Abstract
Fetal bağırsakta en morfogenetik süreçler gelişim aşamaları üzerinde değişikliklerin anlık sağlayarak, sabit dokuların ince kesitlerinin olayla edilmiştir. İnce Seri kesitlerde üç boyutlu bilgiler, çünkü mükemmel seri kesitler yeniden ve seri kesitler üzerinde dokusunun uygun yönünü sürdürmenin zorluğu yorumlamak zor olabilir. Tarafından Grosse ve ark. Son bulgular, 2011 bağırsak 1 gelişmekte villuslarda morfogenetiğine anlamada üç boyutlu bilgilerin önemini vurgulamak. Tek başına etiketli bağırsak hücreleri üç boyutlu yeniden yapılandırma bağırsak epitel hücrelerinin çoğunluğu her iki en üst ve taban yüzeylerine temas gösterdi. Ayrıca, epitel apikal yüzeyinde aktin hücre iskeletinin üç boyutlu rekonstrüksiyon bağırsak lümen sürekli olduğunu ve ikincil lümen s bir eserdir olduğunu gösterdiectioning. Bu iki nokta, bağırsak epitelinde interkinetic nükleer göç gösteri ile birlikte, bir yalancı epiteli olarak gelişen bağırsak epiteli tanımlanmış ve önceden 1 düşünce olarak tabakalı değil. Epitel üç boyutlu görebilme bu noktayı gösteren ve fetal bağırsakta epitel morfogenetiğine yeniden tanımlıyor ufuk açıcı oldu. Çoklu foton görüntüleme teknolojisi ve üç boyutlu rekonstrüksiyon yazılım evrimi ile, yeteneği hızla iyileştirilmesi organ geliştirmeyi, sağlam görselleştirmek için. İki foton uyarma yüksek çözünürlüklü dokulara daha az zarar penetrasyon derin verir. İki foton görüntüleme ve Walton vd. Tüm fetal fare bağırsak 3D rekonstrüksiyon 2012 villus akıbet 2 deseni tanımlamak için yardımcı oldu. Burada izin vermek için bu kültür sisteminin villus ve uzantıları ex vivo gelişimi sağlayan bir bütün organ kültür sistemi açıklanmaktadırbağırsaklar üç boyutlu gelişim sırasında görüntülenmiş olması.
Protocol
NOT: Tüm farenin Laboratuar Hayvan Hastalıkları Michigan Tıp Fakültesi Birimi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Üniversite Komitesi kurallarına göre protokollerini kullanarak insanca ele alındı.
1. Tüm Organ Kültür Sistemi
- Medya ve kültür plakalarının hazırlanması
- Bir doku kültürü kaputu, stok şişe edilebilen BGJb ortamdan 5 ml kaldırmak ve Kalem / Strep 5 ml ekleyin. 5 mg / (Pen / Strep) ile edilebilen BGJb ortam 49 ml ml askorbik asit 1 ml ilave etmek suretiyle, 50 ml'lik konik bir tüp içinde bir ortam çalışma stok hazırlayın.
- Transwells her altında 1 ml ilave etmek suretiyle, bir 6 yuvalı kültür plakası hazırlayın.
NOT: Tüm 6 transwells kullanılan değilseniz, daha sonra kullanmak üzere yeni bir steril 6 plaka ekstra transwells taşıyın. Üç adet 10 cm steril petri kutularının her birine edilebilen BGJb ortam çalışma 3 ml ilave edilir.
- Diseksiyon için Hazırlık
- 70% Etal içinde diseksiyon araçları batırınve metanol çalışırken temiz araçları tutmak için emin olun.
- Büyük bir buz kovası ile diseksiyon alanı ayarlayın ve 6 kuyu kültür plaka ve buz üzerinde edilebilen BGJb medya ile 10 cm petri kapları yerleştirin. Diseksiyon ve kültür için bağırsakları hazırlarken mümkün olduğunca buz üzerinde çalışın.
- Fetal bağırsakların toplama için servikal dislokasyon izofluoran (100 ul) önce euthanization için olan bir oda içinde erişkin dişi fareler anestezi.
- Onların anneden fetusa hasat ettikten sonra, her fetusun dikkatli grafiği 13 evreleme Theiler göre düzenlerler. Rutin bir tek çöp içinde gözlenen gelişimsel aşamada kadar 24 saat varyasyonları olarak her fetusun yaşını belirlemek için post-koitus günlerde güvenmeyin.
