Abstract
태아 소장에서 대부분의 형태 형성 과정은 발달 단계를 통해 변화의 스냅 샷을 제공하는 고정 된 조직의 얇은 섹션에서 유추되고있다. 얇은 시리얼 섹션에서 세 가지 차원 정보로 인해 완벽하게 시리얼 섹션을 재구성 시리얼 섹션을 통해 조직의 올바른 방향을 유지의 어려움의 해석에 도전 할 수 있습니다. 그로 의해 외. 최근 연구 결과, 2011은 한 부위의 현상 융모의 형태 형성을 이해 삼차원 정보의 중요성을 강조. 단독 표지 장 세포의 3 차원 재구성은 장 상피 세포의 대부분은 모두 혀끝과 기저 표면에 문의하는 것이 보여 주었다. 더욱이, 상피의 선 단면에서 액틴 세포 골격의 삼차원 재구성 장내 루멘 연속이며 그 보조 루멘 (S)의 이슈임을 입증ectioning. 그 두 점은, 장 상피 세포에서 interkinetic 핵 마이그레이션 시연과 함께 pseudostratified 상피 세포로 개발하는 장 상피 세포를 정의하고 이전에 한 생각으로 계층화 없습니다. 상피 세 차원을 관찰 할 수있는 능력은이 점을 증명하고 태아 소장에서 상피 형태 형성을 재정에 정액이었다. 다중 광자 이미징 기술 및 3 차원 재구성 소프트웨어의 발전으로, 능력은 급속히 향상되고 장기 개발, 그대로 시각화. 이광자 여기는 고해상도 조직에 덜 파괴적인 침투를 깊게한다. 두 광자 이미징 및 월튼 등.에 전체 태아 마우스 내장의 3 차원 복원은 2012 융모 파생물이의 패턴을 정의하는 데 도움을 주었다. 여기에서는 허용하도록 그 배양 시스템의 융모와 확장 생체 개발을 허용 전체 기관 배양 시스템을 설명창자는 세 가지 차원으로 자신의 개발 기간 동안 이미지를 만들 수 있습니다.
Protocol
참고 : 모든 쥐가 실험 동물 의학 미시간 의과 대학 단위의 대학의 승인을 동물의 사용 및 관리에 대학위원회의 지침에 따라 프로토콜을 사용하여 인도적으로 처리 하였다.
1 전체 장기 문화 시스템
- 미디어 및 문화 판의 제조
- 조직 배양 후드에서 스톡 병 BGJb 매체 5 mL를 제거하고, 펜 / 스트렙토 5 mL를 추가한다. 5 밀리그램 / (PEN / 스트렙토)와 BGJb 매체의 49 ml의 아스코르브 산 1 ㎖를 첨가하여, 50 ㎖의 원뿔형 튜브에 미디어 콘텐츠의 작업을 준비한다.
- 트랜스 웰 아래의 각각 1 ㎖에 첨가하여 6 웰 배양 플레이트를 준비한다.
참고 : 모든 6 트랜스 웰을 사용하지 않을 경우, 나중에 사용하기 위해 신선한 무균 6 웰 플레이트에 추가 트랜스 웰을 이동합니다. 세 10cm 무균 배양 접시에 각각 BGJb 미디어를 작업의 3 ML을 추가합니다.
- 해부를위한 준비
- 70 % etha에서 해부 도구를 적시와 NOL 작업하는 동안 청소 도구를 보관하십시오.
- 큰 얼음 양동이 해부 영역을 설정하고 6 웰 배양 판과 얼음에 BGJb 미디어와 10cm 배양 접시를 놓습니다. 해부와 문화에 대한 장을 준비하는 동안 가능한 한 많은 얼음에 작업 할 수 있습니다.
- 태아 창자 수확 용 자궁 전위에 의해 이소 플루오 란 (100 μL) 이전 euthanization에 함께 실에서 성인 여성 생쥐를 마취.
- 자신의 어머니로부터 태아를 수확 한 후, 각각의 태아가 신중하게 차트 13을 준비 Theiler에 따라 무대. 정기적으로 하나의 쓰레기 내에서 관찰되는 발달 단계에서 최대 24 시간의 변화에 각 태아의 나이를 결정하는 포스트 성교 일에 의존하지 마십시오.
