Abstract
Meest morfogenetische processen in de foetale darm zijn afgeleid uit dunne lagen van gefixeerde weefsels, die snapshots van veranderingen tijdens ontwikkelingsstadia. Drie-dimensionale informatie van dunne seriële secties kunnen worden uitdaging te interpreteren omdat het moeilijk reconstrueren seriecoupes perfect en handhaven van de juiste oriëntatie van het weefsel via seriële secties. Recente bevindingen van Grosse et al. 2011 benadrukken het belang van driedimensionale informatie in het begrijpen van de morfogenese van het ontwikkelen van villi van de darm 1. Drie-dimensionale reconstructie van enkelvoudig gelabelde darmcellen aangetoond dat de meerderheid van de darmepitheelcellen contact zowel de apicale en basale oppervlakken. Bovendien driedimensionale reconstructie van het actine cytoskelet in het apicale oppervlak van het epitheel dat de darmlumen continu is en dat secundaire lumen zijn de invloed van sectioning. Deze twee punten, naast het aantonen van interkinetic nucleaire migratie in het darmepitheel, gedefinieerd ontwikkelingslanden darmepitheel als een pseudo-epitheel en niet gestratificeerd zoals eerder gedacht 1. De mogelijkheid om het epitheel driedimensionaal waarnemen was rudimentaire te demonstreren dit punt en het herdefiniëren van epitheliale morfogenese in de foetale darm. Met de ontwikkeling van multi-foton imaging technologie en driedimensionale reconstructie software, het vermogen om intact te visualiseren, ontwikkelende organen snel verbeteren. Twee-foton excitatie maakt minder schadelijk penetratie dieper in weefsels met een hoge resolutie. Twee-foton imaging en 3D reconstructie van het gehele foetale darmen in Walton et al., 2012 bijgedragen tot het patroon van villus uitgroei 2 definiëren. Hier beschrijven we een heel orgaan kweeksysteem dat ex vivo ontwikkeling van villi en uitbreidingen van dit kweeksysteem maakt omde darmen driedimensionaal afgebeeld tijdens hun ontwikkeling.
Protocol
OPMERKING: Alle muizen werden humaan behandeld met behulp van protocollen door de Universiteit van Michigan Medical School Unit voor Proefdierkunde Geneeskunde goedgekeurd en volgens de richtlijnen van de Universitaire Commissie voor gebruik en verzorging van dieren.
1 Hele orgelcultuur System
- Voorbereiding van de media en de cultuur platen
- In een weefselkweek kap, verwijder 5 ml BGJb media uit het flesje, en voeg 5 ml van de Pen / Strep. Bereid een werkvoorraad van media in een 50 ml conische buis, door toevoeging van 1 ml van 5 mg / ml ascorbinezuur aan 49 ml van BGJb medium (met Pen / Strep).
- Bereid een 6 putjes plaat door toevoeging van 1 ml onder elk van de transwells.
OPMERKING: Als alle 6 transwells niet worden gebruikt, verplaatsen extra transwells in een verse steriele 6 wells plaat voor later gebruik. Voeg 3 ml werken BGJb medium aan elk van de drie 10 cm steriele petrischalen.
- Voorbereiding voor dissectie
- Soak ontleden gereedschappen in 70% Ethanol en zorg ervoor dat het gereedschap schoon te houden tijdens het werken.
- Het opzetten van de dissectie met een grote ijsemmer en plaats de 6 en cultuur plaat en 10 cm petrischaaltjes met BGJb media op ijs. Werken op ijs zo veel mogelijk terwijl het ontleden en het voorbereiden van de darmen voor cultuur.
- Verdoven volwassen vrouwelijke muizen in een kamer met isofluorane (100 ul) vóór euthanization door cervicale dislocatie voor het oogsten van foetale darmen.
- Na het oogsten van de foetussen van hun moeder, het podium elke foetus zorgvuldig volgens de Theiler enscenering grafiek 13. Niet afhankelijk dagen na coïtus aan de leeftijd van elke foetus als variaties tot 24 uur in ontwikkelingsstadium routinematig waargenomen binnen een nest bepalen.
