Abstract
רוב התהליכים המוךפו"גנטי במעי של העובר כבר משתמעים מסעיפים דקים של רקמות קבועות, מתן תמונות של שינויים לאורך שלבי התפתחות. מידע תלת ממדים מסעיפים סידוריים דקים יכול להיות מאתגר לפרש בגלל הקושי של שחזור קטעי סדרתי בצורה מושלמת ושמירה על הכיוון נכון של הרקמות על סעיפי סדרתי. הממצאים אחרונים על ידי Grosse et al., 2011 מדגישים את החשיבות של שלושה מידע ממדי בהבנת המורפוגנזה של villi הפיתוח של המעי 1. שחזור תלת ממדי של תאים במעי שכותרתו בנפרד, הוכיח כי רוב תאי אפיתל במעי פנו שני משטחי הפסגה ובסיסיים. יתר על כן, השחזור תלת ממדי של שלד התא אקטין במשטח הפסגה של האפיתל הראה שחלל המעי הוא רציף ושלומן המשני הוא חפץ של יםectioning. אלה שתי נקודות, יחד עם ההפגנה של הגירה גרעינית interkinetic באפיתל במעי, שהוגדרו אפיתל במעי מתפתח כהאפיתל pseudostratified ולא רובדו כפי שחשבו בעבר 1. היכולת להתבונן האפיתל בתלת הממד הייתה זרע להוכחת נקודה זו ומגדירה מחדש המורפוגנזה אפיתל במעי של העובר. עם התפתחות טכנולוגית הדמיה רב פוטון ותוכנת שחזור תלת ממדים, היכולת לדמיין ללא פגע, פיתוח איברים משתפר במהירות. שני פוטונים עירור מאפשר חדיר פחות מזיק עמוק יותר לתוך רקמות עם רזולוציה גבוהה. שני פוטונים הדמיה ושחזור 3D של המעיים עכבר העובריים השלם בולטון et al., 2012 עזרו להגדיר את הדפוס של סיסי תולדה 2. כאן אנו מתארים מערכת תרבות איבר שלמה המאפשרת פיתוח vivo לשעבר של villi והרחבות של מערכת שהתרבות כדי לאפשרהמעיים להיות בתלת ממד הדמיה במהלך הפיתוח שלהם.
Protocol
הערה: כל העכברים טופלו באנושיות תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואת היחידה לבעלי חיים במעבדה לרפואה ובהתאם להנחיות ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים.
מערכת האיברים תרבות .1 שלמה
- הכנה של תקשורת ותרבות צלחות
- בשכונת תרביות רקמה, להסיר 5 מ"ל של תקשורת BGJb ממניות הבקבוק ולהוסיף 5 מ"ל של העט / סטרפטוקוקוס. הכן מלאי עבודה של תקשורת בצינור חרוטי 50 מ"ל, על ידי הוספת 1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל חומצה אסקורבית ל49 מ"ל של תקשורת BGJb (עם פן / סטרפטוקוקוס).
- הכן צלחת תרבות 6 היטב על ידי הוספת 1 מ"ל מתחת לכל של transwells.
הערה: אם לא השתמש בכל 6 transwells, להעביר transwells נוסף לצלחת 6 היטב סטרילי טרי לשימוש מאוחר יותר. הוסף 3 מ"ל של עבודה תקשורת BGJb לכל אחת משלוש צלחות פטרי 10 סנטימטר סטרילי.
- הכנה לנתיחה
- משרים כלים לנתח בetha 70%נול ולהיות בטוחים כדי לשמור על הכלים נקיים תוך כדי העבודה.
- הגדר את האזור לנתח עם דלי קרח גדול ולמקם את צלחת תרבות 6 היטב ו10 פטרי מנות סנטימטר עם תקשורת BGJb על קרח. לעבוד על קרח ככל האפשר, תוך ביתור והכנת המעיים לתרבות.
- הרדימי נקבת עכברים בוגרים בתא עם isofluorane (100 μl) לפני euthanization נקע בצוואר הרחם לאסיף מעיים של העובר.
- לאחר קצירת העוברים מאמם, לביים כל עובר על פי זהירות לTheiler בימוי תרשים 13. אין לסמוך על ימים שלאחר משגל-כדי לקבוע את הגיל של כל עובר כוריאציות של עד 24 שעות בשלב התפתחותי הם נצפו באופן שיגרתי בהמלטה אחת.
