Abstract
La mayoría de los procesos morfogenéticos en el intestino fetal se han deducido a partir de secciones finas de tejidos fijados, proporcionando instantáneas de los cambios más etapas de desarrollo. Información tridimensional a partir de secciones delgadas de serie puede ser difícil de interpretar debido a la dificultad de la reconstrucción de las secciones de serie perfectamente y mantener la orientación adecuada de los tejidos en las secciones de serie. Las investigaciones recientes de Grosse et al., 2011 ponen de manifiesto la importancia de la información dimensional tres en la comprensión de la morfogénesis de las vellosidades del intestino en desarrollo 1. Reconstrucción tridimensional de las células intestinales individualmente etiquetados demostró que la mayoría de las células epiteliales intestinales en contacto con ambas superficies apicales y basales. Además, la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto de actina en la superficie apical del epitelio demostró que el lumen intestinal es continua y que los lúmenes secundarios son un artefacto de sectioning. Esos dos puntos, junto con la demostración de la migración nuclear interkinetic en el epitelio intestinal, definen el epitelio intestinal como el desarrollo de un epitelio pseudoestratificado y no estratificados como se pensaba anteriormente 1. La capacidad de observar el epitelio tridimensionalmente era seminal a demostrar este punto y la redefinición de la morfogénesis epitelial en el intestino fetal. Con la evolución de la tecnología de imágenes multi-fotón y software de reconstrucción en tres dimensiones, la capacidad de visualizar intacta, el desarrollo de órganos está mejorando rápidamente. Excitación de dos fotones permite la penetración más profunda menos perjudiciales en los tejidos con alta resolución. Dos fotones de imágenes y reconstrucción 3D de todo el intestino del feto de ratón en Walton et al., 2012 ayudaron a definir el patrón de vellosidades consecuencia 2. Aquí se describe un sistema de cultivo de órgano entero que permite ex vivo el desarrollo de las vellosidades y las extensiones de ese sistema de cultivo para permitirlos intestinos sean tridimensionalmente fotografiado durante su desarrollo.
Protocol
NOTA: Todos los ratones fueron manejados con humanidad utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Michigan Medical School Unidad de Laboratorio de Medicina Animal y de acuerdo con las directrices del Comité de la Universidad sobre el uso y cuidado de los animales.
1. System Organ Culture Whole
- Preparación de medios de comunicación y placas de cultivo
- En una campana de cultivo de tejidos, eliminar 5 ml de medio BGJb de la botella stock y añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina. Prepare una solución de trabajo de los medios de comunicación en un tubo cónico de 50 ml, mediante la adición de 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de medio BGJb (con Pen / Strep).
- Preparar una placa de cultivo de 6 pocillos mediante la adición de 1 ml por debajo de cada uno de los cultivos polarizados.
NOTA: Si no se utilizan los 6 transwells, mover transwells adicionales en una placa de 6 pocillos estéril fresco para su uso posterior. Añadir 3 ml de los medios de trabajo BGJb a cada una de tres placas de Petri de 10 cm estériles.
- Preparación para la disección
- Remoje las herramientas de disección en el 70% ethanol y asegúrese de mantener las herramientas limpias durante el trabajo.
- Configurar la zona de disección con un gran cubo de hielo y colocar la placa de cultivo de 6 pocillos y 10 cm placas de Petri con medios BGJb sobre hielo. Trabajar en el hielo tanto como sea posible mientras que la disección y preparación de los intestinos para la cultura.
- Anestesiar a los ratones hembra adulta en una cámara con isofluorano (100 l) antes de la eutanasia por dislocación cervical para la recolección de los intestinos fetales.
- Después de cosechar los fetos de su madre, etapa cada feto cuidadosamente según la Theiler puesta en escena gráfica 13. No confíe en los días post-coito para determinar la edad de cada feto como variaciones de hasta 24 horas en la etapa de desarrollo se observan habitualmente en una sola camada.
- La disección de los intestinos fetales
- La eutanasia a los fetos por decapitación antes de la extracción de los intestinos.