- Dissectie van foetale darmen
- Euthanaseren foetussen door onthoofding voorafgaand aan het verwijderen van de ingewanden.
- Ontleden elke darm in 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en dan place deze in een 10 cm petrischaal met werkende BGJb media.
- Verwijder de milt van de maag en de pancreas van de maag en duodenum bovenste voorzichtig.
- Voorzichtig scheiden omentum zorg het omentum verbonden zoveel mogelijk scheiden verbindingen alleen voldoende ruimte te houden de darm wordt rechtgetrokken.
OPMERKING: Voor darmen ouder dan E14.5 of degenen die langer dan 24 uur gekweekt, voorzichtig scheiden de darm in 3 gelijke stukken om voor luminale inhoud te stromen door de darm en worden verbannen uit de afgesneden einden. Voor kweken begonnen vóór E13.5, wachten tot na 24 uur kweken voor het scheiden van de 3 segmenten van de darm om de serosa om goed te groeien over de lengte van de darm. - Gebruik een mond pipet om de intestinale stukken over te dragen op de transwells van de cultuur plaat (1.1.2).
- Voorzichtig te herpositioneren de darmen als nodig, zodat ze dwars door de transwell.
OPMERKING: Zodra de darmen begint te volgen luminale inhoud door de buis, zal knikken in de darm een backup en darmbeschadiging veroorzaken.
- Cultuur en behandeling
- Verwijder het papier van onder de transwell, voeg 700 ul van de behandeling de media (het werken met media toegevoegd recombinante eiwitten of farmacologische remmers) onder de transwell.
- Voeg 300 ul van behandelingsmedia druppelsgewijze bovenop de ingewanden en laat het inwerken door de transwell. Herpositioneren van de darmen als dat nodig is.
- Wijzig behandelingsmedia ten minste eenmaal per dag of vaker, afhankelijk van de halfwaardetijd van de behandeling reagens.
- Bereiding van eiwit geweekt agarose parels voor een gelokaliseerde bron behandeling reagens
- Resuspendeer de agarose parels in de opslagcontainer en breng 100 ui agarose korrels in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Vul het resterende volume van de buis met steriele 1x Phosphate-gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng de parels te wassen. Plaats de microcentrifugebuis in een rek voor een paar minuten totdat de kralen naar de bodem en pipet uit de PBS van de bovenkant van de bolletjes. Vul de microfugebuis met steriele 1x PBS en tweemaal meer herhaal het wasproces.
- Bereid het eiwit van belang op twee maal de gewenste concentratie voor behandeling.
- Meng 5 ul van gewassen agarosebolletjes met 5 pi van de 2x eiwit voorraad en schud er voorzichtig de kralen in het eiwit. Plaats de buis op ijs gedurende 1 uur, voorzichtig te mengen om de 10-15 minuten.
- Spoel de kralen kort in steriele 1x PBS voor het plaatsen van de kralen op de darmen.
- Plaatsing van agarosekorrels
- Plaats voorzichtig het agarose korrels bovenop de darmen met een mond pipet met getrokken capillaire naalden. Plaats de kralen met uiterste voorzichtigheid als ruwe behandeling de darm beschadigen en voorkomen villus ontwikkeling in het gewonde gebied.
- Plaats tweemaal zoveel kralen als nodig zijn voor analyse omdat de darmen peristaltische bewegingen en ongeveer de helft van de korrels geplaatst zal rollen van de darmen via kweken tijd ondergaan.
- Fixatie van gekweekte darm
- Verwijder voorzichtig de behandeling media van onder de transwell en laat de darmen aan de lucht drogen voor 3 minuten.
- Voeg 1 ml fixeermiddel volgens de transwell gedurende 2 min, dek de bovenkant van de darm met 2 ml fixeermiddel voor de rest van de fixatie tijd. Bevestig met 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C of gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
2 Beeldvorming van Vaste Darmen
- Wholemount beeldvorming
- Leg de hele darmen (met endogene fluorescentie) op een dia met 100 ul van 1x DPBS. Gebruik een tang om voorzichtig te regelen de darmen.