- Dissection של מעיים של העובר
- להרדים עוברים על ידי עריפת ראש לפני הסרת מעיים.
- לנתח כל מעי בשל 1x Dulbecco פוספט שנאגר מלוח (DPBS) ולאחר מכן PLACe אותו לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר עם העבודה תקשורת BGJb.
- מוציא בזהירות את הטחול מהבטן והלבלב מהבטן והעליון תריסריון.
- בעדינות להפריד את omentum דואג להשאיר את omentum המצורף ככל האפשר ומפריד את הקשרים רק מספיק כדי לאפשר למעי להיות יישר.
הערה: למעיים מבוגרים מן E14.5 או אלה שתרבית יותר מ24 שעות, בעדינות להפריד את המעי ל3 חלקים שווים, כדי לאפשר לתוכן luminal לזרום דרך המעי ולהיות מגורש מקצות החתך. עם זאת, לתרבויות התחילו לפני E13.5, לחכות עד אחרי 24 שעות של culturing לפני פרידת 3 המגזרים של המעי כדי לאפשר serosa לגדול כראוי על פני האורך של המעי. - השתמש pipet פה כדי להעביר את חתיכות מעיים על transwells של צלחת התרבות (1.1.2).
- בעדינות למקם מחדש את המעיים לפי צורך, כך שהם ישר transwell.
הערה: ברגע שהמעיים מתחילים לנוע תוכן luminal דרך הצינור, סטיות כל במעי יגרמו גיבוי ונזק למעי.
- תרבות וטיפול
- הסר את המדיה מתחת transwell, להוסיף 700 μl של תקשורת טיפול (עבודה תקשורת עם חלבונים הוסיפו רקומביננטי או מעכבים תרופתיים) תחת transwell.
- הוסף 300 μl של תקשורת טיפול ירידה מבחינת על גבי המעיים ולאפשר לו לספוג דרך transwell. למקם מחדש את המעיים על פי צורך.
- שינוי בתקשורת טיפול לפחות פעם ביום או לעתים קרובות יותר בהתאם לזמן מחצית החיים של מגיב הטיפול.
- הכנת חרוזים agarose חלבון ספוגה למקור מקומי של מגיב טיפול
- Resuspend חרוזים agarose במכל האחסון שלהם ולהעביר את חרוזים agarose 100 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge.
- מלא את הנפח הנותר של הצינור עם סטרילי 1x Phosphate שנאגר מלוח (PBS) ומערבבים את החרוזים כדי לשטוף אותם. מניחים את צינור microfuge במעמד לכמה דקות כדי לאפשר חרוזים להתיישב לתחתית ואז pipet את PBS מעל גבי חרוזים. למלא את צינור microfuge עם סטרילי 1x PBS ולחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספת.
- הכן את החלבון של עניין בשתי פעמים הריכוז רצוי לטיפול.
- מערבבים 5 μl של חרוזים agarose נשטפו עם 5 μl של מניית חלבון 2x ועדינות להתסיס את חרוזים בחלבון. מניחים את הצינור על קרח במשך שעה 1, ערבוב בעדינות כל דקות 10-15.
- יש לשטוף את חרוזים קצר בסטרילי 1x PBS לפני הצבת חרוזים במעיים.
- מיקום של חרוזים agarose
- מניח בעדינות את חרוזים agarose על גבי המעיים באמצעות pipet פה עם מחטי נימים משכו. מניחים את חרוזים בזהירות רבה כטיפול אגרסיבי יפגע המעי ולמנוע התפתחות סיסי באזור הפגוע.
- הנח חרוזי פעמיים רבים ככל נדרשים לניתוח מאז המעיים יעברו תנועות peristaltic וכמחצית מהחרוזים להציב יגלגל את המעיים על פני זמן culturing.
- קיבוע של מעיים בתרבית
- מוציא בזהירות את תקשורת הטיפול מלמטה transwell ולאפשר את המעיים לייבוש באוויר במשך 3 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מקבע תחת transwell למשך 2 דקות, לאחר מכן לכסות את החלק העליון של המעי עם 2 מ"ל של מקבע למשך שארית זמן הקיבעון. לתקן עם 4% O paraformaldehyde / N ב 4 מעלות צלזיוס או לשעה 2 ב RT.
