Abstract
A maioria dos processos morfogenéticos no intestino fetal têm sido inferida a partir de lâminas finas de tecidos fixados, oferecendo instantâneos de mudanças ao longo do estágio de desenvolvimento. Informação tridimensional de cortes seriados finos podem ser difíceis de interpretar por causa da dificuldade de reconstrução de cortes seriados perfeitamente e manter a orientação adequada do tecido sobre cortes seriados. Recentes descobertas por Grosse et al., 2011 destacam a importância de três informações dimensional na compreensão morfogênese das vilosidades desenvolvimento do intestino 1. A reconstrução tridimensional de células intestinais isoladamente marcadas demonstraram que a maioria das células epiteliais intestinais em contato com ambas as superfícies apicais e basais. Por outro lado, a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina para a superfície apical do epitélio demonstrado que o lúmen intestinal é contínua e que lúmens secundários são um artefacto sectioning. Estes dois pontos, juntamente com a demonstração de migração nuclear interkinetic no epitélio intestinal, definido o epitélio intestinal em desenvolvimento como um epitélio pseudo estratificado e não como se pensava anteriormente 1. A capacidade de observar o epitélio tridimensionalmente foi seminal para demonstrar este ponto e redefinindo morfogênese epitelial no intestino fetal. Com a evolução da tecnologia de imagem multi-fotão e software de reconstrução tridimensional, a capacidade de visualizar intacta, o desenvolvimento de órgãos está melhorando rapidamente. Dois fótons de excitação permite a penetração mais profunda menos prejudiciais para os tecidos com alta resolução. Dois fótons e reconstrução 3D de todo o intestino do feto de rato em Walton et al., 2012 ajudou a definir o padrão de vilo conseqüência 2. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura de órgão inteiro que permite ex vivo desenvolvimento de vilosidades e extensões desse sistema de cultura para permitiros intestinos para ser tridimensionalmente fotografada durante o seu desenvolvimento.
Protocol
NOTA: Todos os camundongos foram tratados com humanidade usando protocolos aprovados pela Universidade de Michigan Medical School Unidade de Medicina Laboratorial Animal e de acordo com as orientações do Comitê da Universidade de uso e cuidados dos animais.
1. Whole sistemas de órgãos Cultura
- Preparação de meios de comunicação e placas de cultura
- Em uma cultura capuz tecido, remover 5 ml de meio BGJb da garrafa estoque e adicionar 5 ml de Pen / Strep. Prepare um estoque de trabalho de mídia em um tubo de 50 ml, adicionando 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de meio BGJb (com Pen / Strep).
- Preparar uma placa de cultura de 6 poços por adição de 1 ml por baixo de cada um dos transwells.
NOTA: Se todos os 6 transwells não são utilizados, mova transwells extras em uma nova estéril placa de 6 poços para uso posterior. Adicione 3 mL de meios de trabalho BGJb para cada uma de três placas de Petri de 10 centímetros estéreis.
- Preparação para dissecção
- Mergulhe ferramentas de dissecação em 70% ethanol e não se esqueça de manter as ferramentas limpas, enquanto trabalhava.
- Configure a área de dissecação com um grande balde de gelo e coloque a placa de cultura de 6 poços e 10 centímetros de Petri com meio BGJb no gelo. Trabalhar no gelo, tanto quanto possível, enquanto dissecar e preparar o intestino para a cultura.
- Anestesiar ratos fêmea adulta em uma câmara com isofluorano (100 l) antes de eutanásia por deslocamento cervical para a exploração dos intestinos fetais.
- Após a colheita os fetos de sua mãe, encenar cada feto cuidadosamente de acordo com o gráfico 13 Theiler encenação. Não confie nos dias pós-coito para determinar a idade de cada feto como variações de até 24 horas, em fase de desenvolvimento são rotineiramente observado em uma única ninhada.
- Dissecção da intestinos fetais
- Eutanásia fetos por decapitação antes da remoção do intestino.
- Dissecar cada intestino em 1x de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e place-lo em uma placa de petri 10 centímetros com o trabalho de mídia BGJb.
- Cuidadosamente remover o baço do estômago e do pâncreas do estômago e duodeno superior.
- Suavemente separar o omento tendo o cuidado de deixar o omento ligado, tanto quanto possível, e que separa as ligações apenas o suficiente para permitir que o intestino para ser esticado.