- Diseccionar cada intestino en 1x de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) y luego place en una placa de Petri de 10 cm con el trabajo de medios BGJb.
- Retire cuidadosamente el bazo desde el estómago y el páncreas desde el estómago y el duodeno superior.
- Separar suavemente el epiplón teniendo cuidado de dejar el epiplón adjunta tanto como sea posible y la separación de las conexiones sólo lo suficiente para permitir que el intestino para ser enderezada.
NOTA: Para intestinos mayores de E14.5 o los que están siendo cultivados más de 24 horas, separar suavemente el intestino en 3 segmentos iguales para permitir el contenido luminal fluyan a través del intestino y ser expulsados de los extremos cortados. Sin embargo, para que las culturas se inició antes de E13.5, espere hasta después de 24 horas de cultivo antes de la separación de los 3 segmentos del intestino para permitir la serosa crezca adecuadamente en toda la longitud del intestino. - Usar una pipeta de boca para transferir las piezas intestinales en los cultivos polarizados de la placa de cultivo (1.1.2).
- Reposicionar suavemente los intestinos a medida que sea necesario para que estén en línea recta la Transwell.
NOTA: Una vez que los intestinos comienzan a moverse contenido luminal a través del tubo, cualquier torcedura en el intestino provocarán una copia de seguridad y daños en el intestino.
- Cultura y tratamiento
- Retire el papel de debajo de la transwell, añadir 700 l de medio de tratamiento (los medios de comunicación que trabajan con proteínas recombinantes añadidos o inhibidores farmacológicos) bajo la transwell.
- Añadir 300 l de medio de tratamiento gota a gota en la parte superior de los intestinos y deje que penetre a través de la transwell. Vuelva a colocar el intestino en caso necesario.
- Cambie medio de tratamiento por lo menos una vez al día o más a menudo, dependiendo de la vida media del reactivo de tratamiento.
- Preparación de proteínas empapado perlas de agarosa para una fuente localizada de reactivo de tratamiento
- Resuspender las perlas de agarosa en su recipiente de almacenamiento y la transferencia de 100 l de perlas de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Llenar el volumen restante del tubo con 1x estéril Phosphate-Buffered Saline (PBS) y mezclar las perlas para lavarlos. Colocar el tubo de microcentrífuga en un bastidor por unos pocos minutos para permitir que las perlas se depositan en el fondo y luego pipetee de la PBS en la parte superior de la de las perlas. Vuelva a llenar el tubo de microcentrífuga con 1x PBS estéril y repetir el proceso de lavado dos veces más.
- Preparar la proteína de interés a dos veces la concentración deseada para el tratamiento.
- Mezclar 5 l de perlas de agarosa lavadas con 5 l de la proteína de stock 2x y agite suavemente las perlas en la proteína. Se coloca el tubo en hielo durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10-15 min.
- Enjuague las perlas brevemente en PBS 1x estéril antes de colocar las perlas en los intestinos.
- La colocación de perlas de agarosa
- Con suavidad, coloque las bolas de agarosa en la parte superior de los intestinos usando una pipeta de boca con agujas capilares tirados. Coloca las bolitas con extremo cuidado ya que el manejo brusco puede dañar el intestino y prevenir el desarrollo de vellosidades en el área lesionada.
- Coloque el doble de cuentas que sean necesarios para el análisis, ya que los intestinos se someterán a los movimientos peristálticos y aproximadamente la mitad de los granos colocados rodará fuera de los intestinos durante el tiempo de cultivo.
- La fijación de los intestinos cultivadas
- Retire con cuidado los medios de tratamiento de debajo de la transwell y permitir que los intestinos se sequen al aire durante 3 min.
- Añadir 1 ml de fijador bajo el transwell durante 2 min, luego cubrir la parte superior del intestino con 2 ml de fijador para el resto del tiempo de fijación. Fijar con paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C o durante 2 horas a temperatura ambiente.