.2 הדמיה של מעיים קבועים
- הדמיה Wholemount
- מניחים את המעיים שלמים (עם הקרינה אנדוגני) בשקופית עם של 1x DPBS 100 μl. שימוש במלקחיים כדי לסדר בעדינות את המעיים.
- השתמש במטלית מעבדה כדי להסיר בזהירות את DPBS ומייד להוסיף של גליצרול 70% 100 μl כדי להפוך את מו הרקמהמחדש שקוף ולהגדיל את העומק האפשרי של הדמיה.
הערה: אם חדירה נוספת של המעי היא רצויה, במקום הרכבה המעי ב70 גליצרול%, להשרות את המעי בכמה טיפות של תמיסת המוקד ברורה ל10-30 דקות. Pipet את פתרון המוקד ברור והר המעי עם הר ברור. - טובלים כל אחת מארבע הפינות של coverslip לפלסטלינה ולהרים כמות קטנה של חומר שישמש כמפרידים בין השקופיות וcoverslip כדי לשמור על coverslip ממשטח את המעי.
- לאטום את coverslip לשקופית עם VALAP מומס מיושם עם מקלון צמר גפן.
- תמונת המעיים משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים.
- חתך Vibratome של מעיים קבועים (עבור תצוגת חתך רוחב של מבני מעיים)
- מעיים להטביע בagarose 7% בתבניות פלסטיק קטנים (10 x 10 x 15 מ"מ) ולאפשר ללוקי agarose ללצנן ולחזק.
- להסיר בלוקים agarose מתבניות הפלסטיק ואובניים agarose הדבק לשלב איסוף vibratome עם דבק מיידי.
- מלא את שלב האיסוף עם קרח הקר 1x DPBS.
- לחתוך חלקים בעובי בין 100-150 מיקרומטר. עבור חלקים עבים יותר להשתמש בפתרוני סליקה (שתוארו בסעיף 2.1.2) כדי לחזות עמוק יותר לתוך החתך.
- יוצקים vibratome חלקים מהשלב האיסוף לתוך באר של צלחת 6 היטב לאחסון ב 4 ° C..
- מכתים immunofluorescence של רקמות קבועות, מחולק vibratome
- הנח 5-12 חלקים vibratome לכל גם לתוך צלחת 24 גם עם 1x DPBS.
- הסר 1x DPBS ולהוסיף 500 μl של פתרון permeabilization בכל טוב. נער בעדינות את הדגימות ל25 דקות ב RT.
- לאחר permeabilization, לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS.
- חסום את הדגימות לפחות 30 דקות ב500 μl של חסימת פתרון.
- לאחר חסימה, דוארXchange פתרון החסימה עם 500 μl של הנוגדנים עיקריים בדילול מלא בחסימת פתרון ולשמור את הדגימות על 4 מעלות CO / N.
הערה: דילולים הנוגדן הראשוניים שפועלים היטב על חלקים קפואים ופרפין בדרך כלל עובדים גם על vibratome סעיפים מדי, לעומת זאת נוגדנים הדורשים אחזור אנטיגן גרעיני בדרך כלל לא עובד טוב עם פרוטוקול זה (למשל, BrdU). - למחרת, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם פתרון חסימה.
- לאחר כביסה, להחיל 500 μl של הנוגדנים משני בדילול מלא בחסימת פתרון. לעטוף את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור ולטלטל את הדגימות ל45 דקות לשעה 2 ב RT.
- שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS ל15 דקות כל אחד והר חלקי vibratome בשקופיות כפי שתואר בסעיף 2.4.
- הרכבה חלקי vibratome
- הכן שקופיות עבור vibratome הרכבה על ידי חיתוך פרוסות דקות של כפול STIקלטת ck ומציב אותם בצדי המגלשות הארוכים.
- בזהירות להניח 5-10 חלקי vibratome בין הקלטת דו המקל בשקופיות בירידה של של 1x PBS 100 μl.
- לפתוח את כל החלקים ולהפיץ אותם לשכבה אחת על פני השקופית.
- הסר את כל agarose עודף או חתיכות לא אחידות שימנע coverslip מיושב שטוח.
- להשתמש בזהירות רקמת מעבדה כדי לספוג את עודף 1x PBS מכל רחבי חלקי vibratome.
