Introduction
Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l'arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l'azione del grande GTPasi, dynamin, genera vescicole libere clatrina rivestite (CCV) 5,6. Questa interiorizzazione innesca un rapido smontaggio del mantello clatrina, permettendo componenti di essere riutilizzati per più cicli di CME.
La scoperta e la caratterizzazione delle proteine coinvolte nella CME è stata radicata nella Bioch tradizionaleemical, e le tecniche di microscopia genetiche 4-6,8. Questi test hanno chiarito i ruoli e punti di interazione di questi componenti endocitiche. Anche se molto utile per definire i componenti essenziali di macchinari traffico, questi test sono molto limitati a catturare il comportamento dinamico dei componenti CME o concentrazione del carico. Questa è una limitazione fondamentale, dal momento che CME è guidato dalla assemblea coreografia di serie di moduli proteici in passi definiti, e dal momento che i piccoli cambiamenti nelle dinamiche dei singoli eventi endocitiche può avere grandi conseguenze cumulative di endocitosi. Inoltre, dati recenti indicano che le singole controparti centrali possono differire sia nella composizione e nel comportamento, suggerendo che la regolazione fisiologica di questo processo è altamente spazialmente e temporalmente vincolato 9-14. Visualizzare singoli eventi endocitiche, dunque, è essenziale per capire il motivo per cui ci sono più proteine ridondanti coinvolte nel CME e b come queste proteine possano essere controllatisegnali fisiologici y per regolare il carico internalizzazione.
Qui si descrive l'uso di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) per osservare CME a livello della dinamica dei singoli CCP in cellule viventi. TIRFM si basa sulla differenza di indice di rifrazione tra il vetrino di vetro e l'ambiente fluido di cellule 15,16. Quando la luce di eccitazione è diretto verso le cellule in oltre l'angolo critico, si riflette internamente, creando un'onda evanescente che mantiene un campo sottile di illuminazione che si estende a circa 100 nm sopra il vetrino. Questo assicura che solo le molecole fluorescenti all'interno di questo ristretto campo sono entusiasti. In pratica, questo permette l'eccitazione di molecole fluorescenti sopra o vicino alla membrana plasmatica, e riduce al minimo la fluorescenza dalle parti interne della cellula. Ciò fornisce un rapporto segnale-rumore e asse z risoluzione significativamente superiore per visualizzare gli eventi alla membrana plasmatica, compared a modi di trasporto più comunemente utilizzati, come epifluorescenza convenzionale o microscopia a fluorescenza confocale. Abbiamo anche descrivono, ad un livello introduttivo e pratico, l'uso di un'immagine piattaforma di analisi comunemente usato per analizzare e quantizzare semplici caratteristiche morfologiche e dinamiche dei singoli eventi cargo endocitiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Espressione di fluorescenza Tagged CME Componenti in cellule in coltura
HEK293 cellule sono cellule modelli utili che sono stati ampiamente utilizzati per studiare biologia e GPCR endocitosi, e quindi sono utilizzati come modelli in questo protocollo. Utilizzare qualsiasi protocollo di trasfezione fornendo espressione uniforme senza sovraespressione e bassa citotossicità.
- Maniglia tutti coltura cellulare in una cappa a flusso laminare sterile. Riempire 4 pozzetti di una piastra 12 pozzetti con 1 ml di Dulbecco Modified supporto essenziale (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Da un pallone T25 confluenti di cellule HEK293 diluire 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, rispettivamente in ciascuno dei 4 pozzi.
- In alternativa, seminare le cellule ad una piastra multi-pozzo di dimensioni desiderate, secondo le istruzioni del produttore. Seed 0,4-2 x 10 4 cellule in una piastra 12 pozzetti. Far crescere le cellule durante la notte in una sterile 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità.
NOTA: Considerando che la crescita rates variano a seconda delle condizioni e linee cellulari, potrebbe essere preferibile seminare pozzi multipli per garantire confluenza ideale per la trasfezione il giorno successivo o la possibilità di effettuare trasfezioni in duplicato.
- In alternativa, seminare le cellule ad una piastra multi-pozzo di dimensioni desiderate, secondo le istruzioni del produttore. Seed 0,4-2 x 10 4 cellule in una piastra 12 pozzetti. Far crescere le cellule durante la notte in una sterile 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità.
- La mattina successiva, selezionare un pozzo che è ~ 70% confluenti per trasfezione (vedi Figura 1B). Se nessun bene ha raggiunto questo stato, aspettare un altro giorno.
NOTA: 70% di confluenza è l'ideale per HEK293 cellule. Trasfezione le cellule che sono risultati più sparse nella morte cellulare e la tossicità. Trasfettando over-confluenti cellule si traduce in scarsa espressione. - Aggiungere 60 microlitri di buffer CE (dal kit di transfezione), 400 ng di plasmidi che codificano taggato GPCR e / o componenti del macchinario clatrina, e 2,4 ml di Enhancer nella provetta da 1,5 ml, come descritto nel protocollo del produttore. Vortex per 2 secondi per assicurare la miscelazione sufficiente, e girare in una microcentrifuga a 2.000 xg per 2 secondi per raccogliere il liquido sul fondo.