- Fetal bağırsak diseksiyonu
- Bağırsakların kaldırılması için önce, başı kesilerek fetüsleri Euthanize.
- Pla sonra 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) her bağırsak inceleyin veedilebilen BGJb ortamı çalışan bir 10 cm'lik bir petri kabı içine ce.
- Dikkatlice mide, dalak, mide ve oniki parmak bağırsağı üst elde edilen pankreasa, kaldırın.
- Yavaşça doğruldu bağırsak izin mümkün ve yalnızca yeterli bağlantılarını ayıran olduğunca bağlı omentum bırakmak için özen omentum ayırın.
Not: yavaşça lümen içeriği bağırsak yoluyla akması ve kesik uçlarından çıkarılmasına imkan vermek için 3 eşit bölümlere ayırmak bağırsak bağırsak E14.5 daha büyük veya daha fazla olanlar, 24 saat daha kültive edilir için. Bununla birlikte, kültürlerin E13.5 önce, serozayı uygun bağırsak uzunluğu boyunca büyümeye izin bağırsak 3 kısımları ayıran önce kültürlenmesi kadar 24 saat sonra başladı bekleyin. - Kültür plakası (1.1.2) transwells üzerine bağırsak parçaları aktarmak için bir ağız pipeti kullanılır.
- Onlar transwel genelinde düz böylece gerektiği gibi yavaşça bağırsakları yeniden konumlandırmakl.
NOT: bağırsaklar tüp yoluyla lümen içeriğini hareket başladıktan sonra, bağırsakta herhangi bir karışıklığı bağırsağa bir yedekleme ve hasara neden olur.
- Kültür ve tedavi
- , Transwell altından medyayı çıkarın transwell altında (ilave rekombinant proteinlerin veya farmakolojik inhibitörleri ile medya çalışma) tedavi medya 700 ul ekleyin.
- Bağırsakların üstüne tedavi medya damla damla 300 ul ekleyin ve transwell yoluyla bekletin. Gerekirse bağırsakları yerleştirin.
- Tedavi reaktif yarı ömrüne bağlı olarak en az günde bir kere ya da daha çok muamele ortam değiştirin.
- Tedavi reaktif lokalize bir protein kaynağı batırılmış agaroz taneleri hazırlanması
- Kendi depolama kabı agaroz boncuklar tekrar ve 1.5 ml mikrofüj tüpüne agaroz boncuklarının 100 ul transfer.
- Steril 1x Ph borunun geri kalan hacim dolumunaosphate-tamponlu salin (PBS) ile yıkamak üzere, taneler üzerine karıştırın. Birkaç dakika boncuklar dibe ve daha sonra tanelerin üzerine PBS kapalı Pipeti izin vermek üzere askıya mikrofüj tüpü yerleştirin. Steril 1x PBS ile mikrofuge'ye tüp dolum ve iki kez daha yıkama işlemini tekrarlayın.
- Iki kez tedavi için istenen konsantrasyona ve ilgi konusu proteini hazırlayın.
- 2x Protein stoklar 5 ul ile yıkanmış agaroz boncuk 5 ul karıştırın ve yavaşça protein boncuk çalkalayın. Yavaşça, 10-15 dakika daha karıştırıldı, 1 saat boyunca buz üzerinde tüp yerleştirin.
- Bağırsakların boncuk yerleştirmeden önce steril 1x PBS kısaca boncuk durulayın.
- Agaroz boncukları Yerleştirme
- Yavaşça çekilmiş kılcal iğneli bir ağız pipeti kullanılarak bağırsakların üst agaroz boncuklar yerleştirin. Kaba işleme bağırsaklara zarar ve yaralı bölgede villus gelişimini önleyecek şekilde aşırı ihtiyatla boncuk yerleştirin.
- Bağırsak peristaltik hareketleri ve kültür zamanla bağırsakların inecektir yerleştirilen boncuklar yaklaşık yarısını geçirecek beri analiz için gerekli iki katı kadar boncuk yerleştirin.
- Kültürlü bağırsakların Fixation
- Dikkatle transwell alttan tedavi ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca havada kurumaya bağırsakları izin verir.
- Daha sonra tespit süresinin geri kalan kısmı için sabitleyici 2 ml bağırsağın üst kapağı, 2 dakika boyunca transwell altında fiksatif 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 2 saat süresince% 4 paraformaldehit O / N sabitleyin.
