Abstract
La plupart des processus morphogénétiques dans l'intestin du foetus ont été déduites à partir des coupes minces de tissus fixés, présenter des instantanés de changements au cours des stades de développement. Des informations en trois dimensions à partir de coupes sériées minces peut être difficile à interpréter en raison de la difficulté de reconstituer des coupes en série et parfaitement maintenir l'orientation correcte du tissu sur coupes sériées. Les études récentes de Grosse et al., 2011 soulignent l'importance des trois dimensions informations pour comprendre la morphogenèse des villosités de l'intestin en développement 1. Reconstruction tridimensionnelle de cellules intestinales individuellement marqués ont démontré que la majorité des cellules épithéliales de l'intestin contact avec les deux surfaces apicales et basales. En outre, la reconstruction en trois dimensions du cytosquelette d'actine à la surface apicale de l'épithélium a démontré que la lumière intestinale est continue et que les lumières secondaires sont un artefact de sectioning. Ces deux points, ainsi que la démonstration de la migration nucléaire interkinetic dans l'épithélium intestinal, définis l'épithélium intestinal en développement un épithélium pseudo et non stratifiées comme le pensait auparavant 1. La capacité d'observer l'épithélium en trois dimensions a été décisif pour démontrer ce point et la redéfinition de la morphogenèse épithéliale dans l'intestin du foetus. Avec l'évolution des technologies d'imagerie multi-photonique et logiciel de reconstruction tridimensionnelle, la capacité de visualiser intact, le développement des organes s'améliore rapidement. Excitation à deux photons permet une pénétration moins dommageable plus profondément dans les tissus à haute résolution. Imagerie à deux photons et la reconstruction 3D de l'ensemble des intestins de souris fœtales à Walton et al., 2012 ont contribué à définir le modèle de villosités excroissance 2. Nous décrivons ici un ensemble de système de culture d'organe qui permet le développement ex vivo de villosités et extensions de ce système de culture pour permettreles intestins pour être en trois dimensions imagé au cours de leur développement.
Protocol
NOTE: Toutes les souris ont été traitées avec humanité en utilisant des protocoles approuvés par l'Université du Michigan Medical School Unité de médecine de laboratoire et les animaux selon les directives du Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux.
1 Tout le Système de culture d'organes
- Préparation des milieux et des plaques de culture
- Dans une culture de tissu capot, enlevez 5 ml de BGJb médias de la bouteille de et ajouter 5 ml de Pen / Strep. Préparer un stock de travail des médias dans un tube conique de 50 ml, en ajoutant 1 ml de 5 mg / ml d'acide ascorbique à 49 ml de BGJb médias (avec Pen / Strep).
- Préparer une plaque de culture à 6 puits en ajoutant 1 ml de chacune des sous transwell.
NOTE: Si les 6 transwell ne sont pas utilisés, déplacer transwell supplémentaires dans une plaque à 6 puits stérile frais pour une utilisation ultérieure. Ajouter 3 ml de travailler BGJb médias à chacune des trois boîtes de Pétri de 10 cm stériles.
- Préparation pour la dissection
- Faire tremper les outils de dissection dans 70% ethanol et être sûr de garder les outils propres tout en travaillant.
- Mettre en place la zone de dissection avec un grand seau à glace et placer la plaque de culture à 6 puits et 10 cm boîtes de Pétri avec BGJb médias sur la glace. Travailler sur la glace autant que possible, tout en disséquant et la préparation des intestins de la culture.
- Anesthésier les souris femelles adultes dans une chambre avec isofluorane (100 pi) avant l'euthanasie par dislocation cervicale pour la récolte de l'intestin du foetus.
- Après la récolte, les fœtus de leur mère, en scène chaque fœtus soigneusement selon le tableau 13 Theiler mise en scène. Ne vous fiez pas aux jours post-coït pour déterminer l'âge de chaque fœtus comme des variations allant jusqu'à 24 heures dans le stade de développement sont régulièrement observés dans une seule portée.