- Aggiungere6 ml Effectene come descritto nel protocollo del produttore. Vortex per 2 secondi, e far girare a 2.000 xg per 2 secondi in una microcentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo. Attendere 20 minuti per consentire la formazione di micelle trasfezione complesse.
- Aspirare i media del bene da transfettate. Aggiungere delicatamente 0,8 ml di DMEM con 10% FBS alla miscela reagente di trasfezione e mescolare pipettando su e giù lentamente per ridurre la rottura delle micelle. Aggiungere i media e la miscela di trasfezione al pozzo molto lentamente dal lato. Aggiungere qualsiasi miscela di trasfezione rimanente dalla provetta al pozzo mediante una micropipetta.
NOTA: In alternativa, aggiungere un extra di 0,5 ml di DMEM con 10% FBS al pozzo transfettate per dare alle cellule nutrimento supplementare conseguente trasfezione più dolce e più bassa espressione transiente. - Riportare le cellule a 37 ° C incubatore per 5 ore.
- Aspirare il terreno contenente la miscela di trasfezione. Sostituire con 1 ml di DMEM con 10% FBS. Consentirele cellule a crescere durante la notte.
- Il giorno successivo, passare le cellule a coprioggetti non rivestiti, precedentemente sterilizzati in autoclave.
- Aggiungere 0,5 ml di tampone fosfato (PBS) con 1 mM EDTA in ogni pozzetto. In alternativa, utilizzare 0,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA. Lasciare in incubatrice per 1 min.
- Mettere 3 rotondo, sterile 25 millimetri coprioggetto nei pozzetti separati di una piastra da 6 pozzetti. Riempire ogni pozzetto con 2 ml di media. Spingere delicatamente il coprioggetto fino al fondo del pozzo per impedire alle cellule di crescere sul fondo del vetrino.
- Agitare manualmente il bene a sollevare le cellule dal fondo del pozzo. Aggiungere 1 ml di DMEM con 10% FBS per sospendere nuovamente. Distribuire le cellule sollevate dal 1 pozzetto di una piastra 12 pozzetti modo uniforme tra i 3 coprioggetti. In alternativa, le cellule piatto su 3 piatti dal fondo di vetro.
- Permettono alle cellule di crescere sui vetrini per almeno 48 ore prima di imaging. Assicurarsi che le cellule sono sparsi e piatta.
2.Imaging PCC e Cargo Dynamics Utilizzando TIRFM
- Anticorpi anti-FLAG Coniugato M1 con coloranti Alexa Alexa Fluor utilizzando kit Protein Etichettatura secondo il protocollo del produttore. In alternativa, gli anticorpi pre-coniugati possono essere acquistati.
- Pre-incubazione delle cellule con anticorpi ad una diluizione 1: 1000 in 1 ml di pre-riscaldato mezzo Leibovitz con 10% FBS, o Opti-MEM con 50 mM HEPES pH 7,4 e il 10% FBS per 10 min a 37 ° C (imaging medio), di etichettare GPCR FLAG-tag sulla superficie cellulare. Saltare questa procedura se le proteine fluorescenti geneticamente codificate, come GFP, sono utilizzati come tag (vedi la discussione per i dettagli).
- Trasferire il vetrino in una camera di live-cell imaging. In alternativa, per i piatti con fondo trasparente, aspirare i media anticorpo-etichettatura e aggiungere 700 ml di mezzo di imaging pre-riscaldato.
- Utilizzare un paio di pinze e piegare la punta di un ago calibro 25 in un gancio.
- Tenere un paio di pinze in mano dominante. Tenere l'ago piegato in OTHer. Girare l'ago fino a quando le curve gancio verso il vetro. Trascinare delicatamente l'ago, lato gancio verso il basso, sul fondo di un 6-pozzetti fino ad agganciarlo sul coprioggetti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del vetrino, come sarà staccare le cellule. Sollevare delicatamente il vetrino su dal fondo del pozzo. Bilanciare il coprioggetto contro la parete del pozzo per il supporto.
- Utilizzare le pinze per afferrare vicino al bordo del vetrino e spostare il lato della cella coprioggetto fino alla camera di imaging, e montare la camera. Aggiungere 700 microlitri (o quantità appropriata) di terreno di imaging pre-riscaldato. Maneggiare con cura i coprioggetti senza pressione per evitare fessurazioni o rotture.
- Trasferire la camera sul microscopio e mantenere la temperatura delle cellule a 37 ° C con un riscaldatore stadio o un incubatore chiusa.
- Portare le cellule a fuoco utilizzando un obiettivo ad immersione in olio o 60X 100X TIRF (1.45 NA o superiore). Immagine le cellule in epifluorescenza convenzionale o conmodalità focali di illuminazione (cioè non TIRFM) per identificare le cellule che esprimono i costrutti appropriati. Out-of-focus cellule sono quasi invisibili nel sottile profondità di illuminazione TIRF che rende difficile trovare il piano focale e le cellule.