- הוסף טיפה של מדיום גובר מימיים על גבי חלקי vibratome ולאחר מכן coverslip.
- חותם את coverslips על השקופיות עם נמס VALAP מיושם עם מקלון צמר גפן.
- תמונת חלקי vibratome משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים על בחירה של מערכת הדמיה.
.3 הדמיה חיה של מעיים שלמים
מעיים שנקטפו מן fetuseים לאחר E12.5, עם omentum המחובר נותר בשלמותו, לפתח בהצלחה villi בתרבות שימוש במערכת לעיל. לכן, מערכת זו vivo לשעבר מאפשרת הלכידה של תמונות z-סעיף חיים של המעיים פיתוח שניתן לשחזר לתצוגה תלת ממדית של המורפוגנזה לאורך זמן.
- הגדרת הדמיה חיה
- השתמש בדבק מיידי לדבוק קרום פוליקרבונט פרט למסך רשת בסדר. זה מספק פיגום תמיכה כדי להחזיק את המעי במקום מתחת לעדשת הטבילה של המיקרוסקופ confocal הזקוף. נא עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים על בחירה של מיקרוסקופי הדמיה לחיות.
- הנח את מסך הרשת במרכז גם צלחת תרבות.
- הנח את המעי גזור על הממברנה פוליקרבונט ולהוסיף טיפה של דבק מיידי בכל צד. השתמש אך ורק מספיק דבק להדביק המעי, אבל זה לא מעיל!
- להוסיף חופשי תקשורת ותרבות של פנול אדום מתחת לפוליקרבונטקרום במרכז גם מצלחת התרבות.
- מוסיף מים עד לשפה החיצונית של צלחת התרבות כדי לספק לחות.
- מאז המעי העוברי עובר גלים כמו נפיחה של התכווצות בתרבות, להוסיף של 1 100 μl: פתרון 5 של xylazine ב1x PBS עד 3 מ"ל של תקשורת כדי לשלוט בתנועה של המעי תוך הדמיה. מינון זה לשלוט בתנועות מעיים במשך כ8-10 שעה מבלי להתפשר על פיתוח סיסי.
- לתצוגה רוחבית של המעי, להטביע את המעיים חיים בפתרון agarose 3-4% ולחתוך חלקים עבים (150-500 מיקרומטר) על vibratome. התאם את הנוקשות של agarose עם הקשיחות של המעי נחתך ואמפיריים נקבע השלב ההתפתחותי. באופן כללי, פתרון agarose 3% עובד היטב עבור מעיים צעירים מן E14.5 ופתרון 4% עובד היטב עבור המעיים E15-E16.
- מדביק את חלקי vibratome לקרום פוליקרבונט מודבקים מסך רשת (כמו בסעיף 3.1.1) והתרבות כפי שתוארה בסעיף 3.1.2-3.1.6.
- לנהל את ההדמיה בשידור החי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים confocal הקרינה (לייזר עירור בין 690-1,040 ננומטר) על עמדה זקופה עם שולחן מתכונן.
- לייזר שני פוטונים מכוון ל900 ננומטר מספק חדירה עמוקה עם הרזולוציה הטובה ביותר עבור אותות GFP. זה מפחית את נזק לרקמות בזמן ההדמיה. בנוסף, הגדרת כוחו של הלייזר לפליטה הנמוכה ביותר האפשרית מפחיתה נזק לרקמות. בדרך כלל כדי להשיג עירור טוב של GFP, להשתמש 12% כוח בליזר שני פוטונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות של explants של מעיים של העובר כולו מאפשרת לניתוחים של המיקום, הפצה, ומשך הזמן של מולקולות האיתות שלתאם פיתוח מעיים, כמערכת זו מאפשרת המניפולציה של האיתות עם ריאגנטים תרופתיים או חלבונים רקומביננטי. מערכת תרבות transwell (איור 1 א, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2 מספקת ממשק אוויר נוזלי, המאפשר למקום סמים או חרוזים agarose חלבון ספוג על הרקמות ובכך לבסס את מקורות איתות מקומיים (איור 1 ב ). מעיים שנקטפו מן העוברים בE10 לE18.5 לשרוד בתרבות בtranswells ולעבור גלים כמו נפיחה של תנועה. קרבים החלו בתרבות מE13.5 לשרוד כ 10 ימים או בערך לP3, השלב של פיתוח עכבר כאשר היווצרות קריפטה הוא ציין ראשון. למרות קרבים שלב מוקדם לשרוד בתרבות, מעיים שנקטפו לפניE12.5 לא לצאת villi באופן מהימן, ככל הנראה משום שserosa לא גדל כדי לכסות את המעי באותו זמן לחלוטין. אשכולות mesenchymal ליצור וvilli מתחיל לצוץ ולהאריך במעיים החלו בתרבות בE12.5, E13.5 או E14.5, אם כי התפתחות היא מעט התעכב בהשוואה לקבוצת ביקורת חסרת תרבות, בהתאמה במה (איור 1, לשכפל מet ולטון אל., 2012) 2. ללא קשר לשלב של המעי בתחילתה של התרבות (E12.5-E14.5), המעיים מופיעים תמיד יש עיכוב משוער של 24 שעות. מעיים E14 גדלו בתרבות במשך יומיים להציג צמיחה של villi שהם יותר דומים לאלה של מעיים E15 מאשר villi של מעי E16 גדל ברחם (תרשים 1C-F) 2.