- Dissection de l'intestin du foetus
- Euthanasier fœtus par décapitation avant le retrait de l'intestin.
- Disséquer chaque intestin en tampon phosphate salin (DPBS) de 1x Dulbecco puis plaCE dans une boîte de Pétri de 10 cm de travailler BGJb médias.
- Retirez délicatement la rate de l'estomac et le pancréas de l'estomac et du duodénum supérieur.
- Séparez délicatement l'épiploon prenant soin de laisser l'épiploon attachée autant que possible et en séparant seulement assez de connexions pour permettre à l'intestin pour être redressé.
NOTE: Pour les intestins plus que E14.5 ou ceux qui sont mis en culture pendant plus de 24 heures, séparer délicatement l'intestin en 3 segments égaux pour permettre contenu luminal de couler à travers l'intestin et être expulsés des extrémités coupées. Toutefois, pour les cultures commencé avant E13.5, attendre après 24 heures de culture avant de se séparer les 3 segments de l'intestin pour permettre la séreuse de croître correctement sur toute la longueur de l'intestin. - Utilisez une pipette de bouche pour transférer les morceaux intestinales sur les transwell de la plaque de culture (1.1.2).
- Repositionner délicatement les intestins au besoin afin qu'ils soient directement à travers la transwell.
NOTE: Une fois que les intestins commencent à s'installer contenu luminal dans le tube, les plier dans l'intestin entraînera une sauvegarde et des dommages à l'intestin.
- Culture et le traitement
- Retirez le support sous le transwell, ajouter 700 ul de milieu de traitement (médias travaillent avec des protéines recombinantes ajoutés ou des inhibiteurs pharmacologiques) dans le cadre du transwell.
- Ajouter 300 ul de milieu de traitement goutte à goutte sur le dessus de l'intestin et laisser tremper à travers le transwell. Repositionner les intestins comme nécessaire.
- Changer agents de traitement au moins une fois par jour ou plus souvent fonction de la demi-vie du réactif de traitement.
- Préparation de protéine des billes d'agarose imprégné d'une source localisée de réactif de traitement
- Remettre en suspension les billes d'agarose dans leur conteneur de stockage et transférer 100 pl de billes d'agarose dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- Remplir le volume restant du tube avec 1x stérile Phosphate solution saline tamponnée (PBS) et mélanger les perles pour les laver. Placez le tube de centrifugeuse dans un rack pendant quelques minutes pour permettre aux billes de se déposent au fond et puis pipette au large de la PBS à partir au-dessus des perles. Remplir le tube de centrifugeuse stérile de PBS 1x et répéter deux fois plus le processus de lavage.
- Préparation de la protéine d'intérêt à deux fois la concentration désirée pour le traitement.
- Mélanger 5 pi de billes d'agarose lavés avec 5 pi de la protéine actions 2x et agiter doucement les perles dans la protéine. Placer le tube sur la glace pendant 1 heure, en mélangeant délicatement toutes les 10-15 min.
- Rincer les perles brièvement stérile 1x PBS avant de placer les perles sur les intestins.
- Placement des billes d'agarose
- Placez délicatement les billes d'agarose sur le dessus de l'intestin à l'aide d'une pipette de bouche avec des aiguilles capillaires tirés. Placez les perles avec une extrême prudence, car une manipulation brutale peut endommager l'intestin et prévenir le développement des villosités dans la zone lésée.
- Placez deux fois plus de billes que nécessaire pour l'analyse depuis les intestins vont subir les mouvements péristaltiques et environ la moitié des billes placées roulera hors de l'intestin au cours de la durée de la culture.
- Fixation des intestins culture
- Retirez délicatement les médias de traitement de dessous de la transwell et permettre aux intestins sécher à l'air pendant 3 min.
- Ajouter 1 ml de fixatif sous la Transwell pendant 2 min, puis recouvrir la partie supérieure de l'intestin avec 2 ml de fixatif pour le reste de la période de fixation. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde O / N à 4 ° C ou pendant 2 heures à température ambiante.
