Summary
Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.
Abstract
BDNF spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Facetten neuronale Überleben, Differenzierung und Funktion. Strukturelle und funktionelle Defizite der Axone werden zunehmend als eine frühe Funktion von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit (HD) angesehen. Noch unklar ist der Mechanismus (en), durch die axonale Verletzung induziert wird. Wir berichteten über die Entwicklung einer neuen Technik zur Herstellung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Quantenpunkt-markierten BDNF (QD-BDNF) wurde durch Konjugation Quantenpunkt 655 bis mBtBDNF produziert. Eine mikrofluidische Vorrichtung wurde verwendet, um die Axone von Neuronen Zellkörper zu isolieren. Zugabe von QD-BDNF auf die axonalen Fach erlaubt die Live-Darstellung von BDNF Transport in Axonen. Wir zeigten, dass QD-BDNF retrograd bewegt wesentlichen ausschließlich mit wenigen Pausen, bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s herzustellen. Dieses System kann verwendet werden, um mich zu untersuchennismen der axonalen Funktion gestört in AD oder HD, wie auch andere degenerative Erkrankungen.
Introduction
Neuronen sind stark polarisiert Zellen, deren lange und oft sehr ausgearbeiteten Prozesse sind von grundlegender Bedeutung für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion neuronaler Schaltkreise. Das Axon spielt eine wichtige Rolle bei der Durchführung Ladungen zu und von Synapsen. Proteine und Organellen in der Zelle synthetisiert Soma müssen durch Axone transportiert werden, um die präsynaptischen Terminal zu erreichen, um neuronale Funktion unterstützen. Entsprechend empfangenen Signale an distalen Axone müssen transduziert werden und zu der Soma. Diese Verfahren sind für das neuronale Überleben, Differenzierung und Wartung. Dadurch axonalen Transport in manchen Neuronen müssen über Entfernungen mehr als 1000-mal der Durchmesser des Zellkörpers durchgeführt werden, ist die Möglichkeit, ohne weiteres vorstellbar, dass auch kleine Mängel konnten deutlich beeinflussen und neuronalen Schaltungsfunktion.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ein Mitglied der Neurotrophin-Familie von Wachstumsfaktoren in mA vorliegtny Hirnregionen, einschließlich Hippocampus, Großhirnrinde und des basalen Vorderhirns. BDNF spielt eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung und Gedächtnis-Bildung durch Unterstützung des Überlebens, der Differenzierung und der Funktion von Nervenzellen, die in der kognitiven Schaltungen teilzunehmen. BDNF an seinen Rezeptor bindet, der Tyrosinkinase TrkB am Axonendigung wo es aktiviert TrkB-vermittelte Signalwege, einschließlich der Mitogen-aktivierte Proteinkinase / extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinase (MAPK / ERK), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Phospholipase C-gamma (PLC & ggr). Die Proteine, die in diesen Signalwegen beteiligt sind, auf endozytischen vesikulären Strukturen verpackt, um das BDNF / TrkB Signal Endosomen 1-6, die dann retrograd in die neuronalen Soma transportiert zu bilden.
Mikrofluidische Kulturkammer ist eine sehr nützliche Plattform für die Untersuchung der Biologie axonalen unter normalen Bedingungen als auch bei der Einstellung von Verletzungen und Krankheits 7,8. Durch die Isolierung Axoneaus den Zellkörpern, hat das Gerät darf man speziell in Transport Axone 8-10 studieren. Die PDMS basiert mikrofluidische Plattformen mit 450 um Mikronut Barrieren in dieser Studie verwendet wurden kommerziell erworben (siehe Materialien Tabelle). BDNF Transport zu untersuchen, entwickelten wir eine neuartige Technologie, um monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF) zu erzeugen. Wir nutzten die Biotin-Akzeptor-Peptid, AP (auch als AviTag bekannt). Es ist ein 15-Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest, der spezifisch an Biotin durch den Escherichia coli-Enzym-Biotin-Ligase BirA ligiert werden kann, enthält. Fusionierten wir die AviTag an den C-Terminus der Maus pre-proBDNF cDNA durch PCR (Abbildung 1a). Das Konstrukt wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3.1 myc-His-Vektor kloniert. Wir geklont auch die bakterielle DNA in die BirA pcDNA3.1 myc-Vektor sein. Die beiden Plasmide wurden transient in HEK293FT Zellen co-transfiziert, um beide Proteine exprimieren. BirA katalysiert die Ligation von Biotin spezifisch an das Lysin liegen im AviTag am C-Terminus von BDNF in einem Verhältnis 1: 1 bis monobiotinylierte BDNF-Monomers. Biotinylierte, reifen BDNF mit einer Molekularmasse von ~ 18 kDa wurde gewonnen und aus den Medien unter Verwendung von Ni-Harz (1C) gereinigt. Die Biotinylierung von BDNF war vollständig, wie durch die Unfähigkeit beurteilt unmodifizierten BDNF durch Immunoblotting (Figur 1D) zu erfassen. Streptavidin konjugierten Quantenpunkte, QD 655, wurden verwendet, um zu kennzeichnen, um mBtBDNF QD-BDNF zu machen. Die Anwesenheit des AviTag nicht mit der Aktivität von BDNF stören die mBtBDNF konnte phosphