Introduction
Die axonalen Kompartiment von Neuronen zeigt ein hohes Maß an funktionaler Unabhängigkeit von der somato-dendritischen Fach. In Projektionsneuronen, enthalten die meisten Axone der neuronalen Protein 1,2. Das Studium der Physiologie und Pathophysiologie von Axonen hat Schwung in den Neurowissenschaften gewonnen, weil neuere Studien haben gezeigt, dass die frühe axonalen Dysfunktion scheint ein gemeinsames Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen und neuropsychiatrischen Störungen 3 sein. Es scheint wahrscheinlich, dass ein besseres Verständnis der axonalen-exklusive Mechanismen unter normalen und pathologischen Bedingungen wird Licht auf die frühen Ereignisse, die Dysfunktion fahren zu vergießen.
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie Kultureinsätze verwenden, die mit einem porösen Membran (Filter), um große Mengen von reinem axonalen Material, das geeignet ist für die biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Der Einsatz von Filtereinsätze zu studieren axonalen Biologie wurde zuerst von Steward umgesetzt undKollegen 4 und weiter durch Twiss und Kollegen fünf seiner derzeitigen Konfiguration entwickelt. Die Technik ist jetzt in der aktuellen Nutzung durch Gruppen studieren verschiedene Aspekte der axonalen Dendriten und Biologie, mit leichten Modifikationen in jedem Fall für die Population von Neuronen untersucht zubringen, die durchgeführten Behandlungen und die Art der biochemischen Analysen 6-9. Das vorliegende Protokoll hat nicht die Absicht, alle Alternativen für eine solche Vielzahl von Anwendungen unterzubringen, sondern eine einfache Methode, die für die meisten Anwendungen geeignet ist. Insbesondere die hier beschriebenen Protokoll verwendet eine Dreifach-Beschichtung, die axonalen Ausbeute für biochemische Analysen maximiert und ist bestens geeignet, um in der Literatur beschrieben axonalen Degeneration-anderen Beschichtungen studieren produziert weniger Axone, zurückziehen und schneller degenerieren, wenn sie von Nahrungsfaktoren 9 beraubt.
Bei diesem Verfahren bleiben die neuronale Zellkörper oberhalb der Filter wh isoliertile Axone verlaufen durch die Poren und wachsen entlang der Bodenoberfläche. Reine Axone (ohne Glia und neuronale Zellkörper Verunreinigungen), die auf der unteren Oberfläche des Filter wachsen kann für biochemische Analysen gesammelt werden oder kann in situ fixiert und durch immunzytochemische Methoden 9 untersucht werden. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von embryonalen sensorischen Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG). Embryonale DRGs sind weit verbreitet, um Biologie zu studieren, weil axonalen Neuriten aus diesen Zellen eine schnelle und robuste Wachstum in vitro, wenn sie in den Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten, und weil sie schnell unterziehen Degeneration, wenn dieses Faktors beraubt. Auch DRG-Neuronen fehlt Dendriten, so dass alle mit dieser Methode gesammelt Neuriten sind rein Axone.
Filtereinsätze stellen im Vergleich zu anderen Ansätzen verwendet, um Axone zu studieren einen großen Vorteil. Untersuchungen sich auf die Verwendung der Mikroskopie zu unterscheiden Prozesse in der Zelle Soma von den in a vorkommendenXON-Fluß einen begrenzten biochemische Information. Als weiteres Beispiel teilten Kultursysteme (zB Campenot Kammern 10 oder 11 Mikrofluidvorrichtungen) sind nützlich zur Bildgebung Ansätze und für eine unterschiedliche Behandlung von Zellkompartimenten, bieten aber nur geringe Mengen des axonalen Material, was die Verwendung dieser Techniken für biochemische Analysen, die erfordern, relativ große Probenmengen. Weitere, ihre Verwendung erfordert eine umfassende Ausbildung sowie spezielle Geräte, und sie zeitaufwendig sind. Ein weiterer Ansatz oft verwendet, um Axone aus Explantaten isolieren ist es, eine Explantation Zentrum (mit neuronalen Zellkörpern), bevor axonalen Probensammlung manuell entfernen. Dies kann zwar große Mengen von Axon-angereicherten Präparationen erzeugen können Axone in dieser Zubereitung in Glia umhüllt und schnell nacheinander Entfernen Körper 20 Explantat von 6 Vertiefungen (als Beispiel eines minimalen Experiment) ist zeitaufwendig und an der Grenze des Machbaren.
Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode liefert reichlich und rein axonalen Vorbereitungen, die dann von nahezu jedem biochemischen Technik, die häufig verwendet wird, um ganze-Zelllysaten analysieren, wie Western-Blot, Immunpräzipitation 6, Northern Blot-5-Massenspektrometrie 6, RNA-Reinigung analysiert werden können 7,12,13, unter anderem. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um (IF)-Techniken Immunfluoreszenz, wie es möglich ist, Axone wachsen in der unteren Seite des Filters weiter zu untersuchen, indem sie IF fixieren. Dieser Ansatz erleichtert die Analyse der axonalen spezifische Prozesse, da es keine Zellkörper in der letzten Vorbereitung. Dies ist ein bedeutender Vorteil, da eine hohe Immunfluoreszenzsignal vom Zellkörper oft untergräbt Prüfung und Analyse von einem schwächeren Signal von dünnen Strukturen wie Axone stammen.
Zwei Anwendungen der Methode zur Kultur axonalen Degeneration ar studierene beschrieben; ein Modell der Entwicklungs Beschneiden und Modell Verletzungs-induzierte Degeneration (gemeinhin als Waller-Degeneration bezeichnet). Die Modellierung der Entwicklungs Beschneiden basiert auf der Tatsache, daß sensorische Neuronen in vivo für limitierende Mengen an Ziel-abgeleitete NGF und diejenigen weil es nicht genug neurotrophen Unterstützung degenerierten 14 empfangen Wettbewerb basiert. Dieses Phänomen kann in embryonalen DRG-Kulturen durch Abziehen von NGF aus den Kulturmedien, die, wie es in vivo auslöst axonale Degeneration, gefolgt von Zellkörper Zerstörung nachgeahmt werden. Waller-Degeneration zu modellieren, wird die obere Seite des Filters mit den Zellkörpern abgeschabt. Die Axone, die auf der Unterseite des Filters werden physikalisch von den Zellkörpern getrennt und danach die schnelle und stereotype degenerativen Prozess wie Waller-Degeneration 15 bekannt ist, nach A. Waller genannt, der als erster das Phänomen berichtet, im Jahr 1850 16 ziehen gewachsen.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council von Animal Care genehmigt. Alle Anstrengungen gemacht werden, um Schmerzen und Leiden der Tiere während der Verfahren zu minimieren.
1. Beschichtung der Filter
HINWEIS: Wenn Kultur Filtereinsätze in Vertiefungen der Multiwellplatten gelegt werden zwei Kammern definiert: die obere Kammer ist der Bereich oberhalb des Einsatzes und die untere Kammer ist der unterhalb des Einsatzes Fig. 1A.ab. Explantate werden im oberen Fach, wo sie an der Oberseite des Filters befestigen ausgesät; viele Axone wachsen durch den Filter erstrecken, und an der Unterseite des Filters, in dem Bodenfach Fig. 1A.c. Die Standard-Arbeitsvolumen (dh zum Auftragen von Beschichtungslösung, Waschanlagen, Kulturmedien, etc) sind 2 ml für das Bodenfach und 1 ml für die obere Fach und gehen, um im Protokoll als "bezeichnet werden, Standard-Bände ". Hinzufügen Lösungen, beginnend mit der unteren Kammer, indem die Spitze der Pipette in den Spalt zwischen dem Einsatz und der Seite der Vertiefung. Auch neigen die Einlage an einer Seite unter Verzicht auf die Lösung von Blasen auf der Unterseite des Filters eingeschlossen werden.
- Starten Sie die Beschichtung der Filter am Tag vor der Beschichtung. Unter der sterilen Gewebekultur Haube, legen 24 mm Filtereinsätze in einer 6-Well-Aufnahmeplatte. Einsätze inkubieren mit Poly-D-Lysin in Wasser (1 mg / ml) für 1 h bei RT unter Verwendung von Standardvolumen: 2 ml in der unteren Kammer und 1 ml in der Spitze.