2. imagerie de l'intestin fixes
- Imagerie Wholemount
- Placez les intestins entiers (avec fluorescence endogène) sur une diapositive avec 100 pi de 1x DPBS. Utilisez une pince à organiser doucement les intestins.
- Utilisez un tissu de laboratoire pour retirer soigneusement les DPBS et ajouter immédiatement 100 pi de 70% de glycérol à faire la mo tissure transparente et augmenter la profondeur possible de l'imagerie.
REMARQUE: Si une plus grande pénétration de l'intestin est souhaité, au lieu de monter l'intestin dans 70% de glycérol, tremper l'intestin dans quelques gouttes d'orientation claire solution pour 10-30 min. Pipeter au large de la solution mise au point claire et monter l'intestin avec le Mont Effacer. - Tremper chaque des quatre coins d'une lamelle en pâte à modeler et ramasser une petite quantité d'argile à utiliser comme entretoises entre la lame et lamelle pour maintenir la lamelle de l'aplatissement de l'intestin.
- Sceller la lamelle sur la lame avec valap fondu appliquée avec un coton-tige.
- L'image sur les intestins soit un microscope confocal debout ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails.
- Vibratome sectionnement de l'intestin fixes (pour une vue en coupe transversale de structures intestinales)
- Intégrer dans les intestins 7% d'agarose dans de petits moules en plastique (10 x 10 x 15 mm) et permettre aux blocs d'agarose àrefroidir et se solidifier.
- Retirer des blocs d'agarose à partir de moules en plastique et des blocs d'agarose colle à l'étape de collecte de vibratome avec de la colle instantanée.
- Remplir le stade de la collecte de froid de glace 1x DPBS.
- Couper des sections à une épaisseur comprise entre 100-150 um. Pour les sections plus épaisses utilisent les solutions de compensation (décrits dans la section 2.1.2) pour visualiser plus profondément dans la section.
- Verser vibratome sections de l'étape de la collecte dans un puits d'une plaque à 6 puits pour le stockage à 4 ° C.
- Immunofluorescence, de tissus vibratome sectionnés fixes
- Placez 5-12 sections vibratome par puits dans une plaque de 24 puits avec 1x DPBS.
- Retirer 1x DPBS et ajouter 500 ul de solution de perméabilisation par puits. Secouez délicatement les échantillons pendant 25 min à température ambiante.
- Après perméabilisation, laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X.
- Bloquer les échantillons pendant au moins 30 min dans 500 pi de solution de blocage.
- Après blocage, eXCHANGE la solution de blocage avec 500 ul d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et conserver les échantillons à 4 ° CO / N.
REMARQUE: Les dilutions d'anticorps primaires qui fonctionnent bien sur des coupes congelées et paraffine fonctionnent généralement bien sur vibratome sections aussi, cependant anticorps nécessitant l'extraction de l'antigène nucléaire en général ne fonctionnent pas bien avec ce protocole (par exemple, BrdU). - Le jour suivant, laver les échantillons 3 fois pendant 15 min à chaque fois avec une solution de blocage.
- Après lavage, 500 ul d'appliquer l'anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage. Enveloppez la plaque de 24 puits dans du papier d'aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et de la roche les échantillons pendant 45 minutes à 2 heures à température ambiante.
- Laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X pendant 15 minutes chacun et monter les sections de vibratome sur des lames comme décrit à la section 2.4.
- Montage sections vibratome
- Préparer des lames pour vibratome de montage par couper de fines tranches de double-stick bande et en les plaçant sur les côtés longs des lamelles.
- Placez délicatement 5-10 sections vibratome entre le ruban adhésif double-bâton sur les lames dans une goutte de 100 pi de PBS 1x.
- Déplier toutes les sections et les étaler en une seule couche sur la diapositive.
- Retirez tout excès d'agarose ou des morceaux inégaux qui empêcherait une lamelle de siéger plat.