- 태아 내장의 해부
- 창자를 제거하기 전에 잘린 태아를 안락사.
- 괞 찮아 후 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 각 장을 해부BGJb 미디어 작업과 10cm 페트리 접시로 CE.
- 조심스럽게 배에서 비장과 위장과 상부 십이지장에서 췌장을 제거합니다.
- 부드럽게 소장은 곧게 할 수 있도록 가능한 한만큼의 연결을 분리 한 많이 붙어있는 대망을 떠나 돌보는 대망 구분합니다.
참고 : 부드럽게 내강 내용이 소장을 통과하고 절단 끝에서 추방 할 수 있도록 세 동일한 세그먼트로 장을 분리 장 E14.5보다 나이 또는 사람들은 더 이상 24 시간 이상 배양하고 들어. 그러나, 배양을 위해 E13.5에 앞서, 장막 제대로 소장의 길이에 걸쳐 확장 할 수 있도록 부위의 3 세그먼트를 분리하기 전에 배양 한 후 24 시간까지 기다린 시작했다. - 문화 판 (1.1.2)의 트랜스 웰에 장 조각을 전송하기 위해 입 피펫을 사용합니다.
- 그들은 transwel에 걸쳐 직선이되도록 필요에 따라 조심스럽게 내장의 위치를리터.
주 : 창자가 튜브를 통해 내강 내용을 이동 시작하면 장에있는 꼬임 장에 백업 및 손상의 원인이됩니다.
- 문화 및 치료
- , 트랜스 웰 아래에서 용지를 제거 트랜스 웰에서 (추가 재조합 단백질이나 약물 억제제와 미디어 작업) 치료 미디어 700 μl를 추가합니다.
- 내장의 상단에 치료 미디어 적가의 300 μl를 추가하고 트랜스 웰을 흡수 할 수 있습니다. 필요에 따라 내장 위치를 조정합니다.
- 치료 시약의 반감기에 따라 적어도 하루에 한 번 또는 더 자주 치료 미디어를 변경합니다.
- 치료 시약의 지역화 된 소스 단백질 젖 아가 로스 비드의 제조
- 스토리지 컨테이너에 아가로 오스 비즈를 재현 탁하고, 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 아가 로스 비드의 100 μl를 전송합니다.
- 멸균 1X pH가 튜브의 남은 볼륨을 채우기osphate 완충 식염수 (PBS)와 그들을 씻어 구슬을 섞는다. 몇 분 구슬이 바닥에 정착 한 후 구슬의 상단에에서 PBS를 피펫 할 수 있도록하는 랙에 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다. 멸균 1X PBS와 미세 원심 분리 튜브를 채우고 두 번 더 세척 과정을 반복합니다.
- 두 번 치료를 원하는 농도로 관심의 단백질을 준비합니다.
- 배 단백질 주식의 5 μL로 세척 아가로 오스 비드 5 μl를 혼합하고 부드럽게 단백질 구슬을 선동. 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 혼합, 1 시간 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 장내에 구슬을 배치하기 전에 멸균 1X PBS에 잠시 구슬을 씻어.
- 아가로 오스 구슬의 배치
- 부드럽게 당겨 모세관 바늘 입 피펫을 사용하여 내장의 상단에있는 아가로 오스 비드를 배치합니다. 거친 취급 장에 손상을 부상당한 지역에 융모 발달을 차단하므로 매우주의 구슬을 놓습니다.
- 창자의 연동 운동과 배양 시간이 지남에 따라 내장의 롤 오프한다 배치 된 구슬의 절반 정도를 받아야하기 때문에 분석에 필요한 두 배나 많은 구슬을 놓습니다.
- 배양 내장의 고정
- 조심스럽게 트랜스 웰 아래에서 치료 용지를 제거하고 3 분 동안 건조한 공기에 내장 할 수 있습니다.
- 다음, 정착 시간의 나머지 정착액 2 ㎖와 소장의 상부 커버, 2 분 동안 트랜스 웰 아래 정착액 1 ㎖를 추가한다. 4 ° C 또는 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 O / N으로 수정합니다.