- Saugen Poly-D-Lysin und einmal mit Wasser spülen. Saugen Sie Wasser, schließen Sie den Deckel, und die Platten in der Haube O / N. trocknen Während der Aspiration von Flüssigkeiten, stellen Sie sicher, einen Rest von Flüssigkeit, die direkt unter dem Filter aufgefangen wird zu entfernen.
- Am nächsten Morgen, verdünnte Laminin in Wasser (10 g / ml), mischen und warm bei 37 ° C Einsätze Inkubation mit Laminin 1 Stunde in cell bei 37 ° C, unter Verwendung von Standardmengen.
- Saugen Laminin und fügen Kollagen in Wasser (0,1 mg / ml) und Inkubation für 1 h bei RT. In diesem Fall verwenden 2 ml für das Bodenfach und 2 ml für den oberen Teil.
- Saugen Kollagen und einmal mit sterilem Wasser waschen. Die Filter sind nun bereit, Kulturmedien und DRG Explantate erhalten, wie in Schritt 3 beschrieben.
2. Dissecting Embryonale Spinalganglion (DRG) Explantate
- Betäuben eine 13-Tage-schwangeren weiblichen Maus durch eine IP-Injektion von Avertin (250 mg / kg). Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlende Hornhaut-und Pedal Rückzug Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Genickbruch.
- Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumenten und weiblichen Unterleib mit 70% Ethanol. Instrumente erlauben zu trocknen. Halten Sie die Haut am Bauch und schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aus.
- Entfernen des Uterus durch Ablösen von der Zervix und Eierstöcke. In einer Sterile Haube, entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und sammeln sie in einer Petrischale mit eiskaltem L15 Medien gefüllt. Halten Sie auf dem Eis.
HINWEIS: Siehe vorherige technische Berichte für weitere Informationen darüber, wie man Embryonen von 13 Tagen der Trächtigkeit 17,18 zu erhalten. - Unter dem Mikroskop zu legen, den Embryo auf einer Seite und mit kleinen Feder Schere, um den Kopf zu entfernen. Einen Einschnitt entlang den Seiten, um die Brust, Bauch, Gliedmaßen und Schwanz zu verwerfen. Halten Sie den Rücken mit der Wirbelsäule, lag Bauchseite nach oben und entfernen Sie alle inneren Organe.
- Mit kleinen Feder Schere, setzen die gesamte Rückenmark, indem die Wirbelsäule aus ihrer Bauchseite entlang der Mittellinie. Halten Sie die Karkasse unten mit einer Pinzette (# 3) und mit einem zweiten Paar, um das Rückenmark von seiner rostralen Bereich zu halten.
- Langsam und ziehen Sie das Kabel von den Wirbelhöhle und kneifen Sie DRGs aus dem Rückenmark mit ultra-dünnen Pinzette (# 5). Gruppe die DRGs auf gesammelt werdender Boden der Schale.
- Sammeln gruppiert DRGs durch Absaugen mit einer 200 ul Pipettenspitze, die abgeschnitten wurde, um seine Öffnung zu vergrößern. Legen Sie die DRGs in einem Rohr und lassen auf Eis, bis die DRG-Kollektion ist fertig.
HINWEIS: Weiß / transparent Tipps werden bevorzugt, weil DRGs nicht den Mauern dieser Spitze haften bleiben (im Vergleich zu Standard-gelben Spitzen). Flushing Spitzen mit Medien vor dem Gebrauch verhindert ferner, dass DRGs vom Kleben an seinen Wänden.
3. Saat und Pflege von Wurzel-Knotenrücken Explantate auf Filter
- Fügen komplette DRG Medien bei 37 ° C zu den beschichteten Einsätze mit Standard-Bände. Ergänzen Sie die Bodenfach-Medien mit 15 ng / ml NGF, während NGF frei halten die obere Fach.
HINWEIS: Obwohl NGF effizient diffundiert durch den Filter und seine Konzentration im Gleichgewicht innerhalb weniger Stunden haben wir beobachtet, dass die Anwendung von NGF auf die Bodenfach direkt vor der Aussaat axonalen Rendite der b deutlich erhöhtottom Oberfläche des Filters. - Übertragen Sie die DRGs aus der Tube auf die Filter mit einem 1000 ul Pipette mit einer Spitze getrimmt, um ihre Öffnung zu vergrößern.