- Soigneusement utiliser un tissu de laboratoire pour absorber l'excès de PBS 1x autour des sections de vibratome.
- Ajouter une goutte de milieu de montage aqueux sur des sections de vibratome et lamelle.
- Sceller les lamelles sur les lames avec fondu valap appliquée avec un coton-tige.
- Image, les sections de vibratome sur soit un microscope confocal droit ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails sur la sélection d'un système d'imagerie.
3. imagerie en direct de l'intestin entiers
Intestins récolté de fetuses après E12.5, avec l'épiploon connecté laissée intacte, développer avec succès villosités en culture en utilisant le système ci-dessus. Par conséquent, ce système ex vivo permet la capture d'images en direct z-section de l'intestin de développement qui peut être reconstituée pour une vue en trois dimensions de la morphogenèse au cours du temps.
- Mise en place d'imagerie en temps réel
- Utilisez de la colle instantanée à respecter une membrane de polycarbonate individu à un tamis à mailles fines. Cela fournit un échafaudage de support pour maintenir l'intestin en place sous l'objectif de trempage du microscope confocal verticale. S'il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus de détails sur la sélection de microscopes d'imagerie en direct.
- Placer le tamis dans le puits central d'une plaque de culture.
- Placer l'intestin disséqué sur la membrane de polycarbonate et on ajoute une goutte de colle instantanée à chaque extrémité. Utilisez seulement assez de colle pour fixer l'intestin, mais pas l'enduire!
- Ajouter culture libre de médias de phénol rouge ci-dessous le polycarbonatemembrane dans le puits central de la plaque de culture.
- Ajouter de l'eau à la bordure extérieure de la plaque de culture à fournir de l'humidité.
- Depuis l'intestin foetal subit ondes péristaltiques analogues de contraction dans la culture, ajouter 100 ul d'une solution 1: 5 de xylazine dans du PBS 1x à 3 ml de milieu à contrôler les mouvements de l'intestin, tandis que l'imagerie. Cette posologie sera de contrôler les mouvements intestinaux pour environ 8-10 heures sans compromettre le développement des villosités.
- Pour une vue transversale de l'intestin, intégrer les intestins vivants dans une solution d'agarose à 3-4% et couper des sections épaisses (150-500 de um) sur un vibratome. Correspondre à la rigidité de l'agarose avec la rigidité de l'intestin étant déterminée empiriquement et couper le stade de développement. En général, une solution d'agarose à 3% fonctionne bien pour les intestins de moins de E14.5 et une solution à 4% fonctionne bien pour les intestins E15-E16.
- Coller les sections de vibratome à une membrane de polycarbonate, apposée sur un tamis à mailles (comme dans la section 3.1.1) etculture comme décrit dans la Section 3.1.2-3.1.6.
- Effectuer l'imagerie en temps réel en utilisant un microscope confocal à fluorescence à deux photons (laser d'excitation entre 690-1,040 nm) sur un support vertical avec une table réglable.
- Laser à deux photons réglé à 900 nm permet une pénétration profonde avec la meilleure résolution pour les signaux de GFP. Il réduit les dommages aux tissus en imagerie. En outre, le réglage de la puissance du laser pour l'émission le plus bas possible pour réduire les dommages des tissus. En général pour obtenir une bonne excitation de la GFP, en utilisant 12% de la puissance du laser à deux photons.