고정 창자의 2 이미징
- Wholemount 영상
- 1X DPBS 100 ㎕와 슬라이드 (내생 형광 포함) 전체 창자를 놓습니다. 부드럽게 장을 마련하기 위해 집게를 사용합니다.
- 조직 개월을주의 깊게 70 % 글리세롤 100 μl를 DPBS를 제거하고 즉시 추가 실험실 조직을 사용하여투명 재 및 이미징의 가능한 깊이를 증가시킨다.
NOTE : 소장의 상기 관통 원하는 경우, 대신에 70 % 글리세롤에 실장 부위에, 10 ~ 30 분 동안 초점 클리어 용액 몇 방울의 소장 소크. 초점 클리어 솔루션을 피펫 및 마운트 클리어와 장을 마운트합니다. - 모델링 점토로 커버 슬립의 네 모서리를 각각 담궈 부위를 평탄화로부터 커버 슬립을 유지하는 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 스페이서로서 사용하는 점토를 소량 픽업.
- 면봉으로 적용 녹은 VALAP와 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉합니다.
- 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 내장. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
- (장 구조의 단면도에 대한) 고정 장의 Vibratome의 절편
- 작은 플라스틱 금형 7 % 아가로 오스에 포함 된 장에 (10 × 10 × 15mm) 허용 아가로 오스 블록냉각 및 응고.
- 순간 접착제와 vibratome 수집 단계에 플라스틱 금형 및 접착제 아가로 오스 블록에서 아가로 오스 블록을 제거합니다.
- 얼음 차가운 1X DPBS와 컬렉션 무대를 채 웁니다.
- 100 ~ 150 μm의 사이에 두께 부분을 잘라. 두꺼운 부분은 단면에 깊은 시각화 (2.1.2 참조) 청산 솔루션을 사용하십시오.
- 4 ° C에서 저장을위한 6 웰 플레이트의 우물에 수집 단계부터 vibratome 섹션을 붓는다.
- 고정 vibratome 단면 조직의 면역 형광 염색
- 1X DPBS와 함께 24 웰 플레이트에 잘 당 5-12 vibratome 섹션을 배치합니다.
- 1X DPBS를 제거하고 잘 당 permeabilization 용액 500 μl를 추가합니다. 부드럽게 실온에서 25 분 동안 샘플을 바위.
- permeabilization 후 1X PBS로 샘플을 3 회 씻는다.
- 차단 솔루션의 500 μL에 적어도 30 분 동안 샘플을 차단합니다.
- 차단, 전자 후차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μL와 차단 솔루션을 체인지와 4 ° CO / N에서 샘플을 유지합니다.
참고 : 냉동 식품 및 파라핀 섹션에서 잘 작동 차 항체 희석은 일반적으로 그러나 일반적으로 프로토콜 (예를 들어, BrdU의) 잘 작동하지 않는 핵 항원 검색을 필요로하는 항체도 vibratome 섹션에서 잘 작동합니다. - 다음 일, 차단 솔루션으로 15 분 동안 샘플 때마다 세 번 씻는다.
- 세안 후, 차단 솔루션에 희석 차 항체의 500 μl를 적용합니다. 실온에서 2 시간 45 분 동안 샘플을 빛으로부터 형광을 보호하고 바위에 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 감싸.
- 15 분마다 1X PBS로 샘플을 3 회 세척하고 2.4 절에 설명 된대로 슬라이드 vibratome 섹션을 탑재합니다.
- vibratome 섹션을 장착
- vibratome 두 번 STI의 얇은 조각을 절단하여 장착 슬라이드를 준비CK 테이프와 슬라이드의 긴 측면을 따라 그들을 배치.
- 조심스럽게 1X PBS 100 ㎕의 드롭 슬라이드에 두 번 스틱 테이프 사이에 5 ~ 10 vibratome 섹션을 배치합니다.
- 모든 섹션을 펼치고 슬라이드에 걸쳐 단일 층으로 그들을 밖으로 확산.
- 평면 앉아에서 커버 슬립을 방지 할 수 초과 아가로 오스 또는 고르지 않은 비트를 제거합니다.
- 조심스럽게 vibratome 섹션 주위에서 초과 1X PBS를 흡수하기 위해 연구소 조직을 사용합니다.