הדפוס הקבוע של אשכולות mesenchymal מתגלה על ידי שחזור תלת ממדי של חלקים אופטיים של PDGFRα GFP / + מעי שלם בE15.5 (איור 2 </ Strong>, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2. תמונה זו מורכבת מz-ערימות של 54 שדות מבט שתפורים יחד על ידי התוכנה לייקה LAS-AF. כל נקודה בתוך המעי היא מקבץ mesenchymal דמיין ידי GFP הגרעיני מתויג הביע ממוקד PDGFRα 14. הרזולוציה הגבוהה של התמונה מאפשרת לצופה להתמקד-באזורים מסוימים כדי לבחון את הפרטים, אך מספקת ביחסים במרחב עומק שלא ניתן ללמוד מן השדות אחת של מבט או הגדלת הספק נמוכה יותר. 1 סרט היא סדרת דריכה דרך z התפור תמונות -stack כי הם 3D משוחזר באיור 2. הסעיפים האופטיים הבודדים לאפשר להדמיה נוספת של פרטים כגון תאים בודדים בתוך האשכולות.
סעיפים אופטיים של immunofluorescence wholemount של כלי דם במעיים עם נוגדני PECAM (BD Pharmingen 557,355; מדולל 1: 1,000) נתפסו באמצעות שני פוטונים עירור וreconstructed עם תוכנת Imaris (איור 3). תצוגה תלת ממדית של כלי דם במעי חושפת רשת סבוכה של כלי דם שלא ניתן להערכה באופן מלא על ידי הכנות סעיף דקות. סרט 2, הקרנה תלת ממדית תורנית של התמונה המשוחזרת באיור 3, מאפשרת להתחזקות נוספת של איך מידע עלה בשיעור של שחזור תלת ממדים הניתן יכול לשפר את ההבנה של דפוסים מבניים.
חתך vibratome מאפשר צפייה תלת ממדית של המעי מתצפית רוחבית. באיור 4, מערכת היחסים של אשכולות פיתוח (מסומנים בPDGFRα GFP / +) 14 עם mesenchyme האפיתל והסביבה (מסומן בקרום עגבניות (Rosa26 MT / מ"ג) 15 הוא ציין.
לחלופין, מערכת יחסים זו יכולה להיות שנצפו על ידי immunofluore נוגדןצביעת scence (איור 5) של אשכולות mesenchymal (ירוק, שכותרתו עם אנטי PDGFRα (Santacruz C-20; מדולל 1: 200)) עם אפיתל (אדום, שכותרתו עם אנטי Ecadherin (Labs התמרה BD 610,181; 1: 1,000 דילול).
מערכת תרבות איבר שלמה זה גם יכול להתארך כדי לאפשר לשני פוטונים הדמיה של פיתוח מעיים של העובר. בהגדרה זו, המעי העוברי מודבק קרום פוליקרבונט נתמך על ידי מסך רשת בצלחת תרבות גדולה יותר (איור 6). הגודל כן גדול יותר של צלחת התרבות מאפשר לעדשות מיקרוסקופ confocal ליצור קשר עם המעי בתוך היטב.