- Zeichnen Medien in der Spitze 2-3x vor der Erhebung der DRGs. Dies verhindert ein Festkleben an der Innenseite der Spitze. Das gleiche Spitze kann für alle Vertiefungen wieder verwendet werden. Die Verwendung von ungefärbten Tipps (gegenüber Standard-blauen Spitzen) reduziert DRG Festhalten an der Oberfläche der Spitze.
- So übertragen DRGs, stellen Sie die Pipette in 800 ul. Saugen Sie ca. 200 ul Medium von der Oberseite des Filters, dann auf die DRG-haltigen Rohr gehen und Pipette eine kleine Menge auf und ab - auf DRGs, die auf den Boden versenkt haben resuspendieren. Saugen Sie das ganze Volumen und Pipetten DRGs Eintauchen der Spitze in der Mitte des Einsatzes.
- Sobald alle Einsätze geladen werden, schließen Sie den Deckel und Platte schwenken Sie die Platte 10x, leichte Schläge auf die Motorhaube Bank zwischen jedem Wirbel. Diese Bewegungen erhöhen axonalen Ausbeute, indem DRG Explantate Waschbecken undbefestigen des Filters. Dies hilft auch, verteilen Explantate gleichmäßig, so dass Axone aus verschiedenen Explantaten nicht überlappen.
HINWEIS: Die in den vorherigen Schritten beschrieben Explantation Impfvorgangs signifikant die Gesamtrate der Explantation Bindung an das Substrat (bis 75%) erhöht. Am wichtigsten ist, die Pipettiervorgang leicht verhindert Explantaten aus schwimmend auf der Oberfläche des Mediums statt sinken auf den Boden des Einsatzes. - Für biochemische Analysen, Samen DRGs von einem Embryo (ca. 30) pro Filter. Für morphologische Analysen, verwenden Sie entweder die Hälfte oder ein Drittel der DRGs von einem Embryo (10-15). Diese Entscheidung muss vor der Erhebung der DRGs in Rohre hergestellt werden, so dass alle DRGs eines Rohres in einem einzigen Well ausgesät (ob es 30, 15 oder 10 DRGs).
- Pflegen Kulturen in einer Zellbrutschrank bei 37 ° C, verändernden Medien alle 2-3 Tage. Um Medien zu ändern, saugen Sie den oberen Fach ersten, von der Bodenfach gefolgt. In frischem Medium in Standardvolumens, beginnend mit dem Bodenfach.
HINWEIS: Um Zellen / Axone Austrocknen zu verhindern, Medien in mehr als 3 Einsätze ändern sich nicht zur gleichen Zeit. DRGs auf Filter in Gegenwart von NGF gezüchtet wird Axone zu verlängern, die bis zu 2 mm nach 2 Tagen in Kultur.
4. Trophic Factor Entzugsbehandlung
NGF Rückzug induziert axonale Degeneration mit axonalen Fragmentierung (durch Phasenkontrast-und β-III-Tubulin bestimmt IF), die zuerst erscheint rund 12 Stunden nach der Entnahme. Komplette Fragmentierung wird von 36 h erreicht. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden.
- Nach der 2-Tages-axonalen Verlängerungsphase, ändern Sie Medien von oben und unten Fächer für Medien, die NGF fehlt und enthält Anti-NGF-Antikörper (1 ug / ml), um alle verbleibenden (oder endogen produziert) NGF maskieren.
- Zurück Platten zu Zelle Inkubator (37 ° C), damitNGF-Entzug induzierte Degeneration für die gewünschte Zeitdauer fort.
- Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7).
5. Axonal Trennung zu Waller-Degeneration herbei
Dieses Verfahren lässt die Axone auf der Unterseite des losgelöst von ihrer Zellkörperfilter, aber ansonsten unversehrt. Danach diese Axone schnell einzuleiten Waller-Degeneration. Axonal Fragmentierung (durch Phasenkontrast-oder β-III-Tubulin belegt IF) zuerst erscheint nach 3 h nach Durchtrennung; um 9 h, sind Axone völlig zersplittert und werden von dem Filter gelöst. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden.