- vibratome 부 위에 장착 수성 매질의 드롭을 추가 한 후 커버 슬립.
- VALAP가 면봉으로 적용 용융와 슬라이드로 된 커버를 밀봉.
- 이미지 중 하나를 세우거나 거꾸로 공 초점 현미경에 vibratome 섹션. 영상 시스템의 선택에 대한 더 자세한 설명을 참조하십시오.
전체 창자의 3 라이브 영상
창자 fetuse에서 수확연결된 대망가 그대로 유지와의 E12.5 후, 성공적으로 위의 시스템을 사용하는 문화에 융모을 개발한다. 따라서이 시스템은 생체 시간 경과 형태 형성의 3 차원 뷰를 위해 재구성 될 수있는 현상 장의 라이브 Z 단면 영상의 캡쳐를 허용한다.
- 라이브 영상 설정
- 좋은 메쉬 화면으로 개별 폴리 카보네이트 막을 부착 순간 접착제를 사용합니다. 이 수직으로 공 초점 현미경의 침지 렌즈 아래 장소에 소장을 보유하는 지원 발판을 제공합니다. 라이브 영상 현미경의 선택에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
- 중앙 잘 문화 판에 메쉬 스크린을 놓습니다.
- 폴리 카보네이트 막에 해부 장을 놓고 양쪽 끝에 순간 접착제 한 방울을 추가 할 수 있습니다. 장을 부착시킬만큼의 접착제를 사용하지만 코트 그것!
- 폴리 카보네이트 아래 페놀 레드의 문화 미디어 무료 추가중심도의 문화 판에서 막.
- 습도를 제공하도록 배양 플레이트의 외연에 물을 첨가.
- 이미징 동안 대장의 움직임을 제어하는 미디어 3 ㎖에 1X PBS에서 자일 라진 (xylazine)의 다섯 솔루션 : 태아 소장은 문화 수축의 연동과 같은 파도를 겪는 때문에, 하나의 100 μl를 추가합니다. 이 투여 량은 융모 발달을 손상시키지 않고 약 8 ~ 10 시간 동안 장 움직임을 제어합니다.
- 소장의 가로보기의 경우, 3 ~ 4 % 아가로 오스 솔루션의 라이브 창자를 포함하고 vibratome에 두꺼운 부분 (150 ~ 500 μm의) 잘라. 절단되는 소장의 강성 아가로 오스의 강성을 일치하고 경험적으로 발달 단계를 결정했다. 일반적으로, 3 % 아가로 오스 솔루션은 E14.5 미만의 창자에서 잘 작동하고 4 % 용액은 창자 E15-E16에 적합합니다.
- (섹션 3.1.1에서와 같이) 메시 스크린에 부착 된 폴리 카보네이트 멤브레인 vibratome 섹션을 붙인문화는 제 3.1.2-3.1.6에서 설명.
- 동조 테이블 직립 스탠드 이광자 형광 공 초점 현미경 (690-1,040 nm의 사이 여기 레이저)를 이용하여 실시간 이미징을 수행.
- 이광자 레이저 GFP 신호 최상의 해상도 깊은 용입을 제공 내지 900에 동조. 이미징 동안은 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한, 가능한 최저로 발광 레이저의 파워를 설정하는 조직 손상을 줄여 준다. 통상적으로, GFP의 좋은 자극을 구하는 이광자 레이저에 12 % 전력을 사용한다.