- Gebruik een lab weefsel om de DPBS voorzichtig verwijderd en direct daarna 100 pi 70% glycerol toevoegen weefsel mo makenre transparante en verhoging van de diepte die van beeldvorming.
Opmerking: Als verdere penetratie van de darm gewenst, in plaats van montage van de darm in 70% glycerol, genieten de darm in een paar druppels Focus Heldere oplossing gedurende 10-30 minuten. Pipet uit de Focus Heldere oplossing en monteer de darm met Mount Clear. - Dompel elk van de vier hoeken van een dekglaasje in boetseerklei en ophalen van een kleine hoeveelheid klei als afstandhouders tussen de glijbaan en dekglaasje het dekglaasje te houden van afvlakking van de darm.
- Dicht de dekglaasje op de glijbaan met gesmolten valap aangebracht met een wattenstaafje.
- Afbeelding van de darmen aan beide een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Verwijzen we naar de bespreking voor verdere details.
- Vibratome snijden van vaste darmen (voor dwarsdoorsnede van intestinale structuren)
- Insluiten darmen in 7% agarose in kleine plastic mallen (10 x 10 x 15 mm) en laat de agarose blokkenafkoelen en stollen.
- Verwijder agarose blokken van de plastic mallen en lijm agarose blokken aan de vibratome collectie podium met secondenlijm.
- Vul de collectie podium met ijskoud 1x DPBS.
- Snijd secties met een dikte van 100-150 um. Voor dikkere secties gebruiken clearing-oplossingen (in paragraaf 2.1.2 beschreven) om dieper in de doorsnede te visualiseren.
- Giet vibratoomcoupes van de gegevensverzameling verschillende in een putje van een 6-well plaat voor opslag bij 4 ° C.
- Immunofluorescentie kleuring van vaste, vibratome coupes weefsels
- Plaats 5-12 vibratoomcoupes per well in een 24-wells plaat met 1x DPBS.
- Verwijder 1x DPBS en voeg 500 ul permeabilisatie oplossing per well. Schud de monsters gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
- Na permeabilisatie, was de monsters 3 keer met 1x PBS.
- Blokkeer de monsters gedurende ten minste 30 minuten in 500 pl Blocking Solution.
- Na blokkering exchange de blockingbuffer 500 ui primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing en houdt de monsters bij 4 ° CO / N.
OPMERKING: De primaire antilichaam verdunningen die goed werken voor bevroren en paraffine secties algemeen goed werken vibratoomcoupes echter ook antilichamen die nucleaire antigen retrieval algemeen niet goed met dit protocol (bijvoorbeeld BrdU). - De volgende dag was de monsters 3 keer gedurende 15 minuten telkens met blokkeeroplossing.
- Na wassen brengt 500 ui van het secundaire antilichaam verdund in blokkerende oplossing. Wikkel de 24-well plaat in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming tegen licht en rock de monsters gedurende 45 minuten tot 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was de monsters 3 keer met 1x PBS gedurende 15 minuten elk en monteer de vibratoomcoupes op dia's, zoals beschreven in paragraaf 2.4.
- Montage vibratoomcoupes
- Bereid je dia's voor vibratome montage door het snijden van dunne plakjes van de dubbele-stick tape en door ze langs de lange zijden van de schuiven.
- Plaats voorzichtig 5-10 vibratoomcoupes tussen de dubbele plakband op de dia's in een daling van 100 ul 1x PBS.
- Vouw alle secties en spreid ze uit in een enkele laag over de glijbaan.
- Verwijder overtollig agarose of ongelijke bits die zou voorkomen dat een dekglaasje van het zitten plat.
- Zorgvuldig gebruik van een lab weefsel om te genieten van meer dan 1x PBS uit de hele vibratoomcoupes.