2. Imaging de intestinos fijos
- Imágenes Wholemount
- Coloque el conjunto de los intestinos (con fluorescencia endógena) en un portaobjetos con 100 l de 1x DPBS. El uso de fórceps para arreglar suavemente los intestinos.
- Utilice un pañuelo de papel de laboratorio para retirar cuidadosamente los DPBS y añadir inmediatamente 100 l de 70% de glicerol para hacer el mo tejidovolver transparente y aumentar la posible profundidad de formación de imágenes.
NOTA: Si se desea una mayor penetración del intestino, en lugar de montar el intestino en un 70% de glicerol, empape el intestino en unas gotas de Focus Claro solución para 10-30 min. Pipeta de fuera de la solución de enfoque claro y montar el intestino con el Monte Claro. - Sumerja cada una de las cuatro esquinas de un cubreobjetos en plastilina y recoger una pequeña cantidad de arcilla para usar como separadores entre el portaobjetos y cubreobjetos para mantener el cubreobjetos de aplanamiento del intestino.
- Sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con valap derretida aplicada con un bastoncillo de algodón.
- Imagen de los intestinos a ambos un microscopio confocal en posición vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles.
- Seccionamiento Vibratome de intestinos fijos (para vista en sección transversal de las estructuras intestinales)
- Intestinos Insertar en el 7% de agarosa en pequeños moldes de plástico (10 x 10 x 15 mm) y permitir que los bloques de agarosa aenfriar y solidificar.
- Retire los bloques de agarosa de los moldes de plástico y pegamento bloques de agarosa a la etapa de recolección vibratome con pegamento instantáneo.
- Llenar la etapa de recolección de frío hielo 1x DPBS.
- Cortar secciones con un espesor de entre 100-150 micras. Por secciones más gruesas utilizan las soluciones de compensación (que se describen en la sección 2.1.2) para visualizar más en la sección transversal.
- Vierta vibratome secciones de la etapa de recolección en un pocillo de una placa de 6 pocillos para el almacenamiento a 4 ° C.
- La tinción de inmunofluorescencia de tejidos, vibratome seccionadas fijos
- Coloque 5-12 secciones vibratome por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1x DPBS.
- Retire 1x DPBS y añadir 500 l de solución de permeabilización por pocillo. Agite suavemente las muestras durante 25 minutos a temperatura ambiente.
- Después de permeabilización, lavar las muestras 3 veces con 1 × PBS.
- Bloquee las muestras durante al menos 30 min en 500 l de disolución de bloqueo.
- Después del bloqueo, eXchange la solución de bloqueo con 500 l de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo y mantener las muestras a 4 ° CO / N.
NOTA: Las diluciones de anticuerpos primarios que funcionan bien en las secciones congeladas y parafina generalmente funcionan bien en vibratome secciones también, sin embargo, los anticuerpos que requiere la recuperación de antígeno nuclear generalmente no funcionan bien con este protocolo (por ejemplo, BrdU). - El día siguiente, se lavan las muestras 3 veces durante 15 min cada vez con solución de bloqueo.
- Después del lavado, se aplican 500 l del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo. Envolver la placa de 24 pocillos en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz y el rock las muestras durante 45 min a 2 horas a RT.
- Lávese las muestras 3 veces con 1 × PBS durante 15 minutos cada uno y montar las secciones vibratome en las diapositivas como se describe en la Sección 2.4.
- Montaje vibratome secciones
- Preparar en otro portaobjetos para vibratome montaje cortando lonchas finas de doble stick y la colocación de la cinta a lo largo de los lados largos de las diapositivas.
- Coloque cuidadosamente 5-10 secciones vibratome entre la cinta de doble cara en las diapositivas en una gota de 100 l de PBS 1x.
- Desplegar todas las secciones y se extendió a cabo en una sola capa en toda la diapositiva.
- Elimine cualquier exceso de agarosa o trozos irregulares que impida un cubreobjetos de sentarse plana.
- Con cuidado, usar un pañuelo desechable de laboratorio para absorber el exceso de 1x PBS desde alrededor de las secciones vibratome.