NOTA: Alcuni sistemi usano gli stessi laser per TIRFM di immagine in epifluorescenza convenzionale, spostando l'angolo di incidenza del laser sopra l'angolo critico. Come importante precauzione di sicurezza, sempre consapevole della inclinazione del fascio laser, e sempre dirigere lontano dall'osservatore. - Fuoco fino alla superficie inferiore di una cellula che esprime finché il contorno della membrana plasmatica intorno alla cella scompare e appare il centro della cella. Questo è più evidente con una membrana plasmatica di proteine carico localizzate, come il recettore μ-oppioidi (vedere Figura 2A).
- Passare a immagini TIRF.
- Se si utilizzano gli stessi laser per l'imaging in epifluorescenza convenzionale, aumentare l'angolo di incidenza dellalaser fino fluorescenza fuori fuoco all'interno della cellula scompare, e nessun contorno della membrana plasmatica intorno alla cella è visto. (Confronta Figura 2C alle figure 2A e 2B)
NOTA: In TIRFM, spostando il piano focale, l'immagine di andare completamente fuori fuoco e / o debole, e il livello generale di fluorescenza diminuisce a causa della minore profondità di illuminazione. Pertanto, un metodo alternativo per passare illuminazione TIRFM è quello di mettere a fuoco al centro della cella in epifluorescenza confocale / convenzionale, quindi aumentare l'angolo di incidenza fino a perdere gran parte della fluorescenza, e quindi concentrarsi verso la membrana plasmatica. - Una volta in TIRFM, garantire il laser di eccitazione riflette attraverso l'obiettivo e non è visibile sopra l'obiettivo. Confermare questo controllando se il punto laser è visibile.
NOTA: In modalità epifluorescenza o confocali convenzionali, l'illuminazione laser è visibile sopra l'obiettivo,ad esempio sul soffitto. - Affinare la messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida. I principali componenti del macchinario endocitica, come ad esempio clatrina, saranno visibili in puncta. Regolare la messa a fuoco sul bene, in modo che il puncta sono tondi come possibile.
NOTA: Per i carichi membrana localizzata, regolare la messa a fuoco fine fino a quando il filopodia appaiono distinti. - Utilizzare un programma di acquisizione di salvare tutti i parametri di imaging, quali specchi e angolo TIRF. Fate questo per tutte le lunghezze d'onda necessarie.
- Se si utilizzano gli stessi laser per l'imaging in epifluorescenza convenzionale, aumentare l'angolo di incidenza dellalaser fino fluorescenza fuori fuoco all'interno della cellula scompare, e nessun contorno della membrana plasmatica intorno alla cella è visto. (Confronta Figura 2C alle figure 2A e 2B)
- Eseguire la scansione di tutto il coprioggetto per trovare tutte le cellule che esprimono i marcatori endocitiche desiderati: il recettore μ-oppioidi e l'adattatore di β-arrestina nell'esempio mostrato nella Figura 3A. Selezionare le celle che esprimono, ma non troppo-esprimono. Vedi di discussione per i dettagli.
- Una volta che le cellule sono identificati, acquisire immagini ogni 3 secondi per 10 min. Questo è sufficiente a catturare la vita di una controparte centrale, dal momento che la vita media di un CCP in HEK293 cellule impressi in queste condizioni è around 40 sec 10-11. Questo permette a circa 12-14 fotogrammi per osservare il PCC. Per esempio vedere film 1. Ripetere tutti i passaggi per celle aggiuntive di immagine.
3 Analisi di endocitica Dynamics da Verification Manual
Anche se la verifica manuale della vite PCC è fortemente limitata dal numero delle controparti centrali che possono essere rilevati, rimane ancora un mezzo preciso di rilevamento imperterrita dai cambiamenti globali a immagine e rilevazione artefatti. Vedi di discussione per i dettagli.
- Aprire il file in ImageJ. Le immagini vengono memorizzate come una singola pila di file tiff con canali interlacciati. Convertire immagini in hyperstacks. Vai a Immagine> Hyperstacks> stack HyperStack. Inserire il numero di canali acquisiti (cioè se di imaging β-arrestina e il recettore μ-oppioidi, entrano 2) Immettere 1 per Z pila (TIRFM è un unico piano), e il numero di fotogrammi del film (cioè un 10 min filmato a 1 fotogramma ogni 3 secondi is 200) nella finestra pop-up.
- Il formato HyperStack produce una finestra con due barre di scorrimento. Utilizzare la barra superiore per spostarsi tra i canali e il fondo di muoversi attraverso il tempo. Scorrere fino al canale della proteina le cui vite saranno analizzati.
- Spostarsi al fotogramma 10 o 15 del film di ridurre l'inclusione delle controparti centrali preesistenti la cui durata intera non sono visibili. Disegnare una casella ROI attorno a un punto scelto a caso.
- Contare il numero di fotogrammi uno spot è visibile.
NOTA: Vedere la Figura 3B e 3C per gli esempi di tre categorie morfologiche di eventi endocitiche 10,11,16-19.
4 Analisi di endocitica Dynamics tramite riconoscimento Obiettivo
Riconoscimento Obiettivo consente il rilevamento di quasi tutti i CCP impressi in una cella, ma può essere soggetta a errori a causa del rilevamento spurie di strutture errate. Vedi di discussione per i dettagli di pesatura i vantaggi e gli svantaggi di indirizzo eMetodo ach. Diversi programmi, compresi gli algoritmi custom-built, possono essere utilizzati per rilevare oggettivamente CCP. Questo protocollo descrive riconoscimento oggettivo delle controparti centrali utilizzano Imaris, un software di analisi delle immagini (vedi Materiali).
- Per iniziare, aprire il file di immagine RAW nel software di analisi delle immagini. Per impostazione predefinita, viene visualizzata un'immagine a colori unito. Utilizzare la finestra "Regolazione Display" per regolare la luminosità di un canale. Fare clic sul nome di un canale per modificare il colore visualizzato. Deseleziona la casella accanto al canale per evitare che il suo display (vedere la Figura 4A).
- Creazione di "macchie", cliccando sull'icona con macchie arancioni. Vedere la Figura 4B. Selezionare una regione di interesse (ROI) intorno alla cella. Vedere la Figura 4C. Utilizzare un ROI per escludere aree che erroneamente rilevare bordi d'attacco luminosi e targhe. Analizzare celle multiple con diversi livelli di espressione separatamente.
- Misurare il diametro di un posto per ProVide stime iniziali per l'algoritmo. Passare alla modalità "Slice", e fare clic su estremità polari di un punto per misurare il suo diametro. Vedere la Figura 4E. Fate questo per 4 o 5 macchie rotonde che sembrano indicativi di una CCP al culmine della sua stabilità, dopo la formazione e la prima scissione. Utilizzare queste misurazioni per calcolare diametro medio fino al decimo di micron.
- Rileva Spot. Tornare alla modalità "Superare". Selezionare il canale appropriato per la rilevazione. Inserire il diametro medio misurato, di solito 0,3 o 0,4 micron. Fare clic sulla freccia in avanti blu per quantificare i Spots. Vedere la Figura 4E. Se il diametro di macchie è sottovalutato, punti spuri di fluorescenza saranno identificati come macchie. Se il diametro è troppo grande, i veri spot saranno ignorati. Quando incerti, stimare un po 'più basso, e filtrare le rilevazioni errate tardi.
- Filtra Spot da Quality. Regolare il filtro per catturare il maggior numero possibile di macchie senza schienaleterra. Il filtro di qualità è selezionata per impostazione predefinita 20. Vedere la Figura 4F.
- Utilizzare la curva "Qualità" come guida per impostare una soglia appropriata. Spostare la soglia inferiore del filtro con il tasto sinistro del mouse per questo primo tuffo in curva. Questo è un buon punto di partenza per il filtro, in quanto questa posizione di solito affina il rilevamento di macchie visibili solo. Vedere la Figura 4F.
- Spot rilevati appaiono sul film sfere o centri pixel. Utilizzando la scheda "Colori", regolare il colore delle macchie di un colore a contrasto per rendere più facile per vederli. Scorrere il filmato di rivedere i punti in ogni fotogramma. L'obiettivo è quello di individuare il maggior numero possibile di spot per la totalità della loro vita.
- Eliminare le macchie dimmer o manualmente connettersi a continue tracce in seguito, in quanto non vengono rilevati anche attraverso il corso della loro vita.
- Rimuovere targhe luminose con un fil "Intensity"ter, se necessario. Fare clic sul segno più verde per aggiungere un nuovo filtro. Vedere la Figura 4F. Creazione di un filtro Intensità per filtrare dentro o fuori Macchie di un dato segnali di fluorescenza. Utilizzare la curva generata intensità, (analogo a Quality Curva discusso in 4.5) per impostare la soglia. Utilizzare il pulsante sinistro del mouse per rimuovere all'estremità sinistra della curva che rappresenta le macchie brillanti.
NOTA: Grandi strutture di placca sono di solito tra gli elementi più brillanti del cellulare, e sono facilmente esclusi con questo filtro. - Scorrere il filmato al fine di garantire che le controparti centrali vengono rilevati come macchie e placche brillanti non vengono rilevati. Figura 3D mostra una cella in cui il rilevamento delle controparti centrali (indicato con sfere bianche) è stato ottimizzato con il filtro di qualità e targhe sono state escluse con la qualità filtro.
- Ridurre i bordi delle celle luminose con il filtro di qualità. Oggetti luminosi possono ancora bisogno di essere rimosso manualmente, al passaggio successivo. Continuare con il blufreccia.
- Rimuovere macchie aberranti nella schermata Modifica Spots. Passare a "Selezionare la" modalità. Fare clic sul posto. Esso diventerà giallo. Fare clic su "Elimina". Fare clic sulla freccia blu per continuare a costruire l'algoritmo. Vedere la Figura 4G.
- Tracce di misura. Impostare i brani di "moto browniano." Il PCC non dovrebbe presentare alcun movimento diretto, solo alla deriva minima attraverso la membrana plasmatica. Questo algoritmo è più appropriato per quel movimento. Vedere la Figura 4H.
- Impostare il Max Distanza di un piccolo valore come 0,7 micron. Vedere la Figura 4H.
NOTA: L'impostazione di una piccola distanza minimizza il collegamento di macchie adiacenti e consente ancora per continuare il monitoraggio di uno spot cellulare tramite CCP o il movimento delle cellule. - Impostare Max Gap Size a 1 Questo permette una traccia di continuare se vi è un solo fotogramma mancante in successione. Fare clic sulla freccia blu per calcolare le tracce. Vedere la Figura 4H.