Sabit Bağırsaklar 2. Görüntüleme
- Wholemount görüntüleme
- DPBS 1x 100 ul, bir lam üzerine (iç floresan ile) bütün bağırsak yerleştirin. Yavaşça bağırsaklara düzenlemek için forseps kullanın.
- Mo doku yapmak için dikkatli bir şekilde% 70 gliserol, 100 ul DPBS çıkarın ve hemen eklemek için bir laboratuar doku kullanınşeffaf yeniden ve görüntüleme olası derinliğini artırır.
Not: bağırsağın başka penetrasyon isteniyorsa yerine% 70 gliserol içinde bağırsak Sabitleme, 10-30 dakika boyunca Odak sonuçları çözeltisinin bir kaç damla bağırsak ıslatın. Odak Temizle çözümü kapalı pipetlemeyin Mount Clear bağırsak monte edin. - Modelleme kil içine lamel dört köşesinden her batırın ve bağırsak düzleştirme lamel tutmak için slayt ve kapak arasında ayırıcı olarak kullanmak için kil küçük bir miktar pick up.
- Bir pamuklu çubukla uygulanan erimiş valap ile slayt üzerine lamel mühür.
- Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop bağırsaklar. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakınız.
- (Bağırsak yapıların enine kesit görünümü için) sabit bağırsak vibratome kesit
- Küçük plastik kalıplar% 7 agaroz katıştırmak için bağırsak (10 x 10 x 15 mm), izin agaroz bloklarsoğumaya ve katılaşmaya.
- Anlık yapıştırıcı ile Vibratome toplama aşamasına plastik kalıp ve tutkal agaroz bloklardan agaroz blokları çıkarın.
- Buz gibi soğuk 1x DPBS toplama sahne doldurun.
- 100-150 um arasında bir kalınlıkta kesitler halinde kesilmiştir. Kalın kesitler kesiti içine derin görselleştirmek için (bölüm 2.1.2 açıklanan) takas çözümleri kullanın.
- 4 ° C de depolama için, bir 6-yuvalı plaka içinde bir kuyu içine toplama aşamasından vibratome bölümleri dökün.
- Sabit, Vibratome kesitli dokuların İmmünofloresan boyanması
- 1x DPBS ile bir 24-yuvalı plaka içine, göz başına 5-12 vibratome bölümleri yerleştirin.
- 1x DPBS çıkarın ve oyuk başına geçirgenleştirme çözeltisi 500 ul ilave edin. Yavaşça oda sıcaklığında 25 dakika boyunca sallayın örnekleri.
- Geçirgenleştirmeden sonra, 1x PBS ile numuneleri 3 kere yıkayın.
- Bloke etme çözeltisi 500 ul içinde en az 30 dakika boyunca numune bloke eder.
- Engelleme, e sonraçözümü engelleme seyreltilmiş primer antikor 500 ul engelleme çözüm Xchange ve 4 ° CO / N de örnekleri tutmak.
NOT: Dondurulmuş ve parafin bölümlerde işe birincil antikor dilüsyonları genellikle Ancak genellikle bu protokolü (örneğin, BrdU) ile iyi çalışmaz nükleer antijen alımı gerektiren antikorlar, çok Vibratome bölümlerde iyi çalışır. - Ertesi gün, bloke etme çözeltisi ile 15 dakika boyunca numuneleri her 3 kez yıkayın.
- Yıkamadan sonra, bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 500 ul de geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat 45 dakika boyunca örnekleri ışıktan korumak ve kaya florofor için alüminyum folyo ile 24 oyuklu plaka sarın.
- 15 dakika her biri için 1x PBS ile numuneleri 3 kez yıkayın ve Bölüm 2.4 'de açıklandığı gibi slaytlar üzerinde vibratome bölümleri monte edin.
- Vibratome bölümleri Montaj
- Vibratome çift sti ince dilim keserek montaj için slaytlar hazırlayınck bant ve slaytlar uzun kenarları boyunca onları yerleştirerek.
- Dikkatle 1x PBS 100 ul bir damla slaytlar üzerinde çift kaset sopa arası 5-10 vibratome bölümleri yerleştirin.
- Tüm bölümlerini açın ve slaytta tek bir tabaka içine yayıldı.
- Düz oturan bir coverslip engelleyecek herhangi bir aşırı agarozun veya düzensiz parçalarını çıkarın.