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Representative Results
Culture des explants entiers de l'intestin fœtal permet l'analyse de la localisation, la distribution, et la durée des molécules de signalisation qui coordonnent le développement intestinal, comme ce système permet la manipulation de la signalisation avec des réactifs pharmacologiques ou des protéines recombinantes. Le système de culture Transwell (Figure 1A, reproduit à partir de Walton et al., 2012) 2 fournit une interface air-liquide, ce qui permet de placer la drogue ou de protéines trempé billes d'agarose sur le tissu, ce qui établit des sources de signalisation locale (figure 1B ). Intestins récoltées à partir d'embryons à E10 à a 18,5 survivre en culture sur transwell et subissent des vagues péristaltique comme de mouvement. Intestins ont commencé dans la culture de E13.5 survivre environ 10 jours ou plus ou moins à P3, le stade de développement de la souris lorsque la formation crypte est d'abord observé. Bien que les intestins à un stade précoce survivent dans la culture, les intestins récoltées avantE12.5 n'émergent pas villosités fiable, probablement parce que la séreuse n'a pas augmenté pour couvrir complètement l'intestin par ce temps. grappes mésenchymateuses se forment et villosités commencent à émerger et d'allonger dans les intestins ont commencé dans la culture à E12.5, E13.5 E14.5 ou, si le développement est légèrement retardée par rapport aux témoins non cultivés, étape appariés (Figure 1, reproduites à partir de Walton et al., 2012) 2. Quel que soit le stade de l'intestin au début de la culture (E12.5 E14.5-), les intestins apparaissent toujours avoir un délai approximatif de 24 heures. Intestins E14 en culture pendant deux jours montrent que la croissance des villosités sont plus proches de ceux de l'intestin E15 que les villosités de l'intestin E16 cultivées in utero (figure 1C-F) 2.
Le motif régulier de groupes mésenchymateuses est révélée par la reconstruction en trois dimensions de sections optiques d'un ensemble récepteur PDGFRa GFP / + intestin à E15.5 (Figure 2 </ Strong>, reproduit à partir de Walton et al., 2012) 2. Cette image se compose de z-piles de 54 champs de vue qui ont été cousues ensemble par le logiciel Leica LAS-AF. Chaque spot intérieur de l'intestin est un cluster mésenchymateuses visualisé par GFP étiqueté nucléaire exprimée à partir du locus PDGFRa 14. La haute résolution de l'image permet au spectateur de zoom avant pour certaines zones à examiner les détails, mais fournit en profondeur les relations spatiales qui ne peuvent pas être tirées à partir des champs de vue uniques ou inférieure grossissement de puissance. Film 1 est une série parcourant le z cousu -stack images 3D qui sont reconstruites sur la figure 2. les sections optiques individuels permettent en outre la visualisation d'informations tels que les cellules individuelles à l'intérieur des groupes.
Sections optiques de immunofluorescence wholemount de la vascularisation intestinale avec PECAM anticorps (BD Pharmingen 557355; dilué 1: 1000) ont été capturées à l'aide excitation à deux photons et reconCONSTRUIT avec Imaris logiciel (figure 3). Cette vue en trois dimensions des vaisseaux sanguins intestinaux révèle un réseau complexe de vaisseaux qui ne peuvent pas être pleinement apprécié par de minces préparations de section. Films 2, une projection tridimensionnelle en rotation de l'image reconstruite sur la figure 3, permet une nouvelle appréciation de la façon dont la amélioration de l'information fournie par la reconstruction tridimensionnelle peut améliorer la compréhension des motifs de structure.
Vibratome sectionnement permet de visualiser en trois dimensions de l'intestin à partir d'une vue transversale. Dans la figure 4, la relation entre les pôles de développement (marqué par PDGFRa GFP / +) 14 avec l'épithélium et mésenchyme entourant (marqués d'une membrane de tomate (Rosa26 mT / mg) 15 est observée.
Sinon, cette relation peut être consulté par immunofluore anticorpsscence coloration (figure 5) des pôles mésenchymateuses (vert, marqué avec un anticorps anti-PDGFRa (SantaCruz C-20, dilué à 1: 200)) avec l'épithélium (rouge, marqué avec un anticorps anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181, 1: 1000 dilution).
L'ensemble de ce système de culture d'organe peut aussi être étendue pour permettre l'imagerie à deux photons de développement fœtal intestins. Dans cette configuration, l'intestin foetal est collé sur une membrane de polycarbonate supporté par un tamis à mailles dans une plaque de culture à plus grande (figure 6). La taille plus grande du puits de la plaque de culture permet de lentilles de microscope confocal à communiquer avec l'intérieur de l'intestin ainsi.