NOTA: Para o intestino mais velhos do que os que são ou E14.5 cultivadas mais do que 24 horas, cuidadosamente separar o intestino em três segmentos iguais para permitir conteúdo luminal para fluir através do intestino e ser expelido das extremidades cortadas. No entanto, para as culturas iniciadas antes E13.5, esperar até que após 24 horas de cultura antes de se separar os três segmentos do intestino para permitir que a serosa para crescer adequadamente ao longo do comprimento do intestino. - Usar uma pipeta de boca para transferir as peças intestinais para os transwells da placa de cultura (1.1.2).
- Gentilmente reposicionar os intestinos como necessário para que eles fiquem em frente a Transwell.
NOTA: Uma vez que os intestinos começam a se mover conteúdo luminal através do tubo, todas as torções no intestino fará uma cópia de segurança e danos ao intestino.
- Cultura e tratamento
- Remova a mídia sob o transwell, adicionar 700 mL de mídia (media de tratamento que trabalham com proteínas recombinantes adicionados ou inibidores farmacológicos), sob o transwell.
- Adicionar 300 mL de meio de tratamento gota a gota, em cima dos intestinos e deixe de molho por meio da transwell. Reposicionar os intestinos, se necessário.
- Mudar meio de tratamento, pelo menos, uma vez por dia ou mais frequentemente, dependendo da meia-vida do reagente de tratamento.
- Preparação de esferas de agarose de proteína embebido por uma fonte localizada de tratamento reagente
- Ressuspender as esferas de agarose em seu recipiente de armazenagem e transferência de 100 ul de esferas de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Encher o volume restante do tubo estéril com 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e misturar as contas para lavá-los. Colocar o tubo de microcentrífuga num bastidor durante alguns minutos para permitir que os grânulos se depositem no fundo e, em seguida, para fora da pipeta a partir de PBS no topo dos grânulos. Tornar a encher o tubo de microcentrífuga estéril com 1x PBS e repetir o processo de lavagem mais duas vezes.
- Prepare a proteína de interesse em duas vezes a concentração desejada para o tratamento.
- Misturar 5 mL de pérolas de agarose lavados com 5 l de estoque a proteína 2x e agitar suavemente as pérolas em proteína. Colocar o tubo em gelo durante 1 hora, misturando suavemente cada 10-15 min.
- Lavar as contas brevemente em estéril 1x PBS, antes de colocar as contas no intestino.
- Colocação de pérolas de agarose
- Coloque suavemente as esferas de agarose no topo do intestino utilizando uma pipeta de boca com agulhas capilares puxados. Coloque as contas com extrema cautela, como manuseio descuidado pode danificar o intestino e prevenir o desenvolvimento de vilosidades no local da lesão.
- Inserir o dobro de grânulos como são necessários para a análise uma vez que os intestinos irá sofrer movimentos peristálticos e cerca de metade das pérolas colocadas sairão dos intestinos mais o tempo de cultura.
- Fixação de intestinos cultivadas
- Retire cuidadosamente a mídia de tratamento abaixo do transwell e permitir que os intestinos para o ar seco por 3 min.
- Adicionar 1 ml de fixador sob a transwell durante 2 min, em seguida cobrir a parte superior do intestino com 2 ml de fixador para o restante do tempo de fixação. Fixar com paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C ou durante 2 horas à temperatura ambiente.
2 Imagem de intestinos fixas
- Imaging Wholemount
- Coloque os intestinos inteiros (com fluorescência endógena) em um slide com 100 ml de 1x DPBS. Use uma pinça para organizar cuidadosamente os intestinos.
- Use um lenço de laboratório para remover cuidadosamente os DPBS e imediatamente adicione 100 ml de glicerol a 70% para fazer a mo tecidore transparente e possível aumentar a profundidade da imagem.
NOTA: Se a penetração do intestino é desejado, em vez de montagem no intestino em 70% de glicerol, embeber o intestino em algumas gotas de solução de focagem claro para 10-30 min. Pipeta off a solução foco claro e montar o intestino com o Monte Clear. - Mergulhe cada um dos quatro cantos de uma lamela em massa de modelar e pegar uma pequena quantidade de argila para usar como espaçadores entre lâmina e lamela para manter a lamela de achatamento do intestino.
- Selar a lamela sobre a lâmina com valap derretida aplicado com um cotonete.
- Imagem do intestino de cada um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes.
- Vibratome corte de intestino fixos (para corte transversal das estruturas intestinais)
- Intestinos inserir em 7% agarose em pequenos moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) e permitir que os blocos de agarose paraesfriar e solidificar.