- Añadir una gota de medio de montaje acuoso en la parte superior de las secciones de vibratome y luego cubreobjetos.
- Sellar el cubreobjetos sobre los portaobjetos con derretida valap aplica con un algodón.
- Imagen secciones vibratome a ambos un microscopio confocal vertical o invertida. Por favor refiérase a la discusión para más detalles sobre la selección de un sistema de imágenes.
3. imágenes en vivo de los intestinos enteros
Intestinos cosechado de fetuses después de E12.5, con el epiplón conectado deja intacto, desarrollar con éxito las vellosidades en la cultura con el sistema anterior. Por lo tanto, este sistema ex vivo permite la captura de imágenes de sección z vivo de los intestinos en desarrollo que pueden ser reconstruidas para una vista tridimensional de la morfogénesis en el tiempo.
- La creación de imágenes en directo
- Utilice pegamento instantáneo para adherir una membrana de policarbonato individuo a una pantalla de malla fina. Esto proporciona un andamio de apoyo para mantener el intestino en su lugar debajo de la lente de inmersión de microscopio confocal vertical. Por favor refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la selección de los microscopios de imágenes en directo.
- Coloque la pantalla de malla en el centro de los pocillos de una placa de cultivo.
- Coloque el intestino diseccionado sobre la membrana de policarbonato y añadir una gota de pegamento instantáneo en cada extremo. Utilice sólo el pegamento suficiente para colocar el intestino, pero no abrigo!
- Añadir cultura libre medios de rojo fenol por debajo del policarbonatomembrana en el centro pocillo de la placa de cultivo.
- Añadir agua hasta el borde exterior de la placa de cultivo para proporcionar humedad.
- Desde el intestino fetal se somete a ondas peristálticas-como de contracción en cultivo, añadir 100 ml de una solución 1: 5 de xilazina en 1x PBS a 3 ml de medio para controlar el movimiento del intestino mientras que las imágenes. Esta dosis será controlar los movimientos intestinales por alrededor de 8-10 horas sin comprometer el desarrollo de las vellosidades.
- Para una vista transversal del intestino, incrustar los intestinos vivos en una solución de agarosa al 3-4% y cortar secciones gruesas (150-500 M) en un vibratome. Coincidir con la rigidez de la agarosa con la rigidez del intestino de ser cortado y determinado empíricamente la etapa de desarrollo. Por lo general, una solución de agarosa al 3% funciona bien para los intestinos menores de E14.5 y una solución al 4% funciona bien para los intestinos E15-E16.
- Pega las secciones vibratome a una membrana de policarbonato colocada en un tamiz de malla (como en la Sección 3.1.1) yla cultura como se describe en la Sección 3.1.2-3.1.6.
- Llevar a cabo la formación de imágenes en vivo usando un microscopio confocal de fluorescencia de dos fotones (láser de excitación entre 690-1,040 nm) en un soporte vertical con una tabla ajustable.
- Láser de dos fotones sintonizado a 900 nm proporciona una penetración profunda con la mejor resolución para las señales de las buenas prácticas agrarias. Reduce el daño a los tejidos, mientras que la formación de imágenes. Además, el establecimiento de la potencia del láser para la emisión más bajo posible reduce el daño del tejido. Típicamente para obtener una buena excitación de GFP, utilizar la energía 12% en el láser de dos fotones.
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Representative Results
Cultura de explantes enteros de intestinos fetales permite el análisis de la ubicación, la distribución, y la duración de las moléculas de señalización que coordinan el desarrollo intestinal, ya que este sistema permite la manipulación de la señalización con reactivos farmacológicos o proteínas recombinantes. El sistema de cultivo transwell (Figura 1A, reproducida de Walton et al., 2012) 2 proporciona una interfaz aire-líquido, lo que hace posible colocar de drogas o de proteínas empapado perlas de agarosa sobre el tejido y con ello establecer fuentes locales de señalización (Figura 1B ). Intestinos cosechadas a partir de embriones en E10 E18.5 a sobrevivir en la cultura en transwells y se someten a las ondas peristálticas-como de movimiento. Los intestinos se iniciaron en la cultura de E13.5 sobrevivir aproximadamente 10 días o más o menos a P3, la etapa de desarrollo del ratón cuando se observó por primera vez la formación de criptas. Aunque los intestinos en fase inicial sobreviven en la cultura, los intestinos cosechan antes de laE12.5 no emergen vellosidades fiable, probablemente debido a la serosa no ha crecido hasta cubrir completamente el intestino en ese momento. Racimos mesenquimales forman y vellosidades comienzan a emerger y alargar en los intestinos comenzaron en la cultura en E12.5, E13.5 E14.5 o, aunque el desarrollo se retrasa ligeramente en comparación con los controles sin cultura, etapa emparejados (Figura 1, reproducidas de Walton et al., 2012) 2. Independientemente de la etapa del intestino en el inicio de la cultura (E12.5-E14.5), los intestinos aparecen siempre tienen un retardo aproximado de 24 hr. Intestinos E14 crecidas en cultivo durante dos días muestran un crecimiento de las vellosidades que son más similares a los de los intestinos E15 que vellosidades del intestino E16 cultivadas in utero (Figura 1C-F) 2.
El patrón regular de grupos mesenquimales se revela por la reconstrucción tridimensional de secciones ópticas de un todo PDGFRa GFP / + delgado en E15.5 (Figura 2 </ Strong>, reproducido de Walton et al., 2012) 2. Esta imagen se compone de z-pilas de 54 campos de visión que se cosen juntos por el software Leica LAS-AF. Cada punto dentro del intestino es un grupo mesenquimales visualizado por GFP etiquetado nuclear expresada a partir del locus PDGFRa 14. La alta resolución de la imagen permite al espectador acercarse con el zoom a ciertas áreas a examinar los detalles, sin embargo, proporciona en las relaciones espaciales de profundidad que no se puede extraer de los campos individuales de la vista o de ampliación de potencia inferior. Movie 1 es una serie paso a paso a través de la z cosido -stack imágenes que son reconstruidos en 3D en la Figura 2. Las secciones ópticas individuales permiten adicionalmente a la visualización de detalles tales como células individuales dentro de los grupos.
Secciones ópticas de inmunofluorescencia wholemount de vasculatura intestinal con anticuerpos PECAM (BD Pharmingen 557.355; diluido 1: 1000) fueron capturados utilizando excitación de dos fotones y recontruido con el software Imaris (Figura 3). Esta vista tridimensional de los vasos sanguíneos intestinales revela una intrincada red de la vasculatura que no puede ser completamente apreciado por las preparaciones de sección constante. Película 2, una proyección tridimensional de rotación de la imagen reconstruida en la figura 3, permite una mayor apreciación de cómo el aumento de la información por parte de la reconstrucción tridimensional proporcionado puede mejorar la comprensión de los patrones estructurales.
Seccionamiento Vibratome permite la visualización tridimensional del intestino a partir de una vista transversal. En la Figura 4, la relación de los grupos de desarrollo (marcado con PDGFRa GFP / +) 14 con el epitelio y el mesénquima circundante (marcado con la membrana de tomate (Rosa26 mT / mg) se observa 15.
Por otra parte, esta relación puede ser visto por immunofluore anticuerposcence tinción (Figura 5) de los grupos mesenquimales (verde, marcado con anti-PDGFR (SantaCruz C-20; diluida 1: 200)) con el epitelio (rojo, marcado con anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610.181; 1: 1000 dilución).
Este sistema de cultivo de órganos conjunto también se puede ampliar para permitir la formación de imágenes de dos fotones de desarrollar intestinos fetales. En esta configuración, el intestino fetal está pegado a una membrana de policarbonato con el apoyo de un tamiz de malla en una placa de cultivo más grande (Figura 6). El tamaño bien más grande de la placa de cultivo permite que las lentes de microscopio confocal para contactar el intestino en el interior así.