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Representative Results
이 시스템은 약리학 적 시약 또는 재조합 단백질과 시그널링의 조작을 가능으로 태아 내장의 전체 이식편의 배양은, 장 개발 좌표 시그널링 분자의 위치, 분포, 및 지속 시간의 분석을 허용한다. (월튼 외로부터 재생도 1a., 2012) 트랜스 웰 배양 시스템 (2)은 가능한 조직에 약물이나 단백질 침지 아가 로스 비드를 배치함으로써, 로컬 신호 원을 확립하게 공기 - 액체 계면 (도 1b드립니다 ). E10에서 E18.5에 배아에서 수확 창자는 트랜스 웰에 문화에서 생존과 움직임의 연동과 같은 파도를 받아야. 창자는 십일 정도 생존 또는 거칠게 P3, 토굴 형성이 첫번째 관찰 마우스 개발 단계에 E13.5에서 문화를 시작했다. 초기 단계의 창자 문화에서 생존하지만, 창자는 이전에 수확장막이 완전히 그 시간을 기준으로 소장 다루 성장하지 않았기 때문에 E12.5은 안정적 가능성이 융모 등장하지 않습니다. 월튼 등에서 재생 교양, 무대 대조군 (그림 1에 비해 개발이 다소 지연되고 있지만, E12.5, E13.5 또는 E14.5에서 문화에서 시작 중간 엽 클러스터를 형성하고 융모이 등장하고 창자에 길게 시작 알., 2012) 2. 에 관계없이 문화 (E12.5-E14.5)의 시작 소장의 무대, 창자는 항상 표시 24 시간의 대략적인 지연이있다. 이일을 위해 문화에서 자란 E14 창자는 자궁 (그림 1C-F)이 성장 E16 창자의 융모보다 E15 창자의 것과 더 유사하다 융모의 성장을 보여줍니다.
중간 엽 클러스터의 규칙적인 패턴은 E15.5 (그림 2에서 전체 PDGFRα GFP / + 소장의 광학 부분의 3 차원 재구성에 의해 밝혀 <에서 재생> / 강한 월튼 외., 2012) 2. 이 이미지는 라이카 LAS-AF 소프트웨어가 함께 물렸다 된 뷰의 54 필드의 Z-스택으로 구성되어 있습니다. 장 내부의 각 지점은 PDGFRα 궤적 (14)로부터 발현 핵 태그 GFP에 의해 시각 중간 엽 클러스터입니다. 이미지의 고해상도 확대 된 특정 영역에 세부 사항을 검사 할 뷰어를 할 수 있습니다, 그러나보기 또는 낮은 전력 배율의 하나의 필드에서 수집 할 수없는 깊이 공간 관계에 제공합니다. 영화 하나는 스티치 Z를 단계별로 시리즈입니다 3D 아르 -stack 이미지는 그림 2에 재건. 각각의 광 섹션은 클러스터 내에서 단일 세포로 세부 사항을 추가로 시각화 할 수 있습니다.
PECAM 항체와 장 혈관의 wholemount 면역 형광 광학 부분 (BD 파밍 557,355 1 희석 : 1000)는 두 광자 여기 및 정찰을 사용하여 캡처 한Imaris 소프트웨어 structed (그림 3). 장내 혈관이 입체 뷰 충분히 얇은 섹션 제제에 의해 인식 될 수없는 혈관의 복잡한 네트워크를 보여준다. 동영상이,도 3에 재구성 된 이미지의 회전 입체 프로젝션 방법의 추가 절상 허용 제공된 삼차원 재구성 증가 정보는 패터닝 구조체의 이해를 향상시킬 수있다.
Vibratome 단면은 가로 유리한에서 소장의 입체 볼 수 있습니다. 그림 4에서, 상피 세포와 주변 중간 엽 14 (PDGFRα GFP / +로 표시) 개발 클러스터의 관계는 (막 토마토 (Rosa26 만 T / mg)을 15 관찰 표시.
또한,이 관계는 항체 immunofluore 볼 수 있습니다(안티 PDGFRα (기도 Santacruz C-20로 표지, 녹색, 1 희석 : 200))를 중간 엽 클러스터 내려와 염색 (그림 5) 상피 (빨강, 안티 Ecadherin (BD 형질 연구소 610181 표지 1 : 1000 희석).
이는 전체 기관 배양 시스템은 태아 창자 개발이 광자 영상화를 허용하도록 확장 될 수있다. 이 셋업에서, 태아 소장은 더 큰 배양 용기에 메쉬 스크린을 지원하는 폴리 카보네이트 막 (그림 6)에 붙어있다. 공 초점 현미경 렌즈는 내부에 잘 장을 문의하는 문화 판의 큰 잘 크기는 할 수 있습니다.