- Dikkatle Vibratome bölümler etrafında aşırı 1x PBS kadar emmek için bir laboratuar doku kullanın.
- Vibratome bölümlerin üstüne monte sulu ortam bir damla ekleme ve sonra da lamel.
- Valap bir pamuklu çubukla uygulanan eritilmiş slaytlar üzerine lamelleri Seal.
- Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop vibratome bölümleri. Bir görüntüleme sisteminin seçimi konusunda ayrıntılı bilgi için tartışmaya bakınız.
Tüm Bağırsaklar 3. Canlı Görüntüleme
Bağırsaklar fetuse hasatBağlı omentum sağlam sol s ile E12.5 sonra, başarıyla yukarıdaki sistemini kullanarak kültür içinde villus gelişir. Bu nedenle, bu ex vivo sistem zamanla morfolojilerinden bir üç boyutlu görünüm için yeniden olabilir gelişen bağırsak canlı z-bölüm görüntüler yakalama izin verir.
- Canlı görüntüleme ayarlama
- Ince örgülü elek için tek bir polikarbonat membran bağlı anında tutkal. Bu dik konfokal mikroskop daldırma lens aşağıda yerinde bağırsak tutmak için bir destek iskele sağlar. Canlı görüntüleme mikroskoplar seçimi hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakınız.
- Merkezinde iyi bir kültür tepsisi içine elek yerleştirin.
- Polikarbonat membran üzerine disseke bağırsak yerleştirin ve her iki ucunda anlık tutkal bir damla ekleyin. Bağırsak tutturmak için yalnızca yeterli tutkal kullanın, ama ceket o!
- Polikarbonat altında fenol kırmızısının kültür ortamı ücretsiz eklentiMerkezi de kültür plakasında membran.
- Nem temin etmek üzere kültür plakasının dış kenarı için su ilave edilir.
- Görüntüleme sırasında bağırsak hareketini kontrol etmek için ortam 3 ml 1 x PBS'de ksilazin 5 çözeltisi: fetal barsak kültürde peristaltik kasılma benzeri dalgalar maruz kaldığından, 1 100 ul ilave edin. Bu dozaj villus gelişimini ödün vermeden yaklaşık 8-10 saat bağırsak hareketlerini kontrol edecek.
- Bağırsağın bir enine görünüm için, 3-4% agaroz çözeltisi içinde canlı bağırsakları gömmek ve bir vibratom kalın kesitler (150-500 mikron) kesilir. Kesilmiş olarak, bağırsak sertliğe sahip agaroz sertliğini maç ve ampirik olarak bir gelişme aşamasındaki belirlenir. Genellikle,% 3 agaroz çözüm E14.5 daha genç bağırsaklar için iyi çalışır ve% 4 çözelti bağırsaklar E15-E16 için iyi çalışır.
- (Kısım 3.1.1 gibi) gözenekli bir elek tutturulmuş bir polikarbonat membran vibratome bölümleri ve TutkalKültür olarak Bölüm 3.1.2-3.1.6 tarif edilmiştir.
- Ayarlanabilir bir tablo ile dik bir stand üzerine bir iki-foton konfokal floresan mikroskop (690-1,040 nm arasında uyarma lazer) kullanılarak canlı görüntüleme Davranış.