- Remova os blocos de agarose a partir dos moldes de plástico e cola blocos de agarose para a etapa de coleta vibratome com cola instantânea.
- Preencha a etapa de coleta com o frio do gelo 1x DPBS.
- Cortar secções com uma espessura entre 100-150 m. Para seções mais grossas usar soluções de compensação (descritos no ponto 2.1.2) para visualizar mais profundamente na seção transversal.
- Despeje vibratome secções a partir da fase de recolha para um poço de uma placa de 6 cavidades, para armazenamento a 4 ° C.
- Coloração de imunofluorescência, tecidos seccionados vibratome fixos
- Colocar 5-12 secções vibratome por cavidade em uma placa de 24 poços com 1 x DPBS.
- Remover 1x DPBS e adicione 500 ml de solução de permeabilização por poço. Agite delicadamente as amostras por 25 min em temperatura ambiente.
- Depois de permeabilização, lavar as amostras 3 vezes com PBS 1x.
- Bloquear as amostras de, pelo menos, 30 minutos em 500 ul de solução de bloqueio.
- Após o bloqueio, exchange a solução de bloqueio com 500 ul de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio e a manter as amostras a 4 ° CO / N.
NOTA: As diluições de anticorpos primários que funcionam bem em cortes congelados e parafina geralmente funcionam bem em vibratome seções também, no entanto os anticorpos que exige recuperação do antígeno nuclear geralmente não funcionam bem com este protocolo (por exemplo, BrdU). - No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes durante 15 min de cada vez com solução de bloqueio.
- Após a lavagem, aplicam-se 500 ul do anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio para proteger os fluoróforos de luz e balançar as amostras durante 45 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.
- Lave as amostras 3 vezes com PBS 1x por 15 minutos cada e montar as seções vibratome em slides como descrito na Seção 2.4.
- Montagem vibratome seções
- Preparar lâminas para vibratome montagem cortando fatias finas de double-stick fita e colocá-los ao longo dos lados longos dos slides.
- Com cuidado, coloque 5-10 seções vibratome entre a fita dupla-stick nos slides em uma gota de 100 l de PBS 1x.
- Desdobrar todas as seções e espalhá-los em uma única camada em todo o slide.
- Remova qualquer excesso de agarose ou pedaços irregulares que impediria uma lamela de sentar-se plana.
- Com cuidado, use um tecido de laboratório para absorver o excesso de PBS 1x de todo as seções vibratome.
- Adicionar uma gota de meio de montagem aquoso no topo das secções de vibratome e depois lamela.
- Sele as lamelas para as lâminas com derreteu valap aplicado com um cotonete.
- Imagem seções vibratome em ambos um microscópio confocal vertical ou invertida. Consulte a discussão para mais detalhes sobre a seleção de um sistema de imagem.
3 Imagens ao vivo de intestinos inteiros
Intestinos colhidas a partir de fetoss depois de E12.5, com o omento ligado deixado intacto, desenvolver com sucesso vilosidades em cultura usando o sistema acima. Portanto, este sistema ex vivo permite a captura de imagens de secção z vivo do intestino em desenvolvimento, que podem ser reconstituídas para uma vista tridimensional da morfogénese ao longo do tempo.
- Configurando imagens ao vivo
- Use cola instantânea para aderir uma membrana de policarbonato indivíduo a uma tela de malha fina. Isto proporciona uma estrutura de suporte de apoio para segurar o intestino em lugar abaixo da lente de imersão do microscópio confocal vertical. Por favor, consulte a seção de discussão para mais detalhes sobre a seleção de microscópios de imagem ao vivo.
- Coloque a tela de malha no centro do poço de uma placa de cultura.
- Inserir o intestino dissecados sobre a membrana de policarbonato e adicionar uma gota de cola instantânea em cada extremidade. Use apenas cola suficiente para apor o intestino, mas não revesti-la!
- Adicionar cultura de mídia livre de fenol vermelho abaixo do policarbonatomembrana no centro de uma das cavidades da placa de cultura.
- Adicionar água para a borda exterior da placa de cultura para fornecer humidade.
- Uma vez que o intestino fetal sofre ondas peristálticas semelhantes de contracção da cultura, adicionar 100 ml de uma solução a 1: 5 de xilazina em 1x PBS a 3 ml de meio para controlar o movimento do intestino, enquanto imagiologia. Esta dosagem vai controlar os movimentos intestinais por cerca de 8-10 horas, sem comprometer o desenvolvimento das vilosidades.