NOTA: Gdimensioni ap di più di 3 cause diverse tracce per essere correttamente collegati tra loro. - Passa pista visualizzazione di "Dragon Tail". Scorrere il filmato osservando la qualità del rilevamento. Se vengono collegati macchie adiacenti, diminuire il Max distanza inferiore a 0,7 micron. Se le macchie sono state interrotte troppo facilmente, aumentare la Dimensione Max Gap. Fare clic sulla freccia blu per creare tracce. Questo porta alla schermata brani filtro. Vedere la Figura 4H.
- Impostare il Max Distanza di un piccolo valore come 0,7 micron. Vedere la Figura 4H.
- Filtro Tracce e l'esportazione dei dati. Utilizzare un filtro "Intensity" per rimuovere ulteriori placche luminose. Utilizzare un filtro "Spostamento" per rimuovere endosomi che entrano nel campo TIRF. Usare cautela, come macchie più lunghi avranno spostamenti più lunghi pure. Fare clic sulla doppia freccia verde per completare il protocollo. Vedere la Figura 4I.
- Utilizzare la scheda Edit Tracce, con l'icona della matita, per eliminare i falsi positivi rilevazioni di tracce che non potevano essere rimossi dai filtri. Controllare discontinuities o falsi collegamenti. Per collegare due tracce, selezionarle utilizzando Ctrl-click sinistro, quindi fare clic su "Connetti" nella casella di modifica tracce. Per scollegare i brani in punti separati, selezionare un brano e premere "Disconnetti". Selezionare più punti con Ctrl + click sinistro e fare clic su "Connect" per creare una nuova traccia. Il metodo è lo stesso per l'editing di macchie, descritte in 4.5.7. Vedere la Figura 4J.
- Per esportare i dati, andare alla scheda statistiche. Fare clic sull'icona singolo disco floppy per esportare la statistica selezionata. Fare clic sull'icona che appare come una serie di floppy disk per esportare tutte le statistiche. La statistica "Track Durata" contiene la lunghezza delle piste endocitici. Vedere la Figura 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando live-cella TIRF microscopia abbiamo registrato le dinamiche endocitiche del μ-oppioidi-recettore (MOR), un recettore accoppiati a proteine G (GPCR) e la sua endocitica proteina adattatrice β-arrestina. Il costrutto β-arrestina stato trasfettate in una linea cellulare che esprime stabilmente MOR usando il protocollo descritto nella figura 1, e ripreso 96 ore dopo. Il MOR nella linea cellulare stabile è N-terminale contrassegnato con GFP sensibile al pH. Questa proteina fluorescente reagisce solo nel fluido extracellulare neutro. Inoltre, il MOR endocytoses solo una volta attivato da un agonista, e rimane altrimenti distribuita uniformemente attraverso la membrana plasmatica. Concentrandosi sulla membrana plasmatica aderenti che è seduto sul coperchio di vetro nei risultati di modalità confocale in una cella che viene riempito con una fluorescenza dim. Questo è diverso da un fuoco sul centro della cellula, in cui la membrana plasmatica è visto solo come un anello di fluorescenza intorno alla cella. Confronta sinistrae pannelli di destra in Figura 2A. Il passaggio a epifluorescenza convenzionale o TIRF con un angolo non corretta causa fuori fuoco fluorescenza a diventare evidente nelle stesse cellule, come mostrato nella Figura 2B. Quando l'angolo TIRF è corretta la membrana plasmatica è molto nitido, chiaro e luminoso e fuori fuoco fluorescenza non disturba l'immagine. Confrontare Figura 2C alle figure 2A e 2B.
L'immagine è chiara e nitida, perché il MOR è sulla membrana plasmatica aderenti, che è in gran parte all'interno del campo TIRF. Al contrario, β-arrestina rimane in un pool citosolico quando non è ancora reclutato per puncta endocitica, e appare confuso e fuori fuoco perché non è nel campo TIRF. Una volta che il MOR è attivata da un agonista, β-arrestina è reclutato alla membrana plasmatica, e sia β-arrestina e il recettore ridistribuire alle controparti centrali (Figura 3A e Movie 1 , Β-arrestina nel verde, MOR in rosso, overlay è giallo).
Le vite di questi cluster possono essere quantificati manualmente utilizzando i tre parametri per endocitosi completato come illustrato in Figura 3B. Le macchie che denotano CCP possono sia sparire completamente (vedi anche Figura 3C), "blink" on e off o "pizzicare fuori" una struttura più grande. Le ultime due condizioni rappresentano eventi che sono spazialmente troppo vicini per essere risolti come eventi separati. L'algoritmo di rilevamento Spot in Imaris è utile anche per quantificare le controparti centrali, come indicato nella Figura 4. Figura 3D denota CCP rilevata mediante Imaris, dopo il filtraggio per rimuovere le strutture placca non dinamici. Sfere bianche sovrapposte indicano i punti rilevati. Dimmer macchie che non potevano essere rilevati per tutta la loro vita sono stati esclusi con il filtro "Qualità".