Figure 1. Développement de l'intestin fœtal entières dans un système de culture Transwell. (A) des intestins fœtaux placés sur une mem transwellbrane dans une plaque de culture à 6 puits avec BGJb médias. Top deux intestins sont E12.5, fond deux intestins sont E13.0. (B) albumine imbibé billes d'agarose de sérum bovin (bleu clair) placés sur un duodénum dans le système de culture transwell. La tache bleue foncée est coloration X-gal pour Ptc LacZ / + dans les pôles de mésenchymateuses marquage ligne journaliste de la souris Hérisson 16. (CF) Les coupes de E14.0 fraîchement récoltés (C), E15.0 (D) et E16. 0 (E), le tissu du duodénum colorées avec la E-cadhérine (vert) et DAPI (bleu). A E14.0, l'épithélium est encore unremodeled pseudostratifié, tout en E15.0 et E16.0, villosités naissantes sont visibles. (F) un segment intestinal identique à celle observée dans (C), mais en culture pendant deux jours (E14 + 2 jours) démontre que les villosités se développent dans la culture, bien que légèrement retardée. Panneaux (FC) sont reproduits à partir de Walton et al., 2012 2 sup>. Barres d'échelle sont de 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Reconstruction tridimensionnelle des champs cousus de z-piles à partir d'un wholemount de E15.5 PDGFRa EGFP / + intestin. L'image est une reconstruction partielle (1 um cinq sections du centre de 65 profilés en Z) à partir de 54 champs cousus de vue capturées à l'aide de la platine motorisée du microscope confocal LeicaSP5X sur une inversé DMI 6000 stand avec excitation à deux photons laser à 900 nm. Logiciel Leica LAS-AF cousu les Z-piles pour former l'ensemble de l'image. Scalebar est de 1 mm.
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Figure 3 reconstruction tridimensionnelle de sections optiques montrant wholemount anti-PECAM immunofluorescence de la vascularisation intestinale dans un duodénum E14. Sections optiques ont été capturés sur un microscope confocal LeicaSP5X sur un DMI verticale 6000 stand avec excitation à deux photons à 900 nm et trois dimensions reconstruit à l'aide du logiciel Imaris 7.6.1. Scalebar est de 200 um.
Figure 4 images confocale de vibratome coupe E15.5 PDGFRa EGFP / +; Rosa26 MTMG jéjunum montrant l'étroite association des PDGFRa EGFP / + cellules des grappes mésenchymateuses (vert) avec leur épithélium sus-jacent et le mésenchyme environnant (rouge, tomate membrane de Rosa26 MTMG). < / Strong> barres d'échelle sont de 50 um dans les panneaux supérieurs et 25 um dans les panneaux inférieurs.
Figure 5: Des reconstructions tridimensionnelles des images confocales de E15.5 vibratome coupe intestins qui étaient immunofluorescence anticorps teinté. Scalebar est de 50 um.
La figure 6 pour l'adaptation du système de culture Transwell à deux photons imagerie en temps réel. (A) Maillage écran est placé dans une boîte de culture (B). Membrane en polycarbonate est collé à l'écran de maille (C). Intestins sont collés sur la membrane de polycarbonate et mis en culture avec de milieu DMEM exempt de phénol.
Film film rotatif 2 montrant la reconstruction en trois dimensions de sections optiques du système vasculaire PECAM teinté dans le duodénum E14 dans la figure 2.
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Discussion
La nature dynamique et les interactions de tissus complexes de l'intestin en développement exige une visualisation 3D d'avoir une appréciation complète de ces événements morphogénétiques. Avec l'évolution des technologies d'imagerie, la capacité d'examiner en détail la morphogenèse des villosités se développe / amélioration et, avec elle, la compréhension de la communication spatiale et interaction pendant l'organogenèse est grandement améliorée.