- Para um corte transversal do intestino delgado, o intestino incorporar vivos em uma solução de 3-4% de agarose e cortou secções espessas (150-500 um) sobre um vibratome. Combinar a rigidez da agarose com a rigidez do intestino que está sendo cortada e empiricamente determinada fase de desenvolvimento. Geralmente, uma solução de agarose a 3% funciona bem para os intestinos menores de E14.5 e uma solução a 4% funciona bem para os intestinos E15-E16.
- Cole as seções vibratome a uma membrana de policarbonato aposta em uma tela de malha (como na Seção 3.1.1) ecultura como descrito na Seção 3.1.2-3.1.6.
- Conduzir a imagens ao vivo usando um de dois fótons microscópio confocal de fluorescência (excitação laser entre 690-1,040 nm) em uma posição vertical com uma mesa ajustável.
- Dois fótons de laser sintonizado 900 nm proporciona uma penetração profunda com a melhor resolução para sinais de GFP. Reduz danos aos tecidos, enquanto Imaging. Além disso, a configuração da potência do laser de emissão mais baixa possível reduzir o dano tecidual. Tipicamente, para obter uma boa excitação de GFP, usar 12% de energia em que o laser de dois fotões.
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Representative Results
Culturas de explantes de intestino fetal inteiros permite a análise da localização, distribuição e duração das moléculas de sinalização que coordenam o desenvolvimento intestinal, como este sistema permite a manipulação da sinalização com reagentes farmacológicos ou proteínas recombinantes. O sistema de cultura Transwell (Figura 1A, reproduzido a partir de Walton et al., 2012) 2 fornece uma interface ar-líquido, o que faz com que seja possível colocar droga ou proteína embebido esferas de agarose para o tecido e, assim, para criar fontes de sinalização locais (Figura 1B ). Intestinos colhidas de embriões em E10 para E18.5 sobreviver na cultura em transwells e passam por ondas peristálticas semelhantes de movimento. Intestinos começaram na cultura de E13.5 sobreviver cerca de 10 dias ou mais ou menos para P3, o estágio de desenvolvimento do mouse quando a formação cripta é observada pela primeira vez. Apesar de intestino em fase inicial sobreviver na cultura, intestinos colhidas antes daE12.5 não surgem vilosidades de forma confiável, provavelmente porque a serosa não cresceu para cobrir completamente o intestino por esse tempo. Aglomerados mesenquimais formam e vilosidades começam a surgir e alongar no intestino começou na cultura em E12.5, E13.5 ou E14.5, embora o desenvolvimento é ligeiramente atrasado em comparação com controles pareados, em estágio não cultivadas (Figura 1, reproduzidas a partir de Walton et al., 2012) 2. Independentemente de a fase do intestino, no início da cultura (E12.5-E14.5), os intestinos aparecem sempre tem um atraso de aproximadamente 24 horas. Intestinos E14 cultivadas em cultura durante dois dias mostram crescimento de vilosidades que são mais semelhantes às do intestino do que E15 vilosidades do intestino E16 crescido no útero (Figura 1C-F) 2.
O padrão regular de aglomerados mesenquimais é revelada pela reconstrução tridimensional de secções ópticas de um conjunto PDGFRα GFP / + intestino em E15.5 (Figura 2 </ Strong>, reproduzido a partir de Walton et al., 2012) 2. Esta imagem é composta por z-stacks de 54 campos de visão que foram costuradas pelo software Leica LAS-AF. Cada ponto no interior do intestino é um cluster mesenquimais visualizadas por GFP etiquetado nuclear expressa a partir do locus PDGFRα 14. A alta resolução da imagem permite ao espectador zoom-in para determinadas áreas para examinar detalhes, e ainda oferece nas relações espaciais de profundidade que não pode ser adquirida a partir de um único campo de visão menor ou ampliação de poder. 1 do filme é uma série percorrendo o z costurado Stack imagens que são de reconstrução 3D na Figura 2. As seções ópticas individuais permitir uma maior visualização de detalhes, tais como células isoladas dentro dos clusters.
Secções ópticas de imunofluorescência wholemount da vasculatura intestinal com anticorpo PECAM (BD Pharmingen 557355; diluído 1: 1000) foram capturados com a excitação de dois fótons e reconhecimentotruídos com software Imaris (Figura 3). Esta visão tridimensional dos vasos sanguíneos intestinais revela uma intrincada rede de vasos que não pode ser totalmente apreciado pelos preparativos seção fina. 2 do filme, uma projeção tridimensional rotativa da imagem reconstruída na Figura 3, permite uma maior apreciação de como o aumento da informação fornecida pela reconstrução tridimensional pode melhorar a compreensão da padronização estrutural.