">
Figura 1: Diagramma di flusso di trasfezione procedura. (A) In primo luogo, seminare una serie di diluizioni (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) su una piastra 12 pozzetti. Consentono alle cellule di crescere durante la notte. Il giorno successivo, cercare un bene che è di circa il 70% confluenti, e uniformemente distribuito, come illustrato. Questo è il bene che sarà trasfettate. (B) Aggiungere 60 ml di tampone CE e 400 ng di DNA in una provetta. Vortex per 10 secondi e centrifugare il liquido al fondo della provetta. Aggiungere 2,4 ml di Enhancer. Vortex per 2 secondi e centrifugare il liquido di fondo della provetta. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Aggiungere 6 ml di Effectene. Vortex per 2 secondi e centrifugare il liquido di fondo della provetta. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. (C) miscelare lentamente 0,8 ml di DMEM con 10% FBS con la trasfezione. Aggiungi a cellule precedentemente selezionato bene. Incubare le cellule per 5 ore a 37 ° C. Sostituire con frescoDMEM con 10% FBS.
Figura 2: Trovare il campo TIRFM. (A) La membrana plasmatica ripreso in confocale. Il pannello di sinistra raffigura cellule in confocale con una particolare attenzione al centro della cellula. La membrana plasmatica è visto solo come un "anello" intorno alla cella. Messa a fuoco fino alla membrana plasmatica basale, adiacente al coprioggetto provoca la cella da compilare con una fluorescenza dim. La membrana plasmatica "anello" non dovrebbe essere visibile nel campo TIRF più sottile. (B) La membrana plasmatica basale con un angolo TIRF profonda produrre illuminazione epifluorescenza convenzionale attraverso il campione. Questo illumina l'intera cella e molto fuori fuoco fluorescenza dalla parte superiore della cella è presente. (C) La membrana plasmatica in TIRF. Concentrandosi su filopodia aiuta a trovare questo piano. Si noti che èun piano unico liscia. Barre di scala sono 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione e quantificazione eventi endocitiche in TIRF. (A) Una cellula che esprime la μ-oppioidi-recettore (MOR) e β-arrestina prima e dopo l'aggiunta di un agonista che induce endocitosi. L'agonista provoca redistribuzione di entrambe le proteine a puncta endocytic. Barra della scala è di 10 micron. (B) Tre tipi di eventi endocitiche, visti visualizzando dinamiche Arrestin, coerente con morfologie precedentemente descritti. "Steady", un segnale costante che scompare rapidamente. Questo è il tipo principale, che indica che il PCC ha germogliato e ha lasciato il campo TIRF. "Blink", un segnale che lampeggia ad un segnale più basso e riappare nello stesso punto a causa di montaggio di un secondo CCP nello stesso punto. "Pinch off", una sporgenza tubolare si stacca un punto, quando due controparti centrali sono troppo vicini gli uni agli altri da risolvere come macchie distinte, e uno è processo di endocitosi. La scatola è 2 x 2 micron. (C) Visualizzazione clatrina-mediata endocitosi di MOR con risoluzione singolo evento. Due esempi che rappresentano la principale frazione di MOR eventi endocitiche vengono visualizzati. Le pagine sono ogni 3 secondi. La scatola è 2 x 2 micron. (D) Rilevamento di singoli eventi endocitiche utilizzando Imaris. Sfere bianche denotano CCP individuati come macchie. Rilevamento Spot è stato ottimizzato utilizzando un filtro "Qualità". Dimmer macchie che non possono essere rilevati per la totalità della loro vita sono state escluse anche con il filtro di qualità. Grandi strutture di placca che vengono mostrati ad essere inosservati sono stati omessi utilizzando un filtro "Intensity".ig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Obiettivo Il riconoscimento delle dinamiche degli eventi endocitiche utilizzando Imaris. (A) La finestra di regolazione del display, utilizzato per regolare la visualizzazione dell'immagine come descritto al punto 4.1. (B) Apertura del "Spots" costruttore algoritmo. Il costruttore viene visualizzata nella finestra sottostante. (C) Il primo passo del costruttore algoritmo Spots. Controllare "Spot Track (nel tempo)." Check "Segmento solo una regione di interesse", se necessario. Schermo (D) Selezione ROI. Vedere il punto 4.2 per i dettagli. (E) I più finestre necessarie per definire il diametro di uno Spot misurata. Pannelli rappresentano: il passaggio da Surpass alla modalità Slice utilizzando il Navigazione barra in alto, cliccando sulle estremità polari di un punto, in cui il diametro misurato visualizzato, in genere sul lato più a destra, dove inserire il diametro misurato. Vedere i passaggi 4,3-4,4. (F) Il filtro di qualità di cui al punto 4.5-4.5.3. (G) della finestra Edit macchie descritto in 4.5.7. (H) tracce di misura e visualizzazione tracce finestre, descritte in 4.6. (I) finestra Filtro Tracce descritto in 4.7. (J) Modificate le tracce finestra descritta in 4.7.1. schermata dei dati (K) Salva descritto in 4.7.2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui si descrive l'uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall'effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura quantità di proteine internalizzate, o elettronico localizzazione microscopica di proteine, monitorare i cambiamenti Ensemble di localizzazione delle proteine a tempi fissi . Questi metodi esistenti sono stati molto utili per identificare proteine che sono necessarie per il CME, ma non hanno la risoluzione spaziale e temporale che corrisponde alle scale fisiologici di CME o di altri processi traffico di membrana dinamica. Questo è importante, in quanto recenti evidenze suggeriscono che le controparti centrali sono eterogenei nella loro composizione proteica e dinamiche 9-12, e come CME è probabile rapidamente regolata in maniera spazialmente discreto. TIRFM cella Live offre la possibilità di analizzare CME a livello di spazialmente separato singolo CCP, in tempo reale, nelle cellule viventi.
Applicazione di successo di questo test potente si basa su due fattori chiave: la buona salute delle cellule e un'analisi approfondita dei parametri di CME. Per i primi, la corretta espressione delle proteine con tag e delle tecniche di microscopia minimizzando fototossicità sono critici. Le linee cellulari stabilmente esprimenti le proteine di interesse sono l'ideale, in quanto i livelli di espressione possono essere attendibilmente stimati. Noi marchiamo i recettori sia con Bandiera epitopi o SPH N-terminale tag 21-25. Anche se non strettamente necessario, entrambi i sistemi di etichettatura facilitano TIRFM di CME perché recettori possono essere selettivamente rilevati sulla membrana plasmatica all'inizio dell'esperimento. I componenti endocitiche aggiuntivi desiderati possono essere trasfettate in queste linee cellulari stabili. Il trprotocollo ansfection notare qui è ottimizzato per l'imaging CME utilizzando TIRFM. In primo luogo, si è adattato anche per e moderati livelli di espressione. Povero espressione richiede maggiore potenza laser per il rilevamento e aumenta il rischio sia per fototossicità e photobleaching. Inoltre, poiché questo test registra la scomparsa di puncta come CCP interiorizzate, i segnali bassi e photobleaching sono dannosi anche per l'analisi. Suggeriamo che, in queste circostanze, la durata totale e / o la frequenza delle immagini ridotte. In secondo luogo, la breve incubazione dei reagenti di trasfezione di cellule, l'intervallo tra trasfezione e l'esperimento, e il passaggio fresco di cellule trasfettate per coprioggetto prima di imaging, tutti garantire che le celle sono impressi in salute ottimale. In terzo luogo, questo assicura che la maggior parte delle strutture clatrina sono controparti centrali, e lenzuola non piane di clatrina o clatrina placche. In quarto luogo, questo protocollo minimizza over-espressione di componenti CME trasfettate, che è stato spettacolon alterare le dinamiche ECM 20,26.
Per le immagini a bassa fototossicità, è importante ottimizzare il sistema di imaging per la risoluzione ottimale e la massima sensibilità. L'ingrandimento dell'obiettivo e la dimensione del sensore della fotocamera dovrebbe essere abbinato a ridurre al minimo l'ingrandimento comprensione o oversampling e vuota. Una apertura numerica elevata (1.45 o superiore) obiettivo TIRF dovrebbero essere utilizzati per raccogliere il massimo di luce possibile. Noi acquisire immagini con una fotocamera del dispositivo accoppiato carica-elettroni moltiplicando per alta efficienza quantica, tempi di esposizione bassi, e le velocità di lettura veloce. Inoltre, per garantire la salute delle cellule, che vengono esposte in Leibovitz dei media, che viene tamponata indipendente di CO 2, ed è integrato con il 10% FBS, in una camera completamente chiusa impostato a 37 ° C. Perché TIRFM è alti obiettivi di apertura numerici utilizzati in grado di rilevare anche il minimo di luce ambientale altamente sensibile e, è fondamentale per creare un ambiente di imaging chiuso gratuitodalla luce esterna e vibrazioni che possono interferire con il piano focale bene.
E 'importante notare che i tempi di vita assoluti e le dinamiche della maggior parte dei componenti del CME variano fortemente a seconda del tipo di cellule, i livelli di espressione di proteine, temperatura, giorni dopo la placcatura, ed altre variazioni delle condizioni di coltura 7,10,14,17,20, 25,27. Questo si riflette nelle enormi variazioni nei tempi e distribuzioni osservate tra i diversi gruppi che utilizzano questa tecnica, una chiara limitazione di questo test. Inoltre, è possibile che le CCP sulla superficie inferiore della cella, ripreso in TIRFM, comportano diversamente dalla superficie superiore 23,25. Mentre è discutibile da cui superficie rappresenta esattamente una cella 'tipico' circondata da componenti della matrice extracellulare in un tessuto, le interpretazioni delle dinamiche del PCC visti da questa tecnica è necessario prendere in considerazione questa differenza di potenziale. La vera forza del saggio, dunque, consiste nel confrontare variazioni di dynamics di CCP, nelle stesse cellule in condizioni colturali identiche, dopo manipolazioni acute, tra cui il raggruppamento di molecole cargo, come GPCR in risposta all'attivazione. Questo confronto permette la normalizzazione delle modifiche alla stessa cella, controllando in tal modo per tutti i parametri di cui sopra che potrebbero indurre variazioni nel comportamento del PCC.