- İki foton lazer GFP sinyalleri için en iyi çözünürlük ile derin penetrasyon sağlar nm 900 ayarlı. Görüntülenir iken bu dokulara zarar azaltır. Buna ek olarak, mümkün olan en düşük emisyon için lazerin gücünü ayarlayıcı, doku hasarı azaltır. Tipik olarak, GFP iyi bir uyarma elde iki foton lazer% 12 güç kullanmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sistem farmakolojik reaktifler veya rekombinant proteinleri ile sinyalizasyon manipülasyon sağlayan fetal Bağırsakların tüm eksplantlarının Kültür, bağırsak gelişimini koordine sinyal moleküllerinin konumu, dağılımı ve süresi analizler için izin verir. (Walton ve ark yeniden Şekil 1A., 2012) Transwell kültür sistemi 2 mümkün doku üzerine ilaç veya proteini batırılmış agaroz boncuklar yerleştirmek ve böylece lokal sinyal kaynaklarının bir şekilde sağlayan bir hava-sıvı arayüzü (Şekil 1B içerir ). E10 E18.5 embriyo hasat Bağırsaklar transwells kültürün hayatta ve hareket peristaltik gibi dalgalar tabi. Bağırsaklar 10 gün, yaklaşık hayatta ya da kabaca P3, kript oluşumu ilk görülmektedir fare gelişme aşamasında E13.5 kültüre başladı. Erken evre bağırsak kültürü hayatta olsa, bağırsaklar önce hasatSerozayı tamamen o zaman bağırsak kapladı değil çünkü E12.5, güvenilir olası villus doğmazlar. Walton et çoğaltılamaz kültürsüz, sahne-uyumlu kontrollere (Şekil 1 ile karşılaştırıldığında gelişim biraz gecikmeli olsa, E12.5, E13.5 veya E14.5 kültüre başladı Mezenkimal kümeleri oluşturmak ve villus ortaya ve bağırsaklarda uzatmak başlar ark. 2012) 2'dir. Ne olursa olsun kültür (E12.5-E14.5) başlangıcında bağırsağın aşamasının, bağırsak, her zaman ortaya 24 saat yaklaşık bir gecikme vardır. İki gün boyunca kültür yetiştirilen E14 bağırsaklar rahimde (Şekil 1C-F) 2 yetiştirilen E16 barsakların villuslarında daha E15 bağırsakların olanlara daha benzer villus büyüme göstermektedir.
Mezenkimal kümelerin düzenli desen E15.5 (Şekil 2 de bir bütün PDGFRα GFP / + bağırsak optik kesit üç boyutlu rekonstrüksiyon ile ortaya <Çoğaltılamaz, / strong> Walton ve ark., 2012) 2. Bu görüntü, Leica, LAS AF yazılımı ile birlikte dikilmiştir bakış alanları 54 Z yığınlarının oluşur. Bağırsak içindeki her nokta PDGFRα mahaline 14'ten ifade nükleer tagged GFP tarafından görüntülenmiştir mezenkimal kümesidir. Görüntünün yüksek çözünürlüklü büyütücüyü bazı alanlarda ayrıntılarını incelemek için görüntüleyici sağlar, henüz görünüm veya daha düşük güç büyütme tek alanlardan toplanan edilemez derinlik mekansal ilişkilerde sağlar. Movie 1 dikişli z atlama bir dizi 3D vardır -stack görüntüleri Şekil 2'de yeniden. bireysel optik bölümler gibi kümeler tek hücre gibi detayların daha görselleştirme için izin.
PECAM antikor ile bağırsak damar Wholemount imünofosfor Optik bölümleri (BD Pharmingen 557.355; 1 seyreltilmiş: 1000) İki foton uyarma ve keşif kullanarak ele geçirildiImaris yazılımı ile oturtulmuştur (Şekil 3). Bağırsak, kan damarlarının bu üç-boyutlu görünüşüdür, tam ince kesit preparatları ile takdir edilemez damar karmaşık bir ağı göstermektedir. Film 2, Şekil 3 'de, yeniden oluşturulan imgesi, bir döner üç boyutlu projeksiyon nasıl daha da takdir sağlar sağlanan üç boyutlu rekonstrüksiyon ile artan bilgi yapısal desenlendirmenin anlayışı artırabilir.
Vibratome kesit enine bir Vantage bağırsak üç boyutlu izlenmesine olanak verir. Şekil 4'te, epitel ve çevresindeki mezenşimin ile 14 (PDGFRα GFP / + ile işaretli) gelişmekte kümelerinin ilişkisi (membran Domates (Rosa26 mT / mG) 15 gözlenmektedir ile işaretlenmiş.
Alternatif olarak, bu ilişki antikor immunofluore tarafından görülebilir(Anti-PDGFRα (SantaCruz C-20 ile işaretlenmiş yeşil, 1; seyreltilmiş: 200)) mezenkimal kümelerinin scence boyama (Şekil 5) ile birlikte epitel (kırmızı, anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181 ile işaretlenmiş 1: 1000 seyrelti).
Bütün bu organ kültürü sisteminde aynı zamanda fetal bağırsak geliştirme iki foton görüntüleme sağlamak için uzatılabilir. Bu düzenleme içinde, fetal bağırsak daha büyük bir kültür plakasında, bir elek ile taşınan bir polikarbonat membran (Şekil 6) yapıştırılmıştır. Konfokal mikroskop lensleri içinde de bağırsak irtibat için kültür plakasının daha iyi boyutu sağlar.