איור 1. פיתוח של מעיים של העובר כולו במערכת תרבות transwell. () מעיים העובריים שהונחו על mem transwellbrane בצלחת תרבות 6 היטב עם תקשורת BGJb. שני קרבים העליונים הם E12.5, שני מעיים תחתון הם E13.0. חרוזים (ב ') בסרום שור אלבומין הספוג agarose (כחול בהיר יותר) מונחים על תריסריון במערכת תרבות transwell. הכתם הכחול הכהה יותר הוא צביעת X-gal לPtc LacZ / + באשכולות mesenchymal קו עכבר כתב קיפוד סימון 16. (CF) צלב סעיפים של E14.0 הטרי שנקטפו (C), E15.0 (D) וE16. 0 (E) הרקמה, התריסריון המוכתם בE-cadherin (ירוקה) וDAPI (כחול). בE14.0, אפיתל לא עוצב מחדש, עדיין pseudostratified, ואילו בE15.0 וE16.0, villi המתהווה גלוי. קטע מעי זהה לזו שנצפתה ב( C), אבל בתרבית למשך יומיים (E14 (F) + 2days) מוכיח כי villi לפתח בתרבות, אם כי התעכב מעט. פנלים (CF) הם נדפסו מאל וולטון et., 2012 2 sup>. Scalebars 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 שחזור תלת ממדי של שדות תפורים של z-ערימות מwholemount E15.5 PDGFRα EGFP / + מעי. התמונה היא שחזור חלקי (חמש 1 מיקרומטר חלקים ממרכז 65 z סעיפים) מ54 שדות תפורים מבט שנתפס באמצעות הבמה הממונעת של מיקרוסקופ confocal LeicaSP5X על עמדה הפוכה DMI 6000 עם עירור לייזר שני פוטונים ב900 ננומטר. תוכנה לייקה LAS-AF תפרה את Z-הערימות יחד כדי ליצור את התמונה כולה. Scalebar הוא 1 מ"מ.
n "src =" / קבצים / ftp_upload / 51817 / "width =" 51817fig3highres.jpg 500 "/>
שחזור איור 3 תלת ממדי של חלקים אופטיים מראים immunofluorescence אנטי PECAM wholemount של כלי דם במעי בתריסריון E14. סעיפים אופטיים נתפסו על מיקרוסקופ confocal LeicaSP5X על DMI זקוף 6000 לעמוד עם שני פוטונים עירור ב900 ננומטר ושלוש ממדי משוחזר באמצעות תוכנת Imaris 7.6.1. Scalebar הוא 200 מיקרומטר.
איור 4 תמונות Confocal של vibratome E15.5 PDGFRα EGFP מחולק / +; Rosa26 mTmG מעי ריק מראה את הקשר ההדוק של PDGFRα EGFP / + התאים של אשכולות mesenchymal (ירוק) עם האפיתל שמעליה ומקיף את mesenchyme (אדום; קרום עגבניות מRosa26 mTmG). < / Strong> Scalebars 50 מיקרומטר בפנלים העליונים ו25 מיקרומטר בלוחות הנמוכים.
.5 שחזורים תלת ממדיים איור של תמונות confocal ממעי vibratome מחולק E15.5 שהיו immunofluorescence נוגדן מוכתם. Scalebar הוא 50 מיקרומטר.
איור 6 הסתגלות של מערכת תרבות transwell הדמיה חיה 2 פוטונים. (א) רשת המסך ממוקם בצלחת תרבות. הקרום (B) פוליקרבונט הוא מודבק על גבי מסך הרשת. מעיים (C) דבוקים לממברנה פוליקרבונט ותרבותי עם תקשורת ללא DMEM פנול.
סרט 2 סרט מסתובב המראה את השחזור תלת ממדי של החלקים האופטיים של כלי דם מוכתמים PECAM בתריסריון E14 באיור 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האופי הדינמי ואינטראקציות רקמה מורכבות של המעי המתפתח דורשים 3D להדמיה יש הערכה מלאה של אירועי המוךפו"גנטי אלה. עם התפתחות טכנולוגיית הדמיה, היכולת לבחון המורפוגנזה סיסי בפירוט מפתחת / שיפור ועם זה, ההבנה של התקשורת ואינטראקציה מרחבית במהלך organogenesis היא מאוד משופרת.