Noi di solito utilizziamo entrambe le analisi manuali e automatizzati, sopra descritte, per analizzare la durata degli eventi endocitici: verifica manuale e riconoscimento oggettivo utilizzando il software di analisi dell'immagine Imaris. Verifica manuale è Labor- e richiede molto tempo, in quanto è limitato dal numero di CCP un utente può contare, ma è probabilmente la tecnica più accurato disponibile. Un occhio umano allenato può facilmente continuare a tenere traccia di un CCP attraverso il movimento delle cellule, e cambiamenti di forma o di messa a fuoco, escludendo accuratamente placche e pixel difettosi. Può anche rilevare cambiamenti morfologici del PCC indicativo di Eva completatonti, come mostrato è Figura 3B e 3C. È indispensabile, tuttavia, che l'analisi rimane obiettiva possibile all'interno di questi vincoli. Ciò richiede la definizione di criteri specifici che vengono utilizzati in modo coerente in tutti i set di dati. Inoltre, di solito analizziamo le immagini in modo doppio cieco, in cui i nomi delle immagini sono criptati in modo che le condizioni rimangono sconosciute alla persona analizzando le immagini. Rilevamento automatico, ad esempio utilizzando le "macchie" e "Track Durata" algoritmi Imaris, può essere utilizzato per rilevare la maggior parte dei luoghi endocitici in un dato film, generando un numero elevato di esempio. Mentre molte opzioni, tra cui altamente complessi algoritmi di misura 3,14,23,26,27, vengono generati, l'affidabilità di questi metodi per individuare corrette eventi endocitiche evitando rilevazione spuria rimane la più grande preoccupazione. Ad esempio, in Imaris, il movimento delle cellule creando bordi d'attacco luminose, targhe, e fuoricornici di messa a fuoco possono facilmente buttare fuori l'algoritmo di punto di rilevamento, in quanto ha la tendenza a rilevare strutture luminose come composta completamente di macchie. Per evitare queste macchie siano collegati in una traccia, devono essere tutti rimossi. Macchie aberranti singoli che non sono in grandi strutture come le placche possono essere rimosse con la modifica Spots scheda, mentre macchie collegati possono essere rimossi in seguito usando il comando Modifica scheda Tracks. Le macchie aberranti possono essere rimossi con filtri personalizzati. Ad esempio, la Figura 3D mostra un filtro di intensità utilizzata per limitare evitare di includere placche nel rilevamento CCP. Il filtro di qualità è un altro filtro molto utile per l'eliminazione di macchie errate. "Qualità" è una misura cumulativa di luminosità e forma trovata prendendo l'intensità di fluorescenza della macchia e filtraggio gaussiano di ¾ della lunghezza del raggio punto 20. La curva di Qualità si trova sotto i filtri selezionati. Rappresenta il numero di punti (y) rilevataquando la qualità è un certo valore (x). Più bassa è la qualità, più punti rilevati. Se il filtro di qualità è troppo bassa, i punti vengono rilevati in assenza di fluorescenza visibile, viceversa, se il filtro è troppo elevata qualità, verranno rilevate solo le macchie brillanti. Seguire lungo la curva verso valori maggiori (x); il numero di punti rilevati (y) in genere scendere drasticamente. Spostare la soglia inferiore a questo punto. Questo è il punto di minimo per posizionare la soglia inferiore. Altri contributi importanti a falsi punti in campo TIRF sono endosomi che si muovono alla periferia della cellula ed entrano nel campo TIRF. Un criterio robusto per rimuovere questi è la mobilità di macchie, cioè lo spostamento di punti nel tempo. CCP muove molto poco se non come parte del movimento di tutta la cella, mentre endosomi mostrano veloce movimento browniano o diretto. Algoritmi più recenti, mentre notevolmente migliorata, sono ancora in fase di perfezionamento e ottimizzati 3,14,23,26,27. Poiché questi sono incontratihods diventano sempre più sofisticati e affidabili, possiamo analizzare centinaia o migliaia di punti, senza doverli verificare manualmente in ogni punto. Attualmente, tuttavia, suggeriamo che queste due analisi essere utilizzati insieme per completarsi a vicenda per la precisione.
Il protocollo che abbiamo descritto può essere facilmente adattato a rispondere a molte domande riguardanti il carico endocitosi. Può essere utilizzato per eseguire semplici co-localizzazione dei carichi con componenti CME, e utilizzato per mostrare le modifiche sui componenti specifici del macchinario endocitica dovuto a particolari stimoli. Il dosaggio può essere facilmente adattato per qualsiasi processo endocytic, come caveole 28, che mostra le concentrazioni di componenti discreti carico e cappotto, e lo studio di questi processi fondamentali tipi di cellule specializzate. In futuro, come la modifica del genoma diventa più mainstream 20,29,30, prevediamo che diventerà il metodo preferito per la codifica dei componenti, e che la dinamica e il comportamento of vari componenti saranno ulteriormente perfezionati. Considerando che la nostra comprensione dei processi cellulari è stata in gran parte determinata dalla identificazione di geni, proteine, modifiche e interattomi, il saggio abbiamo descritto qui rappresenta una delle prossime frontiere della ricerca, vale a dire. la definizione delle dinamiche spazio-temporali di questi processi e meccanismi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