트랜스 웰 배양 시스템에서 전체 태아 장의 그림 1. 개발. (A) 트랜스 웰의 (MEM)에 배치 태아 장BGJb 미디어를 6 웰 배양 플레이트에서 파괴 현상. 탑이 창자 E12.5 아르, 바닥이 창자는 E13.0이다. 트랜스 웰 배양 시스템에서 십이지장에 위치 (B) 소 혈청 알부민 배어 아가로 오스 비즈 (밝은 파란색). 어두운 파란색 얼룩 PTC는 LacZ를위한 X-분은 염색입니다 / + 고슴도치 기자 마우스 라인 마킹 중간 엽 클러스터에서 갓 수확 E14.0 (C), E15.0 (D) 및 E16의 16. (CF) 크로스 섹션. E-카드 헤린 (녹색) 및 DAPI (블루) 염색 0 (E), 십이지장 조직. E15.0 및 E16.0에서, 초기 융모가 볼 수 있습니다 동안 E14.0에서, unremodeled 상피 세포는 여전히 pseudostratified된다. (F) 이일을위한 장 (C)에서 본 것과 동일한 세그먼트하지만, 배양 (E14 + 이일은) 약간 지연하지만 융모가, 문화 발전 것을 보여줍니다. 패널 (CF)는 월튼 외에서 다시 인쇄됩니다., 2012 2 > SUP. Scalebars는 50 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
E15.5의 wholemount PDGFRα EGFP / + 소장에서 Z-스택의 스티치 필드의 그림 2 세 차원 재구성. 이미지가 부분적으로 재건 54 스티치 분야 (65 Z-섹션의 중심에서 5 일 μm의 섹션) 뷰의 900 nm에서 두 광자 레이저 여기로 반전 DMI 6000 스탠드에 LeicaSP5X 공 초점 현미경의 동력 단계를 사용하여 캡처. 라이카 LAS-AF 소프트웨어는 전체 이미지를 형성하기 위해 함께 Z-스택 물렸다. Scalebar는 1mm이다.
N "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 51,817 / 51817fig3highres.jpg "너비 ="500 "/>
E14 십이지장에서 장 혈관의 wholemount 방지 PECAM의 면역 형광을 나타내는 광학 부분의 그림 3 세 차원 재구성. 광학 섹션은 900 nm에서 3 ~에서 두 광자 여기에 서 수직 DMI 6000에 LeicaSP5X 공 초점 현미경에 붙 잡았다 차원은 Imaris 7.6 소프트웨어를 사용하여 재구성. Scalebar는 200 μm의입니다.
vibratome 단면 E15.5 PDGFRα EGFP의 그림 4 공 초점 이미지 / +; Rosa26 mTmG 소장은 자신의 위에있는 상피 세포와 중간 엽 클러스터 (녹색)의 PDGFRα EGFP / + 세포의 가까운 관계를 보여주는 중간 엽 주변 (빨간색, Rosa26 mTmG에서 막 토마토). < / strong>을 Scalebars 하부 패널에 50 상단 패널에 μm의 25 μm의 수 있습니다.
스테인드 항체 면역을했다 E15.5의 vibratome 단면 창자에서 공 초점 이미지의 그림 5 세 차원 복원은. Scalebar는 50 μm의입니다.
두 광자 라이브 영상을위한 트랜스 웰 배양 시스템의 6 적응 그림. (A) 화면이 배양 접시에 배치됩니다 메쉬. (B) 폴리 카보네이트 막 메쉬 스크린에 붙어있다. (C) 창자는 폴리 카보네이트 막에 붙어 페놀없는 DMEM 미디어 배양한다.
도 2에 E14 십이지장에서 PECAM 염색 혈관의 광 부분의 3 차원 재구성을 도시 영화 2 회전 영화.
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Discussion
동적 특성 및 개발 소장의 복잡한 조직 상호 작용은 이러한 형태 발생 이벤트의 전체 감사의 마음을 가지고 3D 시각화가 필요합니다. 이미징 기술 진화로, 능력 개발 / 개선과 함께, 기관 형성기 동안 공간 의사 소통과 상호 작용의 이해가 크게 향상되어 자세히 융모 형태 형성을 검사합니다.