Des méthodes alternatives pour la culture intestins entiers ont également été testés, mais le système de transwell reste le plus fiable pour les longs temps de culture et pour le maintien de cluster et des villosités structuration normale. Systèmes de culture en trois dimensions (matrigel ou collagène) fonctionnent bien pour les périodes de culture de courte durée (moins de 24 h) de l'intestin plus jeunes (E12.5-E15.5), mais une fois que les intestins commencent subir les mouvements péristaltiques-comme et sécrétant des enzymes et des déchets dans la lumière, les substrats en trois dimensions ne tiennent pas bien. Intestins dans la culture liquides sera également développer, cependant, le manque de soutien ou de référence pour l'orientation dans une culture flottant semble modifier schéma normal des clusters et des villosités. Par conséquent, le système Transwell est préférable d'examiner groupe de motifs et de villosités émergence et l'excroissance.
Un autre procédé pour l'imagerie en temps réel avec un ensemble wholemount moins rigoureuse consiste à utiliser des épingles minuties pour fixer l'intestin foetal à une mince couche de 7% d'agarose sur le fond d'une plaque 35 x 10 mm. Bien que cette méthode est plus facile à mettre en place, noter que son utilisation est limitée à des stades plus jeunes (E12.5-E15.5) ou de réduire la durée de culture depuis le matrigel ne tiendra pas jusqu'à sécrétions intestinales.
Pour préparer les plaques de culture, verser suffisamment d'fondu 7% d'agarose pour juste couvrir le fond d'une plaque de 35 x 10 mm. Placer un tube capillaire en verre au centre de l'agarose pendant qu'il est encore malléable. Une fois que l'agarose est solidifié, enlever le capillaire en verre et placez til fœtale intestin le long du puits créé par le capillaire. Remplir le capillaire et avec matrigel à entourer l'intestin et placer la boîte de culture à 37 ° C jusqu'à ce que les ensembles de matrigel. Ajouter rouge de phénol libre DMEM milieux de culture avec soin. Placez la plaque mm 35 x 10 à l'intérieur d'une plaque de 60 x 15 mm et remplir la plaque de 60 mm avec de l'eau pour créer une chambre humide.
Le choix de la méthode de montage (wholemount ou vibratome) pour l'imagerie en temps réel est basée sur l'orientation souhaitée de la zone à visualiser. Par exemple, pour afficher les modifications dans la forme des cellules épithéliales, z-piles par un intestin wholemounted fournira des vues sur les surfaces apicales et basales. Pour voir interkinetic migration nucléaire des cellules épithéliales dans la feuille épithéliale, vibratome sections permettent une extrémité sur (transversal) afin d'observer les surfaces apicales et basales.
La préparation des échantillons est essentielle pour donner les meilleurs résultats d'imagerie. Lors de l'utilisation d'un vibratome sectionse microscopie confocale standard, une bonne résolution peut être obtenue jusqu'à une profondeur de 75 um sans réactif de compensation. Actuellement, un réactif de compensation pour les échantillons vivants n'a pas été identifié de sorte que la profondeur de l'imagerie est limitée. Pour les échantillons fixes, l'utilisation d'un réactif de compensation peut grandement améliorer la profondeur d'imagerie. Le réactif de compensation trouvé pour fournir la meilleure morphologie et la résolution a été mise au point claire 17. Après 30 min de compensation en orientation claire et de montage à Mount clair, toute la profondeur de toutes les étapes de l'intestin embryonnaires peut être imagée avec une excellente résolution. Une compensation alternative moins coûteuse est de 70% de glycérol, mais la profondeur maximale de pénétration dans les tissus embryonnaires est de 150 m, par la suite, la résolution et l'intensité d'un signal est perdu.
Une remarque importante est que les signaux sont plus définis dans les échantillons qui sont montés et imagés sur le même jour, la coloration a été réalisée. Montage avec un milieu de montage aqueux signal de préservation (comme une solution anti-fade Prolonger or (Life Technologies P36930) n'aide en préservant le signal, mais seulement brièvement; les images les plus nettes sont toujours obtenus immédiatement après la coloration et le montage des échantillons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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