Bir Transwell kültür sistemi içinde bütün fetal barsakların Şekil 1. Geliştirme. (A), bir Transwell mem yerleştirilir fetal bağırsakedilebilen BGJb ortamı ile bir 6 yuvalı bir kültür tepsisi içine membran. En iyi iki bağırsak E12.5 olan, iki alt bağırsak E13.0 bulunmaktadır. Transwell kültür sisteminde bir duodenum üzerine yerleştirilmiş (B), bovin serum albümini batırılmış agaroz boncukları (açık mavi). Koyu mavi leke Ptc LacZ'nin X-gal lekelenmesidir / + Kirpi muhabir fare hattı işaretleme mezenkimal kümeler taze hasat E14.0 (C), E15.0 (D) ve E16 16. (CF) kesitler. E-kaderin (yeşil) ve DAPI (mavi) ile boyanmıştır 0 (E), oniki parmak bağırsağı dokusu. E15.0 ve E16.0 de olgunlaşmamış olan tüy görebilir ise E14.0 olarak, epitel unremodeled hala yalancı edilir. (F) iki gün için bir bağırsak (C) 'da görülene benzer kademeli ama kültür (E14 2gün) biraz gecikmeli olsa da villus, kültürü geliştirmek olduğunu göstermektedir. Paneller (CF) Walton ve ark yeniden basıldı edilir. 2012 2 > sup. Scalebars 50 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + bağırsak z yığınlarının dikişli alanları Şekil 2. Üç-boyutlu rekonstrüksiyon. Görüntü kısmi bir yeniden yapılanma olduğunu 54 dikişli alanlardan (65 z-bölümlerin merkezine beş 1 mikron kesitler) Görüş 900 nm'de iki-foton lazer uyarma ters bir DMİ 6000 standında LeicaSP5X konfokal mikroskop motorlu sahne kullanılarak çekilen. Leica LAS-AF yazılım tüm görüntüyü oluşturmak üzere bir araya Z-yığınları dikişli. Ölçek çubuğu 1 mm'dir.
n "src =" / files / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
E14 duodenum bağırsak damar Wholemount anti-PECAM .bağışık gösteren optik kesit Şekil 3. Üç-boyutlu rekonstrüksiyon. Optik bölümleri 900 nm ve üç iki-foton uyarılması ile ayakta dik bir DMI 6000 tarihinde LeicaSP5X konfokal mikroskop ele geçirildi boyutsal Imaris 7.6.1 yazılımı kullanarak yeniden. Ölçek çubuğu 200 mikron.
Vibratome kesitli E15.5 PDGFRα EGFP Şekil 4. Konfokal görüntüler / +; Rosa26 mTmG jejunumda da örten epitel ile mezenkimal kümeler (yeşil) PDGFRα EGFP / + hücrelerinin yakın ilişkiyi gösteren ve mezenşimi çevreleyen (kırmızı; Rosa26 mTmG membran domates). < / Strong> Scalebars alt panellerde 50 üst panelleri um ve 25 mikron.
Lekeli antikor .bağışık vardı E15.5 Vibratome kesitli barsaklardan konfokal görüntüleri Şekil 5. Üç boyutlu rekonstrüksiyon. Ölçek çubuğu 50 mikron.
2-foton canlı görüntüleme için Transwell kültür sisteminin 6. Adaptasyon Şekil. (A), ekran bir kültür kabı içine yerleştirilir Mesh. (B), polikarbonat membran gözenekli bir elekten yapıştırılmıştır. (C) Bağırsaklar polikarbonat membran yapıştırılmış ve fenol içermeyen DMEM ortamı ile kültürlenir.
Şekil 2'de E14 duodenumda PECAM lekeli damar optik kesit, üç-boyutlu yeniden yok Film 2. Döner bir film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dinamik yapısı ve gelişen bağırsak karmaşık doku etkileşimleri bu morfogenetik olayların tam bir takdir 3D görselleştirme gerektirir. Görüntüleme Gelişen teknolojiye, yetenek / gelişmekte iyileştirilmesi ve onunla, organogenezis sırasında mekansal iletişim ve etkileşim anlayışı oldukça gelişmiş edilir detaylı olarak villus morfogenetiğine incelemek.
