Abstract
De flesta morfogenetiska processer i foster tarmen har härledas från tunna snitt av fasta vävnader, ger ögonblicksbilder av förändringar över utvecklingsstadier. Tredimensionell information från tunna seriesektioner kan vara svårt att tolka på grund av svårigheten av att rekonstruera seriesektioner perfekt och bibehålla korrekt orientering av vävnaden över seriesektioner. Nya rön från Grosse et al. 2011 betona vikten av tredimensionella informationen förstå morfogenes av utvecklings villi i tarmen 1. Tredimensionell rekonstruktion av enkelmärkt intestinala celler visade att majoriteten av de intestinala epitelceller i kontakt med båda de apikala och basala ytor. Vidare tredimensionell rekonstruktion av aktin cytoskelettet på den apikala ytan av epitelet visat att tarmlumen är kontinuerlig och att sekundära lumen är en artefakt av arectioning. Dessa två punkter, tillsammans med demonstration av interkinetic kärn migration i tarmepitelet, definierat utvecklings tarmepitelet som pseudostratified epitel och inte stratifieras som man tidigare trott 1. Förmågan att observera epitel tredimensionellt var banbrytande att demonstrera denna punkt och omdefiniera epiteliala morfogenes i foster tarmen. Med utvecklingen av multifotonbildteknik och tredimensionell rekonstruktion programvara, förmågan att visualisera intakt, utveckla organ snabbt förbättras. Tvåfotonexcitering låter mindre skadligt penetration djupare in i vävnader med hög upplösning. Två-foton avbildning och 3D-rekonstruktion av hela fetala mus tarmar i Walton et al. 2012 bidrog till att definiera mönstret av villus utväxt 2. Här beskriver vi ett helt organkultursystem som gör att ex vivo utveckling av villi och förlängningar av detta kultursystem för att möjliggöratarmarna att vara tredimensionellt avbildas under deras utveckling.
Protocol
OBS: Alla möss hanterades humant använder protokoll som godkänts av University of Michigan Medical School enheten för försöksdjursmedicin och enligt de universitetets riktlinjer kommittén för användning och skötsel av djur.
1. Sammanlagt Organ Culture System
- Beredning av media och odlingsplattor
- I en vävnadsodling huva, ta bort 5 ml BGJb media från aktie flaskan och tillsätt 5 ml Pen / Strep. Förbered en fungerande lager av media i en 50 ml koniskt rör, genom att tillsätta 1 ml 5 mg / ml askorbinsyra till 49 ml BGJb media (med Pen / Strep).
- Förbered en 6 bra odlingsplatta genom att tillsätta 1 ml under var och en av transwell.
OBS: Om alla 6 transwell inte används, flyttar extra transwell till en ny steril 6 brunnar för senare användning. Tillsätt 3 ml arbeta BGJb media till var och en av tre 10 cm sterila petriskålar.
- Förberedelse för dissektion
- Blöt dissekera verktyg i 70% Ethanol och se till att hålla verktygen rena medan du arbetar.
- Ställ in dissekera område med en stor ishink och placera 6 bra odlingsplatta och 10 cm petriskålar med BGJb media på is. Arbetet på is så mycket som möjligt samtidigt dissekera och förbereda tarmarna för kultur.
- Bedöva vuxna kvinnliga möss i en kammare med isofluorane (100 l) före eutanasi av halsdislokation för skörd av fetala tarmar.
- Efter skörd av foster från sin mor, steg varje foster noggrant enligt Theiler iscensätta diagrammet 13. Lita inte på dagar efter coitus att fastställa åldern på varje foster som variationer på upp till 24 timmar i utvecklingsstadiet rutinmässigt observeras i en enda kull.
- Dissektion av fetala tarmar
- Euthanize foster genom halshuggning före avlägsnandet av tarmarna.
- Dissekera varje tarmen i 1x Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) och sedan place den i en 10 cm petriskål med fungerande BGJb media.
- Ta försiktigt bort mjälten från magen och bukspottkörteln från magen och övre duodenum.
- Separera försiktigt omentum noga med att lämna omentum bifogas så mycket som möjligt och separera anslutningar bara tillräckligt för att låta tarmen som ska rätas ut.