Figura 1. Desarrollo de los intestinos fetales enteros en un sistema de cultivo transwell. (A) los intestinos fetales colocados sobre una mem transwellbrana en una placa de cultivo de 6 pocillos con medio BGJb. Top dos intestinos son E12.5, abajo, dos intestinos son E13.0. (B) albúmina de suero bovino empapado perlas de agarosa (azul claro) colocados en un duodeno en el sistema de cultivo transwell. La mancha azul más oscuro es la tinción con X-gal para Ptc LacZ / + en los grupos mesenquimales marcado Erizo línea reportero ratón 16. (CF) Secciones transversales de E14.0 recién cosechado (C), E15.0 (D) y E16. 0 (E), el tejido duodenal manchado con E-cadherina (verde) y DAPI (azul). En E14.0, el epitelio pseudoestratificado unremodeled todavía, mientras que en E15.0 y E16.0, vellosidades nacientes son visibles. (F) Un segmento intestinal idéntica a la observada en (C), pero se cultivaron durante dos días (E14 + 2 días) demuestra que las vellosidades se desarrollan en la cultura, aunque ligeramente retrasada. Paneles (CF) se reproducen desde Walton et al., 2012 2 sup>. Scalebars son 50 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Reconstrucción tridimensional de campos cosidas de z-pilas de un wholemount E15.5 PDGFR EGFP / + delgado. La imagen es una reconstrucción parcial (cinco 1 micras secciones del centro de 65 z secciones) de 54 campos cosidas de vista capturado utilizando la platina motorizada del microscopio confocal LeicaSP5X en una posición invertida DMI 6000 con excitación de dos fotones láser a 900 nm. Software Leica LAS-AF con costura Z-pilas entre sí para formar la imagen completa. Barra de escala es de 1 mm.
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Figura 3. reconstrucción tridimensional de las secciones ópticas que muestran wholemount inmunofluorescencia anti-PECAM de vasculatura intestinal en un duodeno E14. Secciones ópticas fueron capturados en un microscopio confocal LeicaSP5X en una posición vertical DMI 6000 de pie con dos fotones de excitación a 900 nm y de tres dimensionalmente reconstruido utilizando el software Imaris 7.6.1. Barra de escala es de 200 micras.
Figura 4. Confocal imágenes de vibratome seccionado E15.5 PDGFR EGFP / +; Rosa26 mTmG yeyuno que muestra la estrecha asociación de los / + células PDGFR EGFP de los racimos mesenquimales (verde) con su epitelio que recubre y rodea mesénquima (rojo; membrana Tomate de Rosa26 mTmG). < / Strong> Scalebars son 50 micras en los paneles superiores y 25 micras en los paneles inferiores.
Figura 5. reconstrucciones tridimensionales de imágenes confocal de vibratome seccionado intestinos E15.5 que eran inmunofluorescencia anticuerpo teñido. Barra de escala es de 50 micras.
Figura 6. Adaptación del sistema de cultivo transwell para imágenes en vivo de 2 fotones. (A) malla de la pantalla se coloca en una placa de cultivo. (B) de membrana de policarbonato se pega a la pantalla de malla. (C) los intestinos se pegan a la membrana de policarbonato y se cultivaron con medio DMEM exento de fenol.
Película 2. película giratorio que muestra la reconstrucción tridimensional de las secciones ópticas de PECAM vasculatura manchado en el duodeno E14 en la Figura 2.
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Discussion
La naturaleza dinámica e interacciones de tejidos complejos del intestino en desarrollo requiere la visualización en 3D para tener una apreciación más completa de estos eventos morfogenéticos. Con la evolución de la tecnología de imagen, la capacidad de examinar las vellosidades morfogénesis en detalle está desarrollando / mejora y con ello, la comprensión de la comunicación espacial y la interacción durante la organogénesis es mucho mayor.