Vibratome de corte permite a visualização tridimensional do intestino a partir de uma vista transversal. Na Figura 4, a relação dos grupos em desenvolvimento (marcadas com GFP PDGFRα / +) 14, com o epitélio e o mesênquima envolvente (marcado com a membrana do tomate (Rosa26 mT / mG) 15 é observada.
Alternativamente, essa relação pode ser visualizada por immunofluore anticorposcence coloração (Figura 5) dos aglomerados mesenquimais (verde, marcado com anti-PDGFRα (SantaCruz C-20; diluído 1: 200)), com o epitélio (vermelho, marcado com anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181; 1: 1000 diluição).
Este sistema de cultura de órgão inteiro pode também ser estendida para permitir a imagiologia de dois fotões de desenvolvimento de intestino fetal. Nesta configuração, o intestino fetal é colado a uma membrana de policarbonato suportada por uma tela de malha, em uma placa de cultura grande (Figura 6). Quanto maior for o tamanho das cavidades da placa de cultura permite as lentes do microscópio confocal para contactar o intestino dentro do poço.
Figura 1. Desenvolvimento de intestino fetal inteiros em um sistema de cultura Transwell. (A) intestinos fetais colocados em um mem transwellbrana em uma placa de cultura de 6 poços, com meio BGJb. Top dois intestinos são E12.5, fundo dois intestinos são E13.0. (B) albumina de soro bovino embebido esferas de agarose (azul mais claro) colocados em um duodeno no sistema de cultura transwell. A mancha azul mais escuro é a coloração X-gal para Ptc LacZ / + nos clusters mesenquimais Hedgehog linha repórter rato marcando 16. (CF) Cortes transversais de E14.0 recém-colhida (C), E15.0 (D) e E16. 0 (E), tecido duodenal corados com E-caderina (verde) e DAPI (azul). Ao E14.0, o epitélio pseudo unremodeled ainda, enquanto a E15.0 e E16.0, vilosidades nascentes são visíveis. (F) Um segmento intestinal idêntica à observada em (C), mas cultivadas durante dois dias (E14 + 2 dias) demonstra que vilosidades desenvolver em cultura, embora um pouco atrasado. Painéis (CF) são reproduzidos a partir de Walton et al., 2012 2 sup>. Scalebars são 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Reconstrução tridimensional de campos costurados de z-stacks de um wholemount E15.5 PDGFRα EGFP / + intestino. A imagem é uma reconstrução parcial (1 mícron cinco seções do centro de 65 z-seções) das 54 áreas costuradas de vista capturado usando o estágio motorizado do microscópio confocal LeicaSP5X em um invertido DMI 6000 estande com dois fótons laser de excitação em 900 nm. Software Leica LAS-AF costurou os Z-stacks juntos para formar a imagem completa. Barra de escala é de 1 mm.
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Figura 3 reconstrução tridimensional de cortes ópticos mostrando wholemount imunofluorescência anti-PECAM da vasculatura intestinal em um duodeno E14. Seções ópticas foram capturadas em um microscópio confocal LeicaSP5X em um DMI vertical 6000 estão com dois fótons de excitação a 900 nm e três dimensionalmente reconstruída usando o software Imaris 7.6.1. Barra de escala é 200 um.
Figura 4 imagens confocal de vibratome seccionado E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG jejuno mostrando a estreita associação entre as células PDGFRα EGFP / + dos clusters mesenquimais (verde) com o seu epitélio sobrejacente e envolvente mesênquima (vermelho; membrana Tomate de Rosa26 mTmG). < / Forte> Scalebars são 50 um nos painéis superiores e 25 um nos painéis inferiores.
Figura 5. reconstruções tridimensionais de imagens confocal de E15.5 vibratome seccionado intestinos que estavam imunofluorescência de anticorpos manchada. Barra de escala é de 50 m.
Figura 6 Adaptação do sistema de cultura transwell para dois fótons de imagem ao vivo. (A) de malha de tela é colocada em uma placa de cultura. (B) de membrana de policarbonato é colada à tela de malha. (C) Os intestinos são coladas para a membrana de policarbonato e cultivadas com meio DMEM isento de fenol.
Filme 2. filme rotativa mostrando a reconstrução tridimensional das secções ópticas de PECAM vasculatura manchado no duodeno E14 na Figura 2.
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Discussion
A natureza dinâmica e interações complexas de tecido do intestino desenvolvimento requer visualização 3D para ter uma apreciação plena desses eventos morfogenéticos. Com a evolução da tecnologia de imagem, a capacidade de examinar vilosidades morfogênese em detalhe está a desenvolver / melhorar e, com isso, a compreensão da comunicação espacial e interação durante a organogênese é bastante reforçada.
Os métodos alternativos para a cultura de intestinos inteiros foram também testados, mas o sistema continua a ser o mais transwell fiável para tempos mais longos e de cultura para manutenção de aglomerado e das vilosidades padrões normais. Sistemas de cultura tridimensional (Matrigel ou colágeno) funcionam bem para períodos de cultura de curta duração (menos de 24 hr) de intestinos mais jovens (E12.5-E15.5), mas uma vez que os intestinos começam a sofrer movimentos peristálticos semelhantes e secretar enzimas e resíduos no lúmen, os substratos tridimensionais não manter-se bem. Intestinos em cultura líquidas também vai desenvolver, no entanto, a falta de apoio ou de referência para orientação numa cultura de flutuação livre parece alterar padrão normal dos aglomerados e das vilosidades. Portanto, o sistema transwell é preferido para examinar padronização aglomerado e surgimento das vilosidades e excrescência.
Outro método para geração de imagens ao vivo wholemount com um conjunto menos rigorosa se está a usar pinos minutien para afixar o intestino fetal de uma fina camada de 7% de agarose na parte inferior de uma placa de 35 x 10 mm. Embora este método é mais fácil de configurar, note que a sua utilização é limitada aos estágios mais jovens (E12.5-E15.5) ou para os tempos de cultivo mais curtos desde o matrigel não irá realizar-se às secreções intestinais.
Para preparar as placas de cultura, suficiente derramar derretido 7% de agarose para apenas cobrir o fundo de uma placa de 35 x 10 mm. Coloque um tubo capilar de vidro, no centro da agarose, enquanto é ainda maleável. Uma vez que a agarose solidificada, remover o capilar de vidro e coloque-tele intestino fetal ao longo do poço criado pelo capilar. Encher o capilar bem com matrigel a rodear o intestino e colocar a placa de cultura a 37 ° C, até os conjuntos de matrigel. Adicionar sem vermelho de fenol DMEM meio de cultura com cuidado. Colocar a placa de 35 mm x 10 mm no interior de uma placa de 60 x 15 e encher o prato de 60 mm e água para criar uma atmosfera húmida.
A selecção do método de montagem (ou vibratome wholemount) para imagens em tempo real baseia-se na orientação desejada para a área a ser visualizada. Por exemplo, para ver as mudanças na forma das células epiteliais, Z-pilhas através de um intestino wholemounted proporcionará vistas das superfícies apical e basal. Para visualizar interkinetic migração nuclear das células epiteliais dentro da folha epitelial, vibratome seções permitir um fim em vista (transversal) para observar as superfícies apical e basal.
Preparação das amostras é essencial para a obtenção dos melhores resultados de imagiologia. Ao usar vibratome seções dend microscopia confocal padrão, boa resolução pode ser alcançado até profundidades de 75 um, sem um reagente de limpeza. Actualmente, um reagente de limpeza para as amostras vivas não tem sido identificado de modo que a profundidade da imagem é limitado. Para amostras fixadas, o uso de um reagente de limpeza pode melhorar muito a profundidade da imagem. O reagente de limpeza encontrou para oferecer o melhor a morfologia ea resolução foi foco claro 17. Após 30 min de compensação em foco claro e montagem em Mount claro, toda a profundidade de todas as fases do intestino embrionárias podem ser visualizados com excelente resolução. Uma alternativa menos dispendiosa de compensação é de 70% de glicerol, no entanto, a profundidade máxima de penetração nos tecidos embrionários é 150 m, posteriormente, a resolução e intensidade do sinal se perde.
Uma nota importante é que os sinais são mais definidos em amostras que são montados e fotografados no mesmo dia em que a coloração foi terminada. Montagem com meio de montagem sinal preservação aquoso (como solução anti-fade Prolong ouro (Life Technologies P36930) não ajuda com a preservação do sinal, mas apenas brevemente; as imagens mais claras são sempre obtidos imediatamente após a coloração e montagem das amostras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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