전체 창자 배양 방법에 대해서도 테스트되었지만, 트랜스 웰 시스템은 긴 배양 시간에 대한 정상적인 클러스터 및 융모 패터닝을 유지하기위한 가장 신뢰할 남아있다. 입체 문화 시스템 (매트 리겔이나 콜라겐은) 젊은 창자 (E12.5-E15.5)의 짧은 배양 기간 (이하 24 시간) 잘 작동하지만, 창자는 효소와 폐기물을 연동 같은 움직임을 겪고 분비 시작하면 루멘으로 3 차원 기판은 잘 유지되지 않습니다. 액체 배양에서 창자의는, 그러나, 자유 부동 문화 방향에 대한 지원 또는 기준의 부족을 개발 클러스터 및 융모의 일반적인 패턴을 변경하기 위해 나타납니다. 따라서, 트랜스 웰 시스템은 클러스터 패터닝 및 융모 출현 파생물을 조사하는 것이 바람직하다.
덜 엄격한 세트 위로 wholemount 라이브 영상을위한 또 다른 방법은, 35 × 10 mm 플레이트의 하부에 7 % 아가로 오스의 얇은 층으로 태아 장을 부착하기 minutien 핀을 사용하는 것이다. 이 방법은 설정하기가 쉽지만, 마트 리겔이 장 분비물까지 보유하지 때문에 그 사용이 젊은 단계 (E12.5-E15.5) 이하 배양 시간에 대한 제한되어 있습니다.
배양 플레이트를 준비하기 위해, 단지 35 × 10 mm 플레이트의 하단을 커버하기에 충분한 용융 7 % 아가로 오스를 붓는다. 여전히 연성 동안 아가 로스의 중심에 유리 모세관 튜브를 놓는다. 아가로 오스가 고형화되면, 유리 모세관을 제거하고 t를 배치그는 잘 모세관에 의해 만들어 함께 소장을 태아. 장을 둘러싸고 마트 리겔 세트까지 37 ° C에서 배양 접시를 배치 마트 리겔 잘 모세관을 입력합니다. 조심스럽게 페놀 레드가없는 DMEM 문화 매체를 추가합니다. 습기 챔버를 만들기 위해 물을 60mm 판을 60 X 15mm 판 내부의 35 X 10mm 판을 놓고 입력합니다.
영역의 원하는 방향이 가시화 될 때 실장 방법 (wholemount 또는 vibratome)의 실시간 영상에 대한 선택을 기반으로한다. 예를 들어, 정점 및 기초 표면의 전망을 제공합니다 wholemounted 소장을 통해 상피 세포 모양의 변화, Z-스택을 볼 수 있습니다. 상피 시트 내의 상피 세포의 핵 마이그레이션을 interkinetic 보려면 vibratome 섹션 (가로)보기에 끝이 혀끝과 기저 표면을 관찰 할 수 있습니다.
시료의 제조는 최상의 묘화 결과를 산출 중요하다. vibratome 섹션 사용시차 표준 공 초점 현미경, 좋은 해상도는 삭제 시약없이 75 μm의 깊이를 달성 할 수있다. 영상의 깊이에 제한이 있으므로 현재 살아있는 샘플 비운 시약이 확인되지 않았다. 고정 된 샘플은, 청산 시약의 사용은 크게 영상의 깊이를 개선 할 수있다. 가장 좋은 형태를 제공하고 해상도 발견 청산 시약 초점 클리어 (17)이었다. 초점 명확하고 분명 마운트에 장착의 정화 30 분 후, 배아 내장의 모든 단계의 전체 깊이는 뛰어난 해상도로 이미지를 만들 수 있습니다. 저렴 청산 대안은 70 % 글리세롤, 배아 조직에 침투 그러나 최대 깊이 150 m, 그 후 해상도와 신호의 강도 손실이다.
한 가지 중요한 점은 신호가 대부분 장착되고 염색이 완성 된 같은 날에 몇 군데 아르 샘플에 정의되어 있다는 것입니다. (신호 보존 수성 장착 매체 설치이러한 연장 골드 안티 - 페이드 솔루션 (Life 기술 P36930)이 잠시 동안 만 신호를 보존하는 데 도움이되지만 않는; 깨끗한 이미지는 항상 샘플을 염색 및 장착 후 즉시 얻을 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A.
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