- Kratzen Sie die Oberseite des Filters enthält gewachsen DRG Explantate, mit einem Zellschaber. Achten Sie darauf, die vollständige Entfernung von Top-Material, indem Sie Schaber in X-, Y-und KreisRichtungen.
- Entsorgen Sie die Medien aus dem oberen Fach mit den schwimmenden Explantate, die aus dem Filter gekratzt worden sind, und ersetzen mit 1 ml vorgewärmten, komplett DRG Medien mit NGF (10 ng / ml).
- Das Rückplatte Inkubator (37 º C) Zell Waller-Degeneration für die Zeitdauer von dem Endbenutzer ausgewählt ablaufen zu lassen.
- Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7).
6. Proteinextraktion von Axonal Proben
- Füllen Röhrchen (1,5 ml) mit 75 ul Laemmli-Probenpuffer. Halten Röhrchen auf Eis, während der Ernte Axone aus der gesamten Reihe von Filtern.
- Waschen Sie den Filter mit DRG Explantate in PBS und kratzen die Oberseite des Filters. Entfernen Sie den Einsatz aus der Platte, reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator und saugen Sie keine zusätzliche PBS aus den Ober-und Unterseite.
- Ort eingeben Kopfauf der Werkbank und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell. Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, unten nach oben. Einen Schnitt von dem Umfang zu der Mitte des Filters mit einer Schere.
- Platzieren Sie den Filter auf der Oberseite der Sammelröhrchen und mit einer Pinzette, drücken Sie die Mitte des Filters in den Schlauch. Während dies zu tun, sollte ein Trichter bilden. Drücken Sie die trichterförmige Filter mit dem Boden des Rohres, so daß er in Laemmli-Probenpuffer eingetaucht.
- Komplette Proteinextraktion durch Kochen der Rohre für 4 min. Entfernen Sie den Filter mit einer Pinzette auf der Oberseite nach unten in die Oberseite der Röhre legen und die Durchführung einer kurzen Spin (2.000 g für 15 sec). Die getrockneten Filter entsorgen.
- Beheben 10 ul der axonalen Proteinpräparat in einer SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot der Proteine von Interesse zu detektieren.
HINWEIS: Als Referenz eine axonale Herstellung von 20 Explantaten für 2 Tage gezüchtet und in 100 ul RIPA-Lysepuffer eine Proteinkonzentration von 4-6 habenug / ul.
7. Immunfluoreszenz-Untersuchung der Axone auf Filter
Die folgenden Schritte beschreiben die allgemeinen Manipulationen durchführen, wenn der Färbung auf Filtereinsätze, durch den Nachweis von β-III-Tubulin veranschaulicht. Fixiermittel, Inkubationszeiten, Konzentrationen und andere Angaben sollten für andere Antigen-Antikörperpaare optimiert werden.
- Nutzen bisher verwendeten 6-well-Platten, gründlich gereinigt, für die folgenden Waschschritte und die Inkubationen der Einsätze.
- Kurz waschen Einsätze in PBS. Beheben sie in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei RT auf Schüttler.
- Nach der Fixierung, kratzen und reinigen Sie die Oberseite des Einsatzes, um die Axone, die ausschließlich auf der Bodenfläche des Filter wuchs zu sammeln. Fahren Sie mit dem Standard-Inkubationen für IF.
- Einsätze inkubieren in Blockierlösung (TBS, 0,05% Tween 20, 5% Magermilch), unter Verwendung von Standardmengen, für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln.
- Übereinsätze zur primären Antikörper in Blockierungspuffer (anti-β-III-Tubulin, 1:5000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren O / N (~ 18 h) bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Zweimal in PBS (2 × 10 min bei RT) Waschen des ersten Antikörpers.
- Über fügt Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper in Blockierungspuffer (Ziege-Anti-Maus, 1:2000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren bedeckt von Licht für 2 Stunden bei RT unter leichtem Schütteln.
- In PBS (3 x 10 min bei RT) Waschen Sie den sekundären Antikörper 3x.
- Nach IF abgeschlossen ist, nehmen Einsatz aus, abgießen PBS aus dem letzten Waschen und reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator. Saugen Sie keine Flüssigkeit aus den Ober-und Unterseite.
- Ort eingeben Upside-Down auf der Bank, und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell.
- Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, von unten nach oben, und legen Sie auf Mikroskopie Rutsche. Overlay mit einem Deckglas und Leuchtstoffröhren-kompatiblen mounting Medien. Lassen Sie trocknen in Kühlraum, von Licht bedeckt. Untersuchen und Bilder zu erfassen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops.
HINWEIS: Wenn bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt sind, können diese Präparate Wochen mit minimalem Verlust an Fluoreszenz gehalten werden. - OPTIONAL: Alternativ, wenn Sie auf Filter, die aus dem Einsatz entfernt wurden, durchgeführt werden. Um das zu tun, kratzen und reinigen Sie die Oberseite der Filter direkt nach der Fixierung.
- Nehmen Sie Filter aus den Einsätzen mit einem scharfen Skalpell und Ort Axone Filter-up auf dem Boden einer sechs-Well-Platte.
- Danach durchführen Inkubationen für IF wie in 7,4-7,8 und 7.11 angegeben. Der Vorteil dieser Alternative ist, dass es speichert Reagenzien, da beispielsweise die Inkubation Volumina bis 500 ul (im Vergleich zu den 3 ml verwendet, wenn Filter direkt an den Einsätzen angefärbt, wie in 7,1-7,11 dargestellt) gehen.
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Representative Results
Dorsalwurzelganglion Explantate von E13.5 Maus wachsen weitgehend auf Filter nacheinander beschichtet mit Poly-D-Lysin, Laminin und Kollagen (1B, links), von bis zu 2 mm innerhalb von 2 Tagen in Kultur. Dieses Substrat Kombination ergibt besonders üppige Wachstum; andere Kombinationen ergeben Axone, die wesentlich kürzer sind (Abbildung 1B, rechts). Darüber hinaus DRGs auf Filtern beibehalten erweitern mehr und mehr als Axone DRGs auf Kunststoff 1C gewachsen.
Filter mit Poren von 1 &mgr; m im Durchmesser, in diesem Protokoll verwendet, behalten Zellkörper auf der Oberseite des Filters, während eine Neuriten durch die Poren zu wachsen und sich an der Bodenfläche. Dies wird deutlich durch Epifluoreszenzmikroskopie von Filtern für Kerne (DAPI) und β-III-Tubulin-1D gezeigt gefärbt. In intakten Filter ist es möglich, Zellkerne sowohl aus Neuronen und nicht zu beobachten,Nervenzellen in der Explantation Zentrum und einige Bestrahlungs von ihm konzentriert. Jedoch, wenn die Oberseite des Filters ist abgestreift, Kerne weg und nur Axone erfasst werden kann, auf dem Filter Unterseite.
Fig. 1E zeigt ein Beispiel einer Filterboden, der ursprünglich anhalt das Wachstum von ungefähr 17 Explantate. In diesem Beispiel wurde die Oberseite vor der Fixierung zu reinigen und somit die Immunfluoreszenzsignal stellt reines Axone auf der unteren Seite des Filters. Proteinextraktion aus axonalem Zubereitungen (Bodenseite des Filters) frei von Kernproteinen 1F zeigt, dass die Zubereitung frei von Zellkörpern. Alternativ, wenn mit RNA-Extraktion ist es möglich, die Reinheit des axonalen Herstellung durch Vergleich der Anwesenheit differentiell lokalisierten mRNAs (dh γ-Actin) zwischen Ganzzell-Lysaten und axonalen Zubereitungen bestätigen (wie von anderen 5 gezeigten
Entwicklungs Beschneiden von sensorischen Neuronen können in Filtern zur Nahrungsfaktor Entzug unterzogen modelliert werden. Nach 2-3 Tagen der Axon-Verlängerung in der Gegenwart von NGF, wird das Medium auf eine fehlende NGF aufweist und ein Anti-NGF-Antikörper, der verbleibende NGF 2A sequestrieren geändert. Bei der gewünschten Zeitpunkten werden die Filter für Biochemie oder Immunzytochemie verarbeitet.