Los métodos alternativos para el cultivo de los intestinos enteros también han sido probados, pero el sistema transwell sigue siendo el más fiable para tiempos de cultivo más largos y para el mantenimiento de clúster y vellosidades patrón normal. Sistemas de cultivo tridimensional (Matrigel o colágeno) funcionan bien para los períodos de cultivo corto (menos de 24 h) de los intestinos más jóvenes (E12.5-E15.5), pero una vez que los intestinos comiencen sufrir movimientos peristálticos y-al igual que segregan enzimas y residuos hacia la luz, los sustratos tridimensionales no se sostienen bien. Los intestinos en cultivo líquidos también desarrollará, sin embargo, la falta de apoyo o de referencia para la orientación en una cultura de libre flotación parece alterar el desarrollo normal de los clusters y las vellosidades. Por lo tanto, se prefiere el sistema transwell para examinar los patrones de clúster y la aparición y el crecimiento de las vellosidades.
Otro método para la formación de imágenes en vivo wholemount con un conjunto menos riguroso es utilizar pasadores minutien para fijar el intestino fetal a una capa delgada de 7% de agarosa en la parte inferior de una placa de 35 x 10 mm. Si bien este método es más fácil de configurar, tenga en cuenta que su uso se limita a las etapas más jóvenes (E12.5-E15.5) o para los tiempos de cultivo más cortas desde el matrigel no se puede sostener a las secreciones intestinales.
Para preparar las placas de cultivo, se vierte suficiente derretido 7% de agarosa para cubrir sólo la parte inferior de una placa de 35 x 10 mm. Colocar un tubo capilar de vidrio en el centro de la agarosa mientras todavía es maleable. Una vez que la agarosa se ha solidificado, retire el capilar de vidrio y colocar tél fetal a lo largo del intestino así creado por el capilar. Llenar el capilar bien con Matrigel para rodear el intestino y colocar la placa de cultivo a 37 ° C hasta que los conjuntos de Matrigel. Añadir rojo fenol libre de DMEM medios de cultivo cuidadosamente. Coloque la placa de 35 mm x 10 mm dentro de una placa de 60 x 15 y llenar la placa de 60 mm con agua para crear una cámara húmeda.
La selección del método de montaje (wholemount o vibratome) para formación de imágenes en vivo se basa en la orientación deseada de la zona a ser visualizada. Por ejemplo, para ver los cambios en la forma de la célula epitelial, z-pilas a través de un delgado wholemounted proporcionará vistas de las superficies apical y basal. Para ver interkinetic la migración nuclear de las células epiteliales dentro de la lámina epitelial, vibratome secciones permiten su fin el (transversal) a fin de observar las superficies apicales y basales.
Preparación de las muestras es crítica para obteniéndose los mejores resultados de imagen. Al utilizar vibratome secciones and microscopía confocal estándar, buena resolución se puede lograr hasta profundidades de 75 m sin un reactivo de compensación. Actualmente, un reactivo de compensación para muestras vivas no se ha identificado hasta la profundidad de formación de imágenes es limitada. Para las muestras fijas, el uso de un reactivo de intercambio de información puede mejorar en gran medida la profundidad de formación de imágenes. El reactivo de compensación encontrado para proporcionar la mejor morfología y la resolución fue Focus Despejado 17. Después de 30 minutos de claro en claro enfoque y el montaje en el monte claro, toda la profundidad de todas las etapas de los intestinos embrionarias se pueden obtener imágenes con una excelente resolución. Una alternativa menos costosa de compensación es de 70% de glicerol, sin embargo la profundidad máxima de penetración en tejidos embrionarios es 150 m, a partir de entonces la resolución y la intensidad de la señal se pierde.
Una nota importante es que las señales se definen más en muestras que se montan y captación de imagen sobre el mismo día que se completó la tinción. Montaje con medio de montaje señal preservar acuosa (tales como Prolong oro solución anti-fade (Life Technologies P36930) no ayuda con la preservación de la señal, pero sólo brevemente; las imágenes más claras siempre se obtienen inmediatamente después de la tinción y el montaje de las muestras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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