫和早期预蛹期，成虫盘继续分化和图案化为细胞通过它们的终端命运16。
在果蝇发育生物学的早期历史，成虫盘是在正常发展的情况下，并在有限的情况下，其中的损失或获得功能的突变体是可行的研究几乎完全。利用X射线来诱导允许致死突变有丝分裂重组到在幼虫和成体组织内的细胞克隆进行分析。此方法已被引入转基因方法提高分析损耗和增益的函数在两个幼体和成体组织中的突变。抗体，转录记者和蛋白质陷阱用于说明野生型和突变型组织中的分子景观的数目也是常量antly增长。使用这些分子标记分析损耗和增益的函数的突变体细胞克隆已经变得日益可行获得的如何从他们的野生型表亲发育过程中的突变细胞偏离实时了解。要正确利用这些工具和试剂，关键是要具有可观察，拍照和分析成虫盘高品质的准备。该原稿的目的是提供一种用于眼触角圆盘复合物（ 图1A）的分离和制备的优化协议。它也可以被成功地用于分离各种各样的另外的光盘包括那些引起的翅膀，halteres，T1-T3的腿和生殖器（ 图1B-E）。这个过程，有稍作修改，已用于隔离成虫盘果蝇了近80年。
如上所述，由于大多数的基因中亩表达ltiple发展，在许多组织中的阶段，它往往是不可能的学习效果无效突变对整个眼睛的动物的三龄幼虫期前去世好。四种方法取得了比较发达的组织学习，如视网膜显著更容易处理。第一个是一个否则野生型组织17-19内产生突变体细胞克隆的翻转酶（FLP）/翻转酶的重组目标（FRT）的方法。在此实例中，突变体组织是由缺少可视标记的识别，例如绿色荧光蛋白（GFP），并且可以比周围的野生型组织中的GFP存在（ 图2D）。第二是其中的转基因表达在细胞20的人口的“FLP出”方法。在此实例中的细胞克隆是通过GFP的存在鉴定和比周围的野生型组织的缺乏GFP报告（ 图2E）。三是具有可抑制细胞标记（MARCM）技术，它结合了FLP / FRT突变克隆和FLP出表达系统21元素的马赛克分析。用这种方法的转基因可在细胞，同时突变为单个基因座的群体来表达。像FLP出克隆，MARCM克隆通过GFP的存在鉴定和比周围的野生型组织的缺乏GFP标记（ 图2F）。最后，该基因和RNAi构建体可以特异性启动子-GAL4构建体的控制下，成虫组织中表达。这四种方法都增加学习成虫盘的兴趣，因为突变或过度表达克隆或图案可以直接比较，以相邻的野生型组织。在此过程中描述的方法已经被开发，使研究人员谁研究成体组织中的后胚胎发育的果蝇 ，特别是那些从眼触角光盘衍生，将能够获得高品质的组织进行分析。虽然个别研究人员已经作出轻微的修改，这个过程（其中我们在这里描述）的核心基本上保持不变。由于获得高品质的组织是在成虫盘，我们希望这份书面协议，并伴随视频将作为宝贵的教学资源的研究是至关重要的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1，准备幼虫
- 填写35mm的培养皿夹层缓冲。
- 幼虫放置在培养皿中，让它们游来游去几分钟（自清洁步骤）。
- 幼虫转移到夹层缓冲池的有机硅系夹层板。这个池应该是在该板的一个边缘。夹层板包括已注入硬化内的玻璃培养皿中的硅解决方案。
- 使用巴斯德，移液管，将夹层缓冲池更大的夹层板的中间。
- 使用＃5镊子，从小型游泳池传输单个清洗幼虫解剖缓冲区较大的游泳池。
幼虫2，粗剖析
- 而幼虫仍然是夹层缓冲的大型游泳池内扣用钳子幼虫。一对钳子的，应使用抢口钩，而另一对镊子是用来装在ANIM人还在（抢轻轻的幼虫在人体三分之一的长度）。
- 保持稳定的一对含角质层口附近的钩子，同时迅速与第二对钳子的提拉身体的其余部分离开钳子。
- 当幼虫开始撕开，你会感到轻微的释放紧张情绪。从钳子松开幼虫，并允许幼虫洒出的“胆”。这允许对成虫盘留在其正常形态，防止它们变形。
- 有一对钳子抓住钩嘴再次举行的地方幼虫的前端。使用其他钳子取出幼虫包括内胆量的低三分之二。注意：含有口钩，眼，触角光盘，大脑半球，腹侧神经节，唾液腺，某些腿光盘的复合物，以及上覆的角质层会维持不变。
- 一对镊子轻轻取出上层的角质层，唾液腺，腿盘和其他组织。注意：只有组织应保留的口钩，眼，触角光盘，大脑半球，和腹侧神经节（ 图3）。
- 额外的幼虫15-20分钟重复步骤2.1-2.5。注意：留在夹层的缓冲液的时间较长成虫盘趋向于降低，并最终将出现不理想的标本被照相。因此，最多20分钟的所有解剖组织中应该转移到PLP固定液后（见下文）。
3，固定和组织染色的抗体
- 使用的是P-200的Pipetman，解剖组织转移到含冷多聚甲醛赖氨酸高碘（PLP）固定液的手表玻璃。转夹层缓冲限位量50μL，以减少稀释PLP的。一定要切断的前端用刀片，使针尖开口大到足以容纳解剖组织。用钳子或钨针确保在解剖组织是为了正确固定到发生完全淹没。孵育在寒冷的PLP固定液解剖组织45分钟。该温育可以在RT发生不搅拌。
- 使用的是P-200的Pipetman，使用另一种切割黄色针尖45分钟转移解剖组织，以洗涤缓冲液（RT）。转移PLP的极限量50μL，以减少稀释的洗涤缓冲液中。注：所有的解剖组织应完全淹没。
- 转让20-30套解剖组织的1.5 ml离心管中。注意：如果较大的眼触角光盘络合物号在管内结合时，有可能使组织在管的底部将不会正确地暴露于抗体。为了达到最佳效果不会超过20-30眼触角盘配合应该是一个单一的管内出现。的解剖组织会沉淀到离心管的底部。因此，在后续步骤ü证A的Pipetman拆卸和更换洗涤缓冲液，封闭液和抗体。
- 除去洗涤缓冲液和替换用100μl封闭溶液：在洗涤缓冲液中的10％正常山羊血清。在室温下孵育与在桌面上旋转10分钟，轻柔旋转。
- 除去阻断溶液并更换用100μl一级抗体的已在10％正常山羊血清被适当地稀释。在室温下孵育以16小时平缓旋转。
- 除去第一抗体，并替换为750微升的洗涤缓冲液。放置管上的章动器，并允许作俯仰运动在室温10分钟。注意：一次抗体可以被保存（储存在4°C）和后重复使用。重复使用的抗体多次可以帮助减少非特异性结合。
- 允许磁头沉降到管的底部，然后除去洗涤缓冲液中，并加入100微升已经在正常血清中的10％被适当稀释的二抗的。在室温下孵育与温柔的转动2̵1; 4小时。
- 从组织去除二级抗体溶液和替换用500μl的洗涤缓冲液。允许组织沉降到管底。
- 使用的是P-200和切割黄色尖，全解剖组织转移到洗涤缓冲液已被放置在解剖菜池。而在进行细夹层的下一个步骤中，组织将孵育在洗涤缓冲液中。这有助于去除过量的二抗。
4，精细解剖眼睛，触角盘配合，并安装到幻灯片
- 用一对镊子的口钩朝下的复杂的腹侧扣着角质层。与第二对钳子的，通过关闭第2钳子在脑和眼盘之间的空间（ 图3，红色箭头），迅速 地从口中钩拉大脑远离除去两个脑叶。
- 同时继续稳守口钩，夹断组织尽可能接近到眼触角盘的触角部和口钩（ 图3，蓝色箭头）之间的连接。注：眼触角盘配合应无组织（ 图1A）。继续进行，直到所需的所有期望的组织可以放置在载玻片上已被切开。此协议可适应隔离翼，haltere，腿和生殖器成虫盘（ 图1B-E）。
- 在解剖盘加两小块纸巾（盖玻片的大小）约3英寸分开。将载玻片上的菜 - 两片纸巾应该是幻灯片的目的下。这将防止在滑动粘附到解剖盘的硅氧烷基。
- 利用P-20和未切割尖端，添加9微升抗漂白剂的玻璃显微镜载片上的中间。这防止了组织的漂白和荧光观察时光。
- 使用相同的完整无缺的一角，收集所有的眼睛触角光盘，并将其添加到抗漂白剂的下降。最小化的所承载的洗涤缓冲液的量。试图限制的洗涤缓冲液的量，以10微升或更小。
- 用一对镊子的分离和抗褪色试剂的滴内摊开眼触角光盘。允许光盘，以在抗褪色试剂孵育数分钟。注：光盘将变为清晰的组织吸收的抗漂白剂。
- 用细的画笔轻轻放下盖玻片上的样品。这防止了气泡的形成。
- 商店滑动于-20℃，直到准备查看使用光或荧光显微镜眼触角或其他成虫盘。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这是上面描述可靠的方法产生高品质的材料进行分析原位探测，记者转录，蛋白质陷阱和抗体。在图1中，我们显示了例行回收用这种方法眼睛天线，生殖器，翼，haltere和腿部光盘。这些光盘已经处理了鬼笔环肽标记的荧光基团，其结合到F-肌动蛋白，从而勾勒每一个细胞。如果组织已被妥善固定，然后在眼盘的形态发生沟，同心组织的边缘褶皱的生殖器官，触角和腿盘，以及机翼和haltere盘的背腹轴将全部显示为锐利边缘。如果一个组织被妥善固定后的抗体，荧光蛋白和原位探测也将揭示尖锐的模式。几个实例示于图2。已染色的，而不同的抗体的顶部的三个面板显示光盘下面三个图显示光盘中的GFP用于标记细胞群体。
一项所述的眼触角盘的最显着的特征是在形态形成沟（ 图1A），它可以被看作是沿着背腹轴1，22运行在组织内的凹部。此前的第三龄幼虫的所有小区内显影眼睛是未图案化的，未分化的，并且彼此形态上难以区分。在第三龄幼虫的起始处的形态发生沟发起在眼睛区域的后缘和进展前侧朝向眼睛/触角边界22。作为沟穿过眼睛字段前进紊乱的细胞的海水转变成周期性间隔单元的眼睛或小眼（ 图1A）22-23的有序阵列。未来，其中包括Pax6基因同源无眼（EY）的基因调控网络的沟渠道细胞对眼睛的命运（ 图2A）15。沟本身的启动和进展取决于刺猬（HH）和Decapentaplegic（DPP）的活动信号通路24-29。的确是DPP-lacZ报告如实地反映了沟（ 图2B）30-31范围内民进党轨迹的表达。作为细胞退出沟，并开始通过其终端的命运，它们表达特定细胞标志物，如胚胎致死视觉异常（ELAV），它编码一个泛神经元的RNA结合蛋白（ 图2C）32-34。
图1 果蝇成虫盘。（
眼睛成虫盘的图2的克隆及表达分析（A - F）。眼成虫盘共聚焦图像。 （ 一）Pax6基因蛋白无眼（EY）分布广泛超前的形态发生沟。 （B）DPP-lacZ的转录reporteř响应Hh信号传导和骨形态发生沟中被表达。 （ 三）泛神经细胞的RNA结合蛋白ELAV分布在沟形态背后的所有发展中国家感光。 （ 四）以眼盘含丧失功能由FLP / FRT系统产生的克隆。该克隆鉴定缺乏GFP（ 五）。眼睛光盘，其中包含与FLP出系统生成的过表达克隆。克隆正面标有绿色荧光蛋白。 （六）以眼盘含MARCM克隆。像FLP输出系统，该MARCM克隆可以通过GFP的存在来鉴定。所有检测到的蛋白质和基因型列出的数字之内。前路是正确的，并背到了。
图3：眼天线的大脑复杂，一个 SCH第一天粗解剖制品ematic绘图。这应该是固定的唯一组织是嘴钩，眼天线盘和脑（常时间的腹侧神经节将保持附着，以及 - 未示出）。紫色=脑，绿=眼天线盘，棕=口钩。前部是在正确的。如果解剖腿，翅，haltere和生殖器光盘，幼虫的外表皮仍然应该连接到这些组织中。不要取出覆角质层，你可能会在通过各种抗体，阻断和洗涤液随后转移失去成虫盘。多余的组织可以在精细解剖步骤（4.1-4.2）被删除。
图4 果蝇幼虫内成虫盘的位置，一个模式眼部天线，腿，翅，haltere和生殖器盘内的第三龄幼虫的相对位置抽动图。眼触角盘以绿色，腿盘在蓝色露背盘是紫色，翼盘是棕/橙生殖器盘是浅棕色。前部是在正确的。
| 解决方案的名称 |
| 8％多聚甲醛 |
| 的0.2M磷酸二氢钠 |
| 0.2M磷酸钠Disbasic |
| 1N氢氧化钠 |
| 10％的Triton |
| 0.1M磷酸钠缓冲液（缓冲液夹层） |
| 0.1M的磷酸钠缓冲液+0.1％的Triton（洗涤缓冲液） |
| 赖氨酸缓冲 |
| 2％多聚甲醛 - 赖氨酸 - 高碘固色剂（PLP） |
| 10％正常山羊血清 |
表1：需要的解决方案列表。
| 8％的多聚甲醛原液 |
| 到50毫升锥形瓶中加入以下内容： |
| 2.0克多聚甲醛 |
| 23.0毫升蒸馏水 |
| 4.0滴1N氢氧化钠（从玻璃巴斯德吸管） |
| 混合和热的轰动板，直到溶液达到沸腾的温柔 |
| 可以轻轻地熬，直到多聚甲醛完全溶解 |
| 放在冰上，直到冷（使每个解剖之前，鲜） |
| 0.1 M磷酸缓冲液（夹层（P）缓冲器） |
| 到50毫升锥形管添加以下内容： |
| 18.0毫升0.2M的磷酸氢二钠 |
| 7.0毫升0.2M磷酸二氢钠 |
| 25.0毫升蒸馏水 |
| 储存在4℃下（1个星期的保质期） |
| 0.1M磷酸盐+洗衣粉液（洗（W）缓冲） |
| 到50mL锥形管添加以下内容： |
| 18.0毫升0.2M的磷酸氢二钠 |
| 7.0毫升0.2M磷酸二氢钠 |
| 25.0毫升蒸馏水 |
| 0.5毫升10％的Triton |
| 商店在RT（1个星期的保质期） |
| 赖氨酸（L）缓冲 |
| 到50毫升锥形管添加以下内容： |
| 0.4克赖氨酸 |
| 1.2毫升0.2M的磷酸氢二钠 |
| 8.0毫升夹层（P）的缓冲 |
| 10.0毫升蒸馏水 |
| 摇动溶液，直到赖氨酸完全溶解 |
| 放在冰上，直到冷（使每个解剖之前，鲜） |
| 2％多聚甲醛-赖氨酸-高碘（PLP）固定液 |
| 0.1克高碘酸钠 |
| 15.0毫升赖氨酸（L）缓冲 |
| 5.0毫升8％的多聚甲醛 |
| 摇晃的解决方案很好，直到高碘酸钠完全溶解 |
| 放在冰上，直到冷（使每个解剖之前，鲜） |
表2：食谱所需的解决方案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然这个过程在很大程度上集中在分离和后续治疗的眼触角光盘，它是适合于被用于分离和分析的翼，haltere，腿和生殖器光盘（ 图4）。该协议用于分离这些光盘（相对于眼触角光盘）的唯一必需的修改是粗解剖（该协议的第2部分）的方法。第一胸椎腿（T1）对被发现在幼虫的前，可以通过以下的协议眼触角盘隔离来回收。然而，第二胸椎腿（T2）的光盘安装到角质层。以隔离这些光盘的一对钳子的，应使用以保持口钩（如上所述），而另外一对钳子的，应使用扣着的动物的腹角质层（确保从扣着幼虫大约三分之一口钩的幼虫可以简单地通过从拉尔的其余部分撕裂的腹侧角质层远圆角VA。 T2的腿将保持附着在角质层。第三胸椎（T3）的腿被安装在机翼和haltere光盘作为一种复杂的，它本身也被附着在角质层的一部分。可以选择该程序的精细解剖部分期间，分离从角质层光盘复杂和T2的腿在此阶段或在其后的定影/抗体孵育步骤保持角质层盘复合在一起，隔离片（第4节） 。用于回收生殖器光盘，最好是掌握幼虫在中间段与一对钳子，然后剥离腹侧角质层距离与另一对起始于中间段和在幼虫的后端结束钳子。建议将镊子用来清除所有多余的组织，然后只是生殖器盘传送到使用的P-200的Pipetman和黄尖的一端已被切断用刀片的固定液。
此过程是最适合做卷烟有限厚度的UE，如成虫盘和效果最好，如果所使用的抗体是高效价和特异性。然而，它可以适合于较厚的组织很好地工作，如成年卵巢，睾丸，脑，以及与低滴度的抗体或那些给比所需的“背景”染色更高。当使用较厚的组织工作，故建议最佳结果可以简单地通过增加多聚甲醛的浓度和/或培养在PLP固定液为更长的时间来获得。由于解剖组织的恰当固定为与该协议成功的关键是还建议，增加了多聚甲醛的浓度和/或增加的固定长度的效率与鬼笔环肽（ 图1）进行评估。具体而言，应该密切注意该组织内支付给细胞轮廓等物理标志性建筑的“锐度”（ 即 morphogenetic沟）。另一种方式，以确保您的组织（尤其是较厚的样品）被正确的固定是准备8％多聚甲醛和工党的解决方案每个解剖之前，新鲜的。最后，剥离的整体质量可以如果组织被解剖为很短的时间和组织被尽快转移到固定剂增加。因此建议解剖为不超过15-20分钟以上。解剖更短的持续时间增加组织保存的质量。
此协议可很好地与各种抗体，但它是真实的，一些抗体不与PLP固定液很好地工作。一个臭名昭著的例子是，认识到粗（RO）转录因子的抗体。粗糙的内表达和所需的显影感光体35的一个子集的规范。在抗Ro抗体的效果最好，不与工党，而是用管道- EGTA - 硫酸镁 （PEM）乙uffer 36。类似地，其它抗体可以工作在已接种于静止其它固定剂的组织最好。因此建议，除非另有说明，所述PLP固定液应首先尝试。如果不成功则找到一个替代的固定剂应该开始的过程。
一个常见的问题是面对有问题抗体的工作浓度。很多时候，你可能会使用特定的抗体来检测蛋白质您感兴趣的组织中的第一个研究员。工作浓度偏离所报告的其他组织。有人建议，该建议的浓度来第一次尝试。增加抗体的浓度，如果信号不能被看到。另一方面，如果所建议的浓度给出了高背景染色，然后稀释该抗体应当尝试。抗体中的工作浓度可以变化。例如，所述抗眼睛缺席（EYA）抗体稀释1:5，而反ELAV抗体的效果很好，甚至在1:500稀释。 3000：一些抗体，甚至可以远跌1稀释。此外，此过程中，作为书面，效果最好具有高特异性的抗体。然而，由于许多有经验的，一些抗体可结合非特异性的组织，这可以创建一个次优的图像。这种情况可以通过孵育稀释的抗体与之前被加入到固定成虫盘固定胚胎或幼虫尸体被经常校正。根据非特异性背景染色的水平，“预吸收”所需的长度可以变化，将对试行待解决。另外，也可以增加通过再使用抗体几次或通过进行多轮的预吸收的信号/噪声比。
当决定在其上的光盘应该在出版物和/或演示中使用，它是最好的选择已取向的顶侧取向向上光盘病房。这也是最好使用未折叠的光盘。这是特别真实的眼触角的光盘。光盘的腹侧趋于倍，不幸的是，没有什么可以做，以防止这种情况发生。一种解决方案是解剖年轻的光盘，因为这些倾向于折叠少得多。另一种选择是只解剖了大量的光盘，直到你得到一个完全平坦的。眼触角光盘的整体形状可受在其中幼虫被撕开的速率。如果拉幼虫相距太快，通过该脑盘片复杂通孔小，眼触角光盘出来折叠和/或拉伸。最好是缓慢拉动，直到幼虫开始撕由于空穴会更大。然后你就可以继续拉脑眼触角盘复杂缓慢。请记住，你永远不能拉得太慢。还注意，在你撕开组织的速率是在其他组织中分离的一个因素。
ve_content“> 果蝇的生命周期由三个幼虫阶段。重要发育事件发生这些阶段的每一个中，从而以分离组织不仅从第三龄幼虫（这是该过程的主要焦点）可能是重要的而且从第一和第二龄幼虫，以及，随着一个小的例外，这个程序可以被使用，如写入，以分离第二龄期的光盘。在手术过程中的精细解剖部分（第4节），建议锋利钨线应用于分离从外部组织眼触角圆盘状的口钩，脑和唾液腺的钨丝，也可以用于将T2 / T3腿，翼和haltere光盘彼此以及上覆的角质层分离它是推荐的钨丝（将用于分离组织中的端部）的一端，可以通过加热在沸腾硝酸钠浴削尖的另一端可以插入到销钉虎钳;第就是可以让你更轻松地握住钨丝。不幸的是，这是相当多的难以分离完整的一龄盘，因此建议您将整个眼睛，触角盘/脑/口钩复杂的幻灯片上，盖上盖玻片。解剖组织的量可以通过使用锋利的钨丝，除去了唾液腺和覆盖角质层安装光盘/脑/口钩配合到滑动之前被最小化。它是比较容易识别的第一龄眼触角光盘时，它仍然连接到大脑和嘴钩（参见图6A，Kumar和摩西，2001 D）37。另成虫盘将不得不从角质层分离并置于载玻片上进行查看。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们要感谢唐纳德准备和凯文·摩西教授JPK原成虫盘解剖过程。我们也感谢邦妮Weasner的生殖器盘图1B和眼盘图2A，布兰登Weasner为图3中，布鲁明顿果蝇库存中心飞污渍和发展研究杂交瘤细胞银行抗体。 CMS已经由卫生研究院（NIH）的GCMS培训格兰特国家研究院（T32-GM007757），弗兰克·W·普特南研究奖学金，以及罗伯特·布里格斯研究奖学金助学金的支持。 JPK支持由国家眼科研究所资助（R01 EY014863）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