2B zeigt typische Beispiele für Unterseiten der Filter für β-III-Tubulin gefärbt vor und nach der Entbehrung. Nach 12 Stunden der Entbehrung gibt es wenig axonalen Fragmentierung, obwohl einige Axone beginnen, Sicken zeigen. Es wird jedoch umfangreiche axonalen Degeneration nach 36 der Entbehrung erreicht.
Waller-Degeneration von Axonen Trennung der sensorischen Neuronen induziert wird leicht in Explantate auf Filter durch Abschaben der Oberseite des Filter gewachsen modelliert, so dass hinter dem distalen portion der Axone, die auf der unteren Seite des Filters 3A wuchs. 3B zeigt typische Beispiele der Unterseite von Filtern für β-III-Tubulin gefärbt vor und nach dem in-Filter-Axotomie. Nach 3 Stunden nach Axotomie, gibt es wenig Fragmentierung, obwohl einige Axone beginnen, Sicken zeigen. Nach 7,5 Stunden sind die meisten Axone fragmentiert oder ganz verschwunden. Vorbehandlung der Explantate mit Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD +, 5 mM, 30 min Vorbehandlung) schützt vor Waller-Degeneration am Filter induziert, da es in anderen in-vitro-und in vivo-Modellen 19.
Abbildung 1. Filtereinsätze produzieren große Mengen von reinem axonalen Zubereitungen. A) Ein Schema eines Einsatzes (a), eines Einsatzes in einem gut (b) undEndkonfiguration mit DRG-Explantaten (c). B) Die sequentielle Beschichtung der Filter mit Poly-D-Lysin, Laminin und Kollagen führt Explantate, die im Vergleich zu denen mit Poly-D-Lysin allein oder Poly-D gewachsen mehr und mehr Axone wachsen -Lysin und Kollagen. Die Bilder wurden von überlappenden Fliesen, Low-Vergrößerung von Bildern mit der Bildbearbeitungssoftware. C) Unter den gleichen Bedingungen hergestellt Substratbeschichtung, DRG Explantate auf Filter beibehalten zeigen deutlich mehr üppige Wachstum der Nervenfasern als Explantate auf Kunststoff. Gewachsen D) Die axonalen Vorbereitung durch Schaben erhalten die Oberseite des Filters ist frei von Zellkernen. E) Beispiel Axone, die von etwa 17 Explantaten stammen und auf der unteren Seite eines 24 mm Filter gewachsen. So viel wie 30 Explantate leicht wachsen in diesen Präparaten, was genug Material für axonalen gemeinsamen biochemischen Ansätzen. F) Immunoblots von Lysaten coll ektiert von Filterplatten gegenüber Böden zeigen, dass Histon-H3, ein Kernmarker wird auf die Filterplatten beschränkt. Der Gesamtproteingehalt wurde in den verschiedenen Proben normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Studie der axonalen Degeneration von Nahrungsfaktor Rückzug in Filtereinsätze induziert. A) Schema skizziert einen typischen NGF-Entzug Experiment. DRG Explantate wachsen umfangreiche Axone in Gegenwart von NGF und NGF degenerieren auf Entzug. B) Repräsentative Bilder in verschiedenen Vergrößerungen (5X und 20X Ziele) der axonalen Zubereitungen aus Explantaten in NGF erhalten oder von NGF beraubt für 12 oder 36 Stunden."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51795/51795fig2highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Das Studium der Waller-Degeneration von Axonen axonalen Trennung in Filtereinsätze induziert. A) Schema skizziert einen typischen Axotomie Experiment. Axon Trennen wird durch Abschaben der Oberseite des Filters, so abgetrennte Axone (ohne Zellkörper) auf der Unterseite. B) Repräsentative Bilder der axonalen Zubereitungen aus intakten Explantate oder nach 3 oder 7,5 Stunden nach der Durchtrennung in Gegenwart oder Abwesenheit erreicht von 5 mM NAD +. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wichtige Parameter, die bei der Anpassung dieser Technik nehmen sind die neuronalen Population, die untersucht werden sollen, ist das Substrat, Porengröße des Filters und Fläche. Alle diese Parameter beeinflussen die Spezifität, die Qualität und Quantität der Neuriten Zubereitung erhalten, und müssen durch den Anwender betrachtet werden. In den in diesem Protokoll angegebenen Beispiele die Verwendung von DRG-Neuronen hat den Vorteil, der sich nur Axone, wodurch ein reines (spezifischen) axonalen Zubereitung.