שיטות אלטרנטיביות לculturing כל מעיים גם נבדקו, אך מערכת transwell נשארה אמינה ביותר לזמנים ארוכים יותר ותרבות לשמירה על דפוסים אשכול וסיסיים נורמלים. מערכות תרבות תלת ממדים (matrigel או קולגן) לעבוד גם לתקופות קצרות תרבות (פחות מ 24hr) של מעיים צעירים (E12.5-E15.5), אבל ברגע שהמעיים מתחילים עוברים תנועות דמויות peristaltic ומפריש אנזימים ופסולת ללום, מצעים תלת ממדים לא מחזיקים מעמד היטב. קרבים בתרבות נוזליתים יהיה גם לפתח, עם זאת, חוסר תמיכה או התייחסות להתמצאות בתרבות חופשית צף מופיע לשנות דפוס נורמלי של האשכולות וvilli. לכן, מערכת transwell הוא העדיף לבחון דפוסים אשכול והופעה סיסי ותולדה.
שיטה נוספת להדמיה לחיות wholemount עם סט פחות קפדני היא להשתמש סיכות minutien לצרף את המעי העוברי לשכבה דקה של agarose 7% על החלק התחתון של צלחת 35 x 10 מ"מ. בעוד ששיטה זו היא קלה יותר להגדיר, לציין כי השימוש בו מוגבל לשלבים צעירים (E12.5-E15.5) או לזמנים קצרים יותר culturing מאז matrigel לא יחזיק עד הפרשות מעיים.
, כדי להכין את צלחות התרבות לשפוך מספיק agarose 7% נמס רק כדי לכסות את תחתית צלחת 35 x 10 מ"מ. הנח צינור נימי זכוכית במרכז agarose זמן שהוא עדיין נזיל. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את נימי הזכוכית ולמקם את tהוא עוברי מעי לאורך נוצר גם על ידי הנימים. מלא את הנימים גם עם matrigel להקיף את המעי ולמקם את צלחת התרבות ב37 מעלות צלזיוס עד סטי matrigel. הוסף מדיה תרבות DMEM פנול אדום ללא זהירות. מניחים את צלחת מ"מ 35 x 10 בתוך צלחת מ"מ 60 x 15 ולמלא את צלחת 60 מ"מ עם מים כדי ליצור תא לח.
בחירה של שיטת ההרכבה (wholemount או vibratome) להדמית חיה מבוססת על הכיוון הרצוי של האזור להיות דמיין. לדוגמא, כדי להציג את השינויים בצורת תא אפיתל, z-ערימות דרך מעי wholemounted יספק נוף של משטחי הפסגה ובסיסיים. כדי להציג interkinetic הגירה גרעינית של תאי האפיתל בגיליון אפיתל, חלקי vibratome לאפשר סוף על תצוגה (רוחבית) כדי לבחון את משטחי הפסגה ובסיסיים.
הכנת הדגימות היא קריטית למניב תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. בעת השימוש בvibratome סעיפיםnd מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי, רזולוציה טובה ניתן להשיג עד לעומקים של 75 מיקרומטר ללא מגיב סליקה. נכון לעכשיו, מגיב סליקה עבור דגימות חיות לא זוהה כל כך העומק של הדמיה הוא מוגבל. לקבלת דוגמיות קבועה, השימוש במגיב סליקה יכול לשפר באופן משמעותי את העומק של הדמיה. מגיב הסליקה נמצא לספק המורפולוגיה הטובה ביותר והחלטה היה להתמקד ברור 17. לאחר 30 דקות של סליקה בפוקוס ברור והרכבה בהר ברור, כל העומק של כל השלבים של מעיים עובריים ניתן הדמיה עם רזולוציה מצוינת. חלופת סליקה פחות יקרה היא 70 גליצרול%, עם זאת העומק המקסימאלי של חדירה ברקמות עוברית היא 150 m, לאחר מכן את הרזולוציה ועוצמת האות הולכת לאיבוד.
הערה חשובה אחת היא שאותות מוגדרים ביותר בדגימות שהם רכובים וצלמו באותו היום הצביעה הושלמה. הרכבה עם מדיום מימית שימור אות הרכבה (כגון פתרון אנטי לדעוך זהב להאריך (Life Technologies P36930) עוזר עם שמירה על האות, אבל רק לזמן קצר; את התמונות הברורות תמיד מתקבלות מייד לאחר הצביעה והרכבת הדגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A.
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