Bütün bağırsakları kültürü için alternatif yöntemleri de test edilmiştir, ancak Transwell sistem uzun kültür süreleri ve normal küme ve villus desenlendirme korumak için en güvenilir kalır. Üç boyutlu kültür sistemleri (matrigel veya kollajen) genç bağırsakların (E12.5-E15.5) kısa kültür dönemlerinden (en az 24 saat) için iyi çalışır, ancak bağırsak enzimleri ve atık peristaltik gibi hareketler geçiyor ve salgılayan başladığınızda lümenine, üç boyutlu yüzeyler o kadar iyi değildir. Sıvı kültürde Bağırsaklars Ayrıca, ancak, serbest bir kültürde yönlendirme için destek veya referans eksikliği gelişecektir kümeleri ve villus normal desen değiştirmek için görünür. Bu nedenle, Transwell sistem küme desenlendirme ve villus çıkışını ve akıbet incelemek için tercih edilir.
Daha az sıkı bir set up wholemount canlı görüntüleme için bir başka yöntem, bir 35 x 10 mm levha alt% 7 agaroz ince bir tabaka fetal bağırsak sabitlemek için minutien işaretçilerini kullanmaktır. Bu yöntem kurmak daha kolay olsa da, matrigel bağırsak salgıları kadar tutun çünkü kullanımı daha genç aşamalarında (E12.5-E15.5) veya daha kısa kültür kez sınırlı olduğunu unutmayın.
Kültür levhalarını hazırlamak için, bir 35 x 10 mm levhanın alt kapağı için yeterli erimiş 7% agaroz dökün. Hala yumuşak iken, agaroz merkezinde bir cam kılcal tüp yerleştirin. Agaroz bir kez katılaştınldıktan sonra cam kılcal çıkarın ve t yerleştirmekO iyi kılcal tarafından oluşturulan boyunca bağırsağı Fetal. Bağırsak çevreleyen ve matrigel sertleşinceye kadar, 37 ° C 'de kültür kaplarına yerleştirmek için Matrigel ile de kılcal doldurun. Dikkatli bir şekilde fenol kırmızısı içermeyen DMEM kültür ortamı eklenir. Nemli bir oda oluşturmak için su ile 60 mm levha, 60 x 15 mm levha iç 35 x 10 mm plaka koyun ve dolgu.
Alanın, istenen yönlendirme görselleştirilmeye üzerine montaj metodu (wholemount veya vibratome) canlı görüntüleme için seçimi dayanır. Örneğin, apikal ve bazal yüzeyler manzaralar sunacak bir wholemounted bağırsak yoluyla epitel hücre şekli değişiklikleri, z-yığınları görmek için. Epitel tabakanın içindeki epitel hücrelerinin nükleer geçişini interkinetic görüntülemek için, vibratome profiller (enine) bir uç görünüm üzerinde en üst ve taban yüzeyleri gözlemlemek mümkün olmaktadır.
Numunelerin hazırlanması için en iyi sonuçları veren görüntüleme için çok önemlidir. Vibratome bölümleri bir kullanıldığındand standart konfokal mikroskopi, iyi bir çözünürlük bir takas ayıraç olmaksızın 75 mikron derinliğe kadar elde edilebilir. Görüntüleme derinliği sınırlıdır böylece Mevcut durumda, numuneler için bir Temizleme maddesi henüz tespit edilmemiştir. Sabit örnekler için, bir temizleme maddesinin kullanımı büyük ölçüde görüntüleme derinliğini artırır. En iyi morfoloji sağlamak ve çözünürlük bulundu Temizleme maddesi Odak Temizle 17 oldu. Odak açık ve net Mount montaj takas 30 dakika sonra, embriyonik bağırsakların tüm aşamalarında tüm derinliği, mükemmel çözünürlük ile görüntülenebilir. Daha az pahalı takas alternatif% 70 gliserol, embriyonik dokularda penetrasyon ancak maksimum derinliği 150 m, sonra çözünürlük ve sinyal yoğunluğu kaybolur olduğunu.
Bir diğer önemli nokta sinyalleri en monte edilir ve boyama tamamlanan aynı gün görüntülenmiş örneklerde tanımlandığı olmasıdır. (Sinyal koruyucu sulu yerleştirme ortamı ile montajBöyle Prolong altın, anti-solmaya solüsyonu (Life Technologies P36930) sadece kısa bir süre sinyal koruyarak ile yardımcı, ama yok gibi; net görüntüler her zaman örnekleri boyama ve montaj hemen sonra elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A.
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