Axonale Wachstum von embryonalen DRG ist sehr schnell im Vergleich zu Neuronen aus dem Zentralnervensystem, so dass axonale Proben nach 2 Tagen in Kultur hergestellt werden. Die Porengröße von 1 &mgr; m hat sich als ausreichend kleinen Zellkörper wandert in die Bodenfläche, während eine effiziente Durchgang des wachsenden Axonen zu verhindern. Im Vergleich zu kleineren Größen (dh 0,4 um) es nicht zu verhängen Selektivität für dünne Axone.Für die Untersuchung von DRG-Explantaten, die 24 mm Filtereinsatz (für die Verwendung in 6-Loch-Platten) erzeugt ausreichende Mengen des axonalen Proteinprobe für die meisten Techniken, einschließlich Immunpräzipitation, die oft eine große Menge an Protein-Eingang. Jedoch sind kleinere Größen (dh Filtereinsätze für 12-Well-Platten) für einige Anwendungen geeignet, insbesondere bei Verwendung von dissoziierten Zellen und / oder Immunzytochemie.
Obwohl der Filtereinsatz effizient isoliert Neuriten aus den Zellkörpern zur Untersuchung, ist es wichtig zu beachten, dass beide Kammern den gleichen Kulturmedien, die Begrenzung der experimentellen Manipulationen Ganzzellbehandlungen. Andere Ansätze Isolation, einschließlich compartmentalized Campenot Kammern oder mikrofluidischen Kammern, ermöglichen eine differenzierte Behandlung der verschiedenen Fächer. Der Experimentator muss bestimmen, welche dieser Zellisolierungstechniken Raum am besten geeignet für ihre speziellen Versuchsdesign ist.
Natürlich kann die Isolierung Fähigkeit Filtereinsätze vorteilhaft über axonalen Degeneration sein. Zum Beispiel kann die Biochemie der Regeneration Wachstumskegel leichtsucht durch Abschaben der Unterseite des Filter mit erwachsenen DRG-Explantaten. Innerhalb weniger Stunden wird axotomisierten DRG Neuronen Wachstumskegel in der Bodenseite der Filter, die, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, kann dann für die Reinigung von regenerierenden Wachstumskegel Proteine isoliert werden, zu regenerieren. Darüber hinaus können die axonale Proben durch dieses Verfahren erhalten, indem andere als Western-Blotting biochemischen Methoden analysiert werden. Zum Beispiel kann Axone in RIPA oder CHAPS Lysepuffer lysiert werden, um eine Proteinprobe, die ferner Immunpräzipitation oder Pulldown Experimente 9 unterzogen werden kann erhalten. Alternativ kann axonalen Proben für die RNA-Extraktion verarbeitet werden, wie zuvor beschrieben 5.
Der Vorteil des Kultursystems dargestellt ist nicht auf sensorische Neuronen beschränkt. Zum Beispiel wird die kortikale Neuronen Dendriten und Axone, die Synapsen auf der unteren Seite des Filters 7 zu bilden, wird länger. So können reine Neuriten-Proben (mit Synapsen angereichert) werden isolated aus Zellkörpern für detaillierte biochemische Analysen von Prozessen, die ausschließlich in Synapsen zu nehmen. Die Verwendung dieser Technik ist einfach und hat keine ausstehenden kritischen Schritte. Jedoch ist axonalen Länge und Morphologie sehr empfindlich auf die Qualität der Beschichtung der Filter. Daher ist darauf zu achten, frische und homogene Beschichtungslösungen für die angegebenen Mengen an Zeit nutzen, um robuste und konsistente axonalen Proben zu erhalten. Der weit verbreitete Einsatz dieser Technik wird dazu beitragen, zu fördern unser Wissen über die Physiologie der Axone, die unter normalen Umständen und in Krankheit.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon cell culture inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon cell culture companion plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 µg/ml in water. Take 100x stock from -80 °C and thaw O/N at 4 °C |
| PureCol bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF antibody | Prepared in-house | As described in: Acheson, A. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991). | |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-tubulin antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) Bromophenol blue |
|||
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
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