OBS! Tarmarna äldre än E14.5 eller de som odlas längre än 24 timmar, försiktigt separera tarmen i 3 lika delar för att möjliggöra luminala innehåll att flöda genom tarmen och utvisas från de avskurna ändarna. För kulturer började före E13.5, vänta till efter 24 h av odling innan separera de 3 segment av tarmen så att serosa att ordentligt växa över längden av tarmen. - Använd en mun pipett för att överföra tarm bitarna på de transwell i odlingsplattan (1.1.2).
- Flytta försiktigt tarmarna efter behov så att de är rakt över transwell.
OBS: När tarmarna börjar röra luminala innehållet genom röret, kommer eventuella veck på tarmen orsaka en backup och skada på tarmen.
- Kultur och behandling
- Ta bort materialet från under transwell, tillsätt 700 l av behandlings media (arbetsmedier med tillsats rekombinanta proteiner eller farmakologiska hämmare) under transwell.
- Lägg 300 ul av behandlingsmedier droppvis ovanpå tarmarna och tillåta det att suga genom transwell. Placera tarmarna efter behov.
- Ändra behandlings media minst en gång dagligen eller oftare beroende på halveringstiden av behandlingsreagens.
- Framställning av protein indränkt agaroskulor för en lokal källa till behandlingsreagens
- Resuspendera agarospärlor i deras lagringsbehållare och överför 100 pl agarospärlor i ett 1,5 ml mikrofugrör.
- Fyll den återstående volymen av röret med steril 1x Phosphate-buffrad saltlösning (PBS) och blandas pärlorna att tvätta dem. Placera mikrofugrör i ett rack i några minuter så att kulorna att sjunka till botten och sedan pipettera bort PBS från ovanpå pärlorna. Fyll mikrofugrör med steril 1x PBS och upprepa tvättprocessen ytterligare två gånger.
- Förbered proteinet av intresse vid två gånger den önskade för behandling koncentrationsläger.
- Blanda 5 l av tvättade agaroskulor med 5 pl av 2x protein lager och försiktigt skaka pärlorna i proteinet. Placera röret på is under 1 h, blanda försiktigt varje 10-15 min.
- Skölj pärlorna kort i sterilt 1x PBS innan du lägger pärlorna på tarmarna.
- Placering av agarospärlor
- Placera försiktigt agarospärlorna ovanpå tarmarna med en mun pipett med drog kapillär nålar. Placera pärlorna med yttersta försiktighet eftersom ovarsam hantering kan skada tarmen och förhindrar villus utveckling i det skadade området.
- Placera dubbelt så många kulor som behövs för analys, eftersom tarmarna undergår peristaltiska rörelser och ungefär hälften av de pärlor placerade kommer att rulla ut i tarmarna över odlingstiden.
- Fixering av odlade tarmar
- Ta försiktigt bort behandlingsmedia underifrån den transwell och tillåta tarmarna lufttorka under 3 min.
- Tillsätt 1 ml fixativ under transwell till 2 min, sedan täcka toppen av tarmen med 2 ml fixativ för återstoden av fixeringstiden. Fixera med 4% paraformaldehyd O / N vid 4 ° C eller under 2 h vid RT.
2 Imaging av fasta Tarmar
- Wholemount avbildning
- Placera hela tarmen (med endogen fluorescens) på en bild med 100 pl 1x DPBS. Använd pincett för att försiktigt ordna tarmarna.
- Använd ett labb vävnad för att försiktigt ta bort DPBS och omedelbart tillsätt 100 l av 70% glycerol för att göra vävnaden more transparent och öka den möjliga djup avbildning.
OBS: Om ytterligare penetration av tarmen önskas, istället för att montera tarmen i 70% glycerol, blöt tarmen i några droppar Focus Klar lösning för 10-30 min. Pipettera bort Focus Klar lösning och montera tarmen med Mount Clear. - Doppa varje av de fyra hörnen av ett täck i modellera och plocka upp en liten mängd lera som ska användas som distanser mellan bilden och täckglas för att hålla täckglas från plattas tarmen.
- Täta täckglas på objektglaset med smält valap appliceras med en bomullspinne.
- Bild tarmarna på endera en upprätt eller inverterat konfokalmikroskop. Se diskussionen för mer information.
- Vibratome sektionering av fasta tarmarna (för tvärsnittsvy av intestinala strukturer)
- Bädda tarmar i 7% agaros i små plastformar (10 x 10 x 15 mm) och låt agarosblock tillsvalna och stelna.
- Ta agarosblock från formarna plast och lim agarosblock till vibratome samlingen scenen med snabblim.
- Fyll samlingen scenen med iskall 1x DPBS.
- Skär sektioner med en tjocklek mellan 100-150 nm. För tjockare sektioner använder clearinglösningar (som beskrivs i avsnitt 2.1.2) för att visualisera djupare in i tvärsnittet.
- Häll vibratome sektioner från samlingen steget in i en brunn i en 6-brunnar för lagring vid 4 ° C.
- Immunofluorescensfärgning av fasta, vibratome sektione vävnader
- Placera 5-12 vibratome sektioner per brunn i en 24-brunnar med 1x DPBS.
- Ta 1x DPBS och tillsätt 500 l av permeabilization lösning per brunn. Skaka försiktigt proverna i 25 min vid RT.
- Efter permeabilization, tvätta proverna 3 gånger med 1x PBS.
- Blockera proverna under minst 30 min i 500 | il blockeringslösning.
- Efter blockering, eXchange den blockerande lösningen med 500 l av primära antikroppar utspädda i blockerande lösningen och hålla proven vid 4 ° CO / N.
OBS: De primära spädantikropps som fungerar bra på frysta och paraffin fungerar i allmänhet bra på vibratome sektioner också, men antikroppar som kräver nukleära antigenåtervinning i allmänhet inte fungerar bra med detta protokoll (t.ex. BrdU). - Följande dag, tvätta proverna tre gånger i 15 min varje gång med blockeringslösning.
- Efter tvätt, applicera 500 | il av den sekundära antikroppen utspädd i blockeringslösning. Vira 24-brunnar i aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna från ljus och rock proverna för 45 min till 2 h vid RT.
- Tvätta proverna 3 gånger med 1x PBS i 15 minuter vardera och montera vibratome avsnitt om diabilder som beskrivs i avsnitt 2.4.
- Monterings vibratome sektioner
- Förbered diabilder för vibratome montering genom att skära tunna skivor av dubbel stick tejp och placera dem längs långsidor bilderna.
- Placera försiktigt 5-10 vibratome sektioner mellan dubbelhäftande tejp på bilderna i en droppe av 100 pl 1x PBS.
- Vik alla avsnitt och sprida dem ut i ett enda lager över bilden.
- Ta bort överflödigt agaros eller ojämna bitar som skulle förhindra ett täckglas från sitter plant.
- Använd försiktigt ett labb vävnad för att suga upp överskottet 1x PBS från hela vibratome avsnitt.
- Lägg en droppe vatten monteringsmedium ovanpå vibratome sektioner och sedan täckglas.
- Täta täck på glasen med smält valap appliceras med en bomullspinne.
- Bild vibratome avsnitt om antingen en upprätt eller inverterat konfokalmikroskop. Se diskussionen för ytterligare information om val av ett avbildningssystem.
3 Live avbildning av hela Tarmar
Tarmen skördades från fetuses efter E12.5, med den anslutna omentum lämnas intakt, framgångsrikt utveckla villi i kultur med hjälp av ovanstående system. Därför medger denna ex vivo-system fångst av levande z-sektionsbilder av utvecklings tarmarna som kan rekonstrueras för en tre-dimensionell vy av morfogenes över tiden.
- Ställa in Bildproduktion
- Använd snabblim att ansluta en enskild polykarbonatmembran till ett finmaskigt skärm. Detta ger en stödställning för att hålla tarmen på plats under dopp lins upprätt konfokalmikroskop. Se diskussionsavsnittet för ytterligare information om val av levande imaging mikroskop.
- Placera mesh sikt i centrum brunn av en odlingsplatta.
- Placera dissekerade tarmen på polykarbonatmembran och tillsätt en droppe snabblim i vardera änden. Använd bara tillräckligt lim för att fästa tarmen, men inte päls det!
- Lägg odlingsmedia utan fenolrött under polykarbonatmembran i centrum brunn i odlingsplattan.
- Tillsätt vatten till den yttre kanten av odlingsplattan för att tillhandahålla fuktighet.
- Eftersom foster tarmen genomgår peristaltiska lika vågor av kontraktion i kultur, tillsätt 100 pl av en 1: 5 lösning av xylazin i 1x PBS till 3 ml av media för att styra rörelsen i tarmen medan avbildning. Denna dos kommer att kontrollera tarmrörelserna för ca 8-10 timmar utan att kompromissa villus utveckling.
- För en tvärgående vy av tarmen, bädda in levande tarmar i en 3-4% agaroslösningen och skär tjocka sektioner (150-500 nm) på en vibratome. Matcha styvhet agarosen med styvheten i tarmen skärs och empiriskt bestämd utvecklingsstadiet. Generellt fungerar en 3% agaroslösningen bra för tarmarna yngre än E14.5 och en 4% lösning fungerar bra för tarmarna E15-E16.
- Limma vibratome avsnitt till ett polykarbonatmembran fäst på ett nät (som i avsnitt 3.1.1) ochkulturen som beskrivs i avsnitt 3.1.2-3.1.6.
- Genomför den levande avbildning med en två-foton konfokalt fluorescensmikroskop (excitation laser mellan 690-1,040 nm) på en upprätt ställning med en avstämbar bord.
- Två-foton laser inställd på 900 nm ger djup penetration med den bästa upplösningen för GFP-signaler. Det minskar skador på vävnader samtidigt avbildning. Dessutom ställa kraften i lasern till lägsta möjliga utsläpp minskar vävnadsskada. Typiskt att få en god excitation av GFP, använder 12% effekt på två-photon laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kultur av hela explantat av foster tarmar möjliggör analys av platsen, distribution, och varaktigheten av de signalmolekyler som samordnar intestinal utveckling, eftersom detta system gör det möjligt för manipulering av signaleringen med farmakologiska reagens eller rekombinanta proteiner. Den transwell odlingssystem (Figur 1A, reproduceras från Walton et al., 2012) 2 ger en luft-vätska gränssnitt, som gör det möjligt att placera narkotika eller protein indränkt agarospärlor på vävnaden och därigenom etablera lokala signalkällor (Figur 1B ). Tarmar skördas från embryon vid E10 till E18.5 överleva i kultur på transwell och genomgår peristaltiska lika vågor av rörelse. Tarmar startade i kultur från E13.5 överlever cirka 10 dagar eller grovt till P3, utvecklingsstadium musen när crypt formation först observeras. Även scen tarmarna tidiga överleva i kultur, tarmar skördas innanE12.5 uppstår inte villi tillförlitligt, sannolikt på grund av att serosa inte har vuxit till helt täcka tarmen vid denna tidpunkt. Mesenkymala kluster bildas och villi börjar växa fram och förlänga i tarmarna startade i kulturen vid E12.5, E13.5 eller E14.5, även om utvecklingen är något fördröjd jämfört med icke odlade, scenmatchade kontroller (Figur 1, reproducerade från Walton et al., 2012) 2. Oavsett i vilket skede av tarmen i början av kulturen (E12.5-E14.5), tarmarna verkar alltid ha en ungefärlig fördröjning på 24 timmar. E14 tarmar som odlas i kultur i två dagar visar tillväxten av villi som är mer liknar E15 tarmar än villi av E16 tarmar som odlas i livmodern (Figur 1C-F) 2.
Den regelbundna mönster av mesenkymala kluster avslöjas av tredimensionell rekonstruktion av optiska delar av en helhet PDGFRα GFP / + tarmen vid E15.5 (Figur 2 </ Strong>, reproduceras från Walton et al., 2012) 2. Denna bild består av z-stackar av 54 synfält som sys ihop av Leica LAS-AF programvara. Varje plats inne i tarmen är en mesenkymala kluster visualiseras genom kärn taggad GFP uttrycks från PDGFRα locus 14. Den höga upplösningen på bilden innebär att tittarna kan zooma in på vissa områden för att undersöka detaljerna, men ger i djup rumsliga relationer som inte går att utläsa från enstaka synfält eller lägre effekt förstoring. Movie 1 är en serie stega igenom sydda z -stack bilder som är 3D rekonstruerade i Figur 2. De enskilda optiska avsnitten möjliggöra ytterligare visualisering av detaljer som enskilda celler i kluster.
Optiska sektioner av wholemount immunofluorescens av intestinal kärl med PECAM antikropp (BD Pharmingen 557.355, efter utspädning 1: 1,000) fångades med hjälp tvåfotonexcitering och reconkonstrueras med Imaris programvara (Figur 3). Denna tre-dimensionell vy av tarm blodkärl avslöjar ett intrikat nätverk av vaskulaturen som inte helt kan förstås av tunna avsnitt preparat. Movie 2, en roterande tredimensionell projektion av den rekonstruerade bilden i figur 3, möjliggör ytterligare uppskattning av hur ökad information genom tillhandahålls tredimensionell rekonstruktion kan öka förståelsen för strukturella mönster.
Vibratome sektione möjliggör tredimensionell visning av tarmen från en tvärgående vantage. I figur 4, förhållandet mellan utvecklingskluster (märkt med PDGFRα GFP / +) 14 med epitel och omgivande mesenkym (märkt med membran Tomat (ROSA26 mT / mg) 15 observeras.
Alternativt kan denna relation ses av antikropp immunofluorescence färgning (Figur 5) av de mesenkymala kluster (grön, märkt med anti-PDGFRα (Santacruz C-20, spädd 1: 200)) med epitel (röd, märkt med anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610.181, 1: 1,000 utspädning).
Hela denna organkultursystem kan också utvidgas för att möjliggöra två-photon avbildning av att utveckla foster tarmar. I denna uppsättning är foster tarmen limmats på en polykarbonatmembran som stöds av ett nät i ett större odlingsplatta (Figur 6). Den större väl storleken på odlingsplattan möjliggör konfokalmikroskop linser att kontakta tarmen inne väl.
Figur 1. Utvecklingen av hela foster tarmarna i ett transwell odlingssystem. (A) Fostrets tarmar som ställs på en transwell memBrane i en 6 bra odlingsplatta med BGJb media. Topp två tarmar är E12.5, botten två tarmar är E13.0. (B) Bovinserumalbumin indränkt agarospärlor (ljusare blå) placeras på en tolvfingertarmen i transwell odlingssystemet. Den mörkare blå fläcken är X-gal färgning för Ptc LacZ / + i Hedgehog reporter mus linje markerar mesenkymala kluster 16. (CF) Tvärsnitt av nyskördade E14.0 (C), E15.0 (D) och E16. 0 (E), duodenal vävnad färgas med E-cadherin (grön) och DAPI (blå). På E14.0 är unremodeled epitel fortfarande pseudostratified, medan E15.0 och E16.0, begynnande villi är synliga. (F) En tarmsegmentet identiskt med det som visas i (C), men odlas i två dagar (E14 + 2dagar) visar att tarmludd utvecklas i kultur, men något fördröjd. Paneler (CF) är omtryckt från Walton et al. 2012 2 sup>. Scalebars är 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Tredimensionell rekonstruktion av sydda områden z-stackar från en E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + tarmen. Bilden är en partiell rekonstruktion (fem 1 um sektioner från centrum av 65 z-avsnitt) från 54 sydda fält syn tagits med den motoriserade skede av LeicaSP5X konfokalmikroskop på en inverterad DMI 6000 stativ med två-foton laser excitation vid 900 nm. Leica LAS-AF programvara sys Z-stackar samman till hela bilden. Scalebar är 1 mm.
n "src =" / filer / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3 Tredimensionell rekonstruktion av optiska sektioner visar wholemount anti PECAM immunofluorescens av intestinal kärl i en E14 duodenum. Optiska sektioner fångades på en LeicaSP5X konfokalmikroskop på en upprätt DMI 6000 stå med tvåfotonexcitering vid 900 nm och tre dimensionellt rekonstrueras med hjälp av Imaris 7.6.1 programvaran. Scalebar är 200 um.
Figur 4 Konfokala bilder av vibratome sektione E15.5 PDGFRα EGFP / +; ROSA26 mTmG jejunum visar det nära associering av de PDGFRα EGFP / + celler i mesenkymala kluster (grön) med sina överliggande epitel och omgivande mesenkym (röd, membrane Tomat från ROSA26 mTmG). < / Strong> Scalebars är 50 pm i de övre panelerna och 25 mikrometer i de nedre panelerna.
Figur 5. Tredimensionella rekonstruktioner av konfokala bilder från E15.5 vibratome sektione tarmar som var antikropps immunofluorescens färgas. Scalebar är 50 pm.
Figur 6 Anpassning av transwell odlingssystem för 2-foton levande avbildning. (A) mesh sikt placeras i en odlingsskål. (B) Polykarbonatmembran limmas på mesh sikt. (C) Tarmar limmas på polykarbonatmembran och odlades med fenol fritt DMEM media.