- Voeg een druppel waterig fixeermiddel bovenop de vibratoomcoupes en dekglaasje.
- Dicht de dekglaasjes op de dia's met gesmolten valap aangebracht met een wattenstaafje.
- Afbeelding de vibratoomcoupes aan beide een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Verwijzen wij u naar de discussie voor meer informatie over de selectie van een imaging systeem.
3 Live-Imaging van Whole Darmen
Darmen geoogst uit fetuses na E12.5, met de aangesloten omentum intact gelaten, met succes te ontwikkelen villi in de cultuur met behulp van het bovenstaande systeem. Daarom is deze ex vivo systeem maakt het vangen van levende z-gedeelte afbeeldingen van de ontwikkeling darmen die kan worden gereconstrueerd voor een driedimensionaal aanzicht morfogenese tijd.
- Het opzetten van live-imaging
- Gebruik secondenlijm aan een individu polycarbonaat membraan houden aan een fijne gaas. Dit verschaft een drager scaffold de darm op zijn plaats onder het dompelen lens van de rechtopstaande confocale microscoop. Verwijzen wij u naar de discussie sectie voor meer informatie over de selectie van de live imaging microscopen.
- Plaats het gaas in het midden putje van een kweekplaat.
- Plaats de ontleed darm op het polycarbonaat membraan en voeg een druppel secondenlijm aan beide uiteinden. Gebruik net genoeg lijm om de darm aan te brengen, maar niet vacht!
- Voeg voedingsbodems vrije fenol rood onder het polycarbonaatmembraan in het midden putje van de kweekplaat.
- Water Aan de buitenrand van de kweekplaat aan vochtigheid te verschaffen.
- Aangezien de foetale darm ondergaat peristaltische-als golven krimp in kweek, voeg 100 ul van een 1: 5 oplossing van xylazine in 1 x PBS tot 3 ml medium om beweging van de darm tijdens beeldvorming controleren. Deze dosering zal darmbewegingen voor ongeveer 8-10 uur onder controle, zonder afbreuk te villus ontwikkeling.
- Voor een transversale uitzicht van de darm, Sluit de live darmen in een 3-4% agarose-oplossing en snijd dikke secties (150-500 micrometer) op een vibratome. Pas de stijfheid van de agarose met de stijfheid van de darm wordt gesneden en empirisch bepaald het ontwikkelingsstadium. Algemeen een 3% agarose oplossing werkt goed voor darmen jonger dan E14.5 en een 4% oplossing werkt goed voor darmen E15-E16.
- Lijm de vibratoomcoupes een polycarbonaat membraan aangebracht op een mesh scherm (zoals in paragraaf 3.1.1) encultuur zoals beschreven in paragraaf 3.1.2-3.1.6.
- Het gedrag van de live-beeldvorming met behulp van een twee-foton confocale fluorescentiemicroscoop (excitatie laser tussen 690-1,040 nm) op een rechtopstaande stand met een instelbare tafel.
- Twee-foton laser afgesteld om 900 nm diepe penetratie met de beste resolutie voor GFP signalen geeft. Het vermindert schade aan weefsel tijdens beeldvorming. Bovendien houdt de kracht van de laser om een minimale emissie vermindert weefselschade. Meestal om een goede excitatie van GFP te verkrijgen, gebruiken 12% vermogen op de twee-foton laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cultuur van hele explantaten van foetale darm maakt de analyse van de locatie, de distributie en de duur van de signalerende moleculen die intestinale ontwikkeling coördineren, omdat dit systeem de manipulatie van de signalering met farmacologische reagentia of recombinante eiwitten. De transwell kweeksysteem (figuur 1A, gereproduceerd van Walton et al., 2012) 2 verschaft een lucht-vloeistof-grensvlak, waardoor het mogelijk geneesmiddel-eiwit of geweekte agarose korrels plaatsen op het weefsel en daardoor lokale signalering bronnen stellen (Figuur 1B ). Darmen geoogst uit embryo's op E10 te E18.5 overleven in de cultuur op transwells ondergaan peristaltische-achtige golven van beweging. Darmen begon in de cultuur van E13.5 overleven ongeveer 10 dagen of ongeveer om P3, het stadium van de ontwikkeling van de muis wanneer cryptvorming eerst wordt waargenomen. Hoewel vroeg stadium darmen overleven in kweek, darmen geoogst vóórE12.5 niet villi komen betrouwbaar, waarschijnlijk omdat de serosa niet is uitgegroeid tot volledig te bedekken de darm tegen die tijd. Mesenchymale clusters vormen en villi beginnen te ontstaan en te verlengen in de darmen begon in cultuur op E12.5, E13.5 of E14.5, maar ontwikkeling is iets vertraagd in vergelijking met onbeschaafde,-stage gematchte controles (Figuur 1, overgenomen uit Walton et al., 2012) 2. Ongeacht het stadium van de darm bij de start van de cultuur (E12.5-E14.5), de darmen worden altijd een vertraging van 24 uur approximate. E14 ingewanden in kweek gedurende twee dagen groei vertonen van villi die meer op die van E15 darmen dan villi van E16 darmen gekweekt in utero (figuur 1C-F) 2.
Het regelmatig patroon van mesenchymale clusters wordt geopenbaard door driedimensionale reconstructie van optische secties van een hele PDGFRα GFP / + darm op E15.5 (figuur 2 </ Strong>, overgenomen uit Walton et al., 2012) 2. Dit beeld bestaat uit z-stacks van 54 velden van mening dat bij elkaar werden genaaid door de Leica LAS AF software. Elk plekje in de darm is een mesenchymale cluster gevisualiseerd door nucleaire tagged GFP tot expressie gebracht van de PDGFRα locus 14. De hoge resolutie van het beeld kan de kijker om in te zoomen op bepaalde gebieden om de details te bestuderen, maar biedt in de diepte ruimtelijke relaties die niet kan worden afgeleid uit enkele gezichtsveld of lager vermogen vergroting. Film 1 is een serie stapt door de gestikte z -Stack beelden die 3D zijn gereconstrueerd in figuur 2. De individuele optische secties zorgen voor verdere visualisatie van details, zoals enkele cellen binnen de clusters.
Optische onderdelen van wholemount immunofluorescentie van intestinale vaatstelsel met PECAM antilichaam (BD Pharmingen 557355; verdund 1: 1.000) werden gevangen met behulp van twee-foton excitatie en reconeerd met Imaris software (Figuur 3). Deze drie-dimensionale weergave van de intestinale bloedvaten blijkt een ingewikkelde netwerk van bloedvaten die niet volledig kan worden gewaardeerd door dunne gedeelte preparaten. Film 2, een roterende driedimensionale projectie van het gereconstrueerde beeld in figuur 3, maakt verdere appreciatie van hoe de verhoogd informatie verstrekt door drie-dimensionale reconstructie kan het begrip van structurele patronen te verbeteren.
Vibratome snijden maakt driedimensionale weergave van de darm van een dwarse vantage. In figuur 4 is de relatie van de ontwikkeling van clusters (aangegeven met PDGFRα GFP / +) 14 met de omringende epitheel en mesenchym (aangegeven met membraan Tomaat (Rosa26 mT / mg) 15 waargenomen.
Als alternatief kan deze relatie worden bekeken door antilichaam immunofluorescence kleuring (Figuur 5) van de mesenchymale clusters (groen gelabeld met anti-PDGFRα (SantaCruz C-20, verdunning 1: 200)) van het epitheel (rood, gelabeld met anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610.181, 1: 1000 verdunning).
Dit hele orgelcultuur systeem kan ook worden uitgebreid om twee-foton beeldvorming ontwikkelen foetale darmen. In deze opstelling wordt de foetale darm vastgelijmd aan een polycarbonaat membraan ondersteund door een mesh in groter kweekplaat (figuur 6). De grotere en grootte van de cultuur plaat zorgt voor de confocale microscoop lenzen contact opnemen met de darm van binnen goed.
Figuur 1. Ontwikkeling van hele foetale darmen in een transwell kweeksysteem. (A) Foetale darmen geplaatst op een transwell membraan in een 6 en cultuur plaat met BGJb media. Top twee darmen zijn E12.5, onderste twee darmen zijn E13.0. (B) Runderserumalbumine geweekt agaroseparels (lichter blauw) geplaatst op een twaalfvingerige darm in de transwell kweeksysteem. De donkere blauwe vlek is X-gal kleuring voor PTC LacZ / + in de Egel reporter muis lijnmarkering mesenchymale clusters 16. (CF) Doorsneden van vers geoogste E14.0 (C), E15.0 (D) en de E16. 0 (E), duodenale weefsel gekleurd met E-cadherine (groen) en DAPI (blauw). Bij E14.0, wordt de unremodeled epitheel nog pseudostratified, terwijl op E15.0 en E16.0, ontluikende villi zijn zichtbaar. (F) Een darmsegment identiek aan die gezien in (C), maar gekweekt voor twee dagen (E14 + 2dagen) toont aan dat villi te ontwikkelen in de cultuur, hoewel enigszins vertraagd. Panelen (CF) worden herdrukt van Walton et al., 2012 2 sup>. Scalebars zijn 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 drie-dimensionale reconstructie van gestikte gebieden z-stacks van een E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + darm. Het beeld is een gedeeltelijke reconstructie (vijf 1 urn secties van het centrum van 65 z-secties) vanaf 54 gestikt velden gezichtspunten vastgelegd met behulp van de gemotoriseerde fase van de LeicaSP5X confocale microscoop op een omgekeerde DMI 6000 stand met twee-foton laser-excitatie bij 900 nm. Leica LAS AF software gestikt de Z-stacks samen om het hele beeld te vormen. Scalebar is 1 mm.
n "src =" / files / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3 Driedimensionale reconstructie van optische secties tonen wholemount anti-PECAM immunofluorescentie van intestinale bloedvaten in een E14 twaalfvingerige darm. Optische secties werden gevangen op een LeicaSP5X confocale microscoop op een rechtopstaande DMI 6000 staan met twee-foton excitatie bij 900 nm en de drie dimensionaal gereconstrueerd met behulp van de Imaris 7.6.1 software. Scalebar is 200 micrometer.
Figuur 4 confocale beelden van vibratome coupes E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG jejunum met de nauwe betrokkenheid van de PDGFRα EGFP / + cellen van mesenchymale clusters (groen) met hun bedekkende epitheel en omringende mesenchym (rood; membraan Tomaat van Rosa26 mTmG). < / Strong> Scalebars zijn 50 micrometer in de bovenste panelen en 25 micrometer in de onderste panelen.
Figuur 5 Driedimensionale reconstructies van confocale beelden van E15.5 vibratome coupes darmen die antilichaam immunofluorescentie gekleurd waren. Scalebar is 50 micrometer.
Figuur 6 Aanpassing van de transwell cultuur systeem voor 2-foton live-imaging. (A) mesh zeef geplaatst in een kweekschaal. (B) Polycarbonaat membraan wordt vastgelijmd aan het mesh zeef. (C) Darmen gelijmd aan het polycarbonaat membraan en gekweekt met fenol DMEM media.
Film 2 roteren film toont de driedimensionale reconstructie van de optische onderdelen van PECAM gekleurde bloedvaten in de E14 duodenum in figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het dynamische karakter en complexe weefsel interacties van de ontwikkelende darm vereist 3D-visualisatie van een volledige waardering van deze morfogenetische gebeurtenissen hebben. Met evoluerende imaging technologie, de mogelijkheid om villus morfogenese in detail is het ontwikkelen / verbeteren en daarmee is het begrip van de ruimtelijke communicatie en interactie tijdens de organogenese sterk verbeterd onderzoeken.
Alternatieve methoden voor het kweken gehele darmen zijn ook getest, maar de transwell systeem blijft de meest betrouwbare voor langere tijd Cultuur en handhaven van de normale cluster en villus patronen. Driedimensionale kweeksystemen (matrigel of collageen) goed te werken voor een korte periode cultuur (minder dan 24 uur) van de jongere darmen (E12.5-E15.5), maar zodra de darmen beginnen ondergaat peristaltische-achtige bewegingen en afscheidende enzymen en afval in het lumen, kan de driedimensionale substraten niet houden goed. Darmen in vloeibare cultuurs zal ontwikkelen, maar het gebrek aan ondersteuning of verwijzing oriënteren in een vrij zwevende kweek lijkt normaal patroon van de clusters en villi veranderen. Daarom wordt de transwell systeem de voorkeur aan cluster patronen en villus opkomst en uitgroei te onderzoeken.
Een andere werkwijze voor wholemount levende beeldvorming met een minder strenge set up is minutien kunnen gebruiken om de foetale darm aan op een dunne laag van 7% agarose op de bodem van een 35 x 10 mm plaat. Hoewel deze methode is makkelijker in te stellen, er rekening mee dat het gebruik ervan is beperkt tot de jongere stadia (E12.5-E15.5) of voor kortere kweken keer sinds de matrigel niet zal houden aan intestinale afscheidingen.
De kweekplaten bereiden, giet genoeg gesmolten 7% agarose alleen de bodem van een 35 x 10 mm plaat bedekken. Plaats een glazen capillaire buisje in het midden van de agar terwijl het nog kneedbaar. Zodra de agar gestold is, verwijder het glazen capillair en leg thij doodgeboorte darm langs de put door het capillair. Vul het capillair goed met Matrigel de darm omringen en plaats de kweekschaal bij 37 ° C totdat de Matrigel sets. Voeg fenol rood-vrij DMEM voedingsbodems zorgvuldig. Plaats de 35 x 10 mm plaat in een 60 x 15 mm plaat en vul de 60 mm plaat met water om een vochtige kamer creëren.
Selectie van de montagemethode (wholemount of vibratome) voor levende beeldvorming is gebaseerd op de gewenste oriëntatie van het te gevisualiseerd. Bijvoorbeeld, om de veranderingen in epitheelcellen vorm, z-stacks door een wholemounted darm bekijken zal standpunten van de apicale en basale oppervlakken. Om interkinetic zie nucleaire migratie van epitheelcellen in de epitheliale vel vibratoomcoupes waardoor een einde op (dwars) teneinde de apicale en basale oppervlakken observeren.
Bereiding van de monsters kritisch waarbij de beste beeldvormende resultaten. Bij het gebruik van vibratoomcoupes eennd standaard confocale microscopie, goede resolutie kan worden bereikt tot op een diepte van 75 micrometer zonder clearing reagens. Op dit moment is er een open plek reagens voor live-samples niet geïdentificeerd, zodat de diepte van de beeldvorming is beperkt. Voor vaste monsters, kan het gebruik van een clearing reagens sterk verbeteren van de diepte van de beeldvorming. De clearing reagens gevonden om de beste morfologie en resolutie is Focus Helder 17. Na 30 min van de clearing in Focus duidelijk en montage in Mount duidelijk, kan de gehele diepte van alle stadia van de embryonale darm worden afgebeeld met een uitstekende resolutie. Een goedkoper alternatief is clearing 70% glycerol, maar de maximale diepte van de penetratie in de embryonale weefsels is 150 m, daarna de resolutie en de intensiteit van het signaal verloren gaat.
Een belangrijke opmerking is dat de meeste signalen gedefinieerd in monsters die zijn gemonteerd en afgebeeld op dezelfde dag de kleuring werd voltooid. Montage met signaal behoud waterig montage medium (zoals verlengen goud anti-fade oplossing (Life Technologies P36930) helpt bij het behoud van het signaal, maar slechts kort; de duidelijkste beelden altijd direct na kleuren en monteren monsters verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