Movie 2. Roterande film som visar den tredimensionella rekonstruktionen av de optiska delarna av PECAM färgades vaskulatur i E14 duodenum i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dynamiska karaktär och komplexa vävnadsinteraktioner i utvecklings tarmen kräver 3D-visualisering för att få en fullständig bedömning av dessa morfogenetiska händelser. Med växande bildteknik, förmågan undersöka villus morfogenes i detalj utvecklas / förbättras och med det, är förståelsen av den rumsliga kommunikation och interaktion under organogenesen förbättras avsevärt.
Alternativa metoder för odling av hela tarmen har också testats, men transwell systemet fortfarande den mest tillförlitliga för längre odlings gånger och för att upprätthålla normal kluster och villus mönstring. Tredimensionell kultursystem (Matrigel eller kollagen) fungerar bra för kortare odlingsperioder (mindre än 24 timmar) av yngre tarmar (E12.5-E15.5), men när tarmen börjar genomgår peristaltiska liknande rörelser och utsöndra enzymer och avfall in i lumen, vet de tredimensionella substrat inte håller sig väl. Tarmar i flytande kulturs kommer också att utveckla, men bristen på stöd eller referens för orientering i ett fritt flytande kultur tycks förändra normala mönstret av kluster och villi. Därför är det transwell systemet föredrog att undersöka kluster mönstring och villus uppkomst och utväxt.
En annan metod för wholemount Bildproduktion med en mindre strikt uppsättning upp är att använda minutien stift för att fästa foster tarmen till ett tunt lager av 7% agaros på botten av ett 35 x 10 mm plåt. Även om denna metod är enklare att installera, observera att användningen är begränsad till yngre stadier (E12.5-E15.5) eller för kortare odlings gånger sedan matrigel inte kommer att hålla upp till tarmsekret.
För att förbereda odlingsplattor, häll smält 7% agaros att bara täcka botten av en 35 x 10 mm plåt. Placera ett glaskapillärrör i centrum av agarosen medan den fortfarande är formbara. När agarosen stelnat, ta bort glaskapillär och placera tHan foster tarmen längs väl skapats av kapillär. Fyll kapillären väl med Matrigel för att omge tarmen och placera odlingsskålen vid 37 ° C tills Matrigel uppsättningar. Lägg fenolrött-fritt DMEM odlingsmedia noggrant. Placera 35 x 10 mm plåt i en 60 x 15 mm plåt och fyll 60 mm plåt med vatten för att skapa en fuktig kammare.
Urval av monteringsmetod (wholemount eller vibratome) för levande avbildning är baserad på den önskade orienteringen av det område som skall visualiseras. Till exempel, för att visa förändringar i epitelceller form, z-stackar genom en wholemounted tarmen ger utsikt över de apikala och basala ytor. Om du vill visa interkinetic kärn migration av epitelceller inom epitelark, vibratome sektioner tillåter ett slut på (tvärgående) för att iaktta de apikala och basala ytor.
Beredning av proverna är kritisk för att i utbyte ge de bästa avbildningsresultat. Vid användning vibratome avsnitt and standard konfokalmikroskopi kan bra upplösning uppnås upp till djup av 75 pm utan en clearing reagens. För närvarande har ett clearing reagens för levande prover inte identifierats så djup avbildning är begränsad. För fasta prov kan användningen av ett clearing reagens avsevärt förbättra djupet av avbildning. Clearing reagens visat sig ge den bästa morfologi och upplösningen var Focus Clear 17. Efter 30 min av clearing i fokus klart och montering i Mount klart kan hela djupet i alla stadier av embryonala tarmar avbildas med utmärkt upplösning. En billigare clearing alternativ är 70% glycerol, men den maximala inträngningsdjup i embryonala vävnader är 150 m, därefter upplösning och intensitet signalen går förlorad.
En viktig anmärkning är att signalerna mest definieras i prover som är monterade och avbildas på samma dag färgningsslutfördes. Montering med signal bevara vattenmonteringsmedium (såsom Prolong guld anti-fade-lösning (Life Technologies P36930) hjälper med att bevara den signalen, men bara en kort stund; de tydligaste bilderna alltid erhålls omedelbart efter färgning och montering av proverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A.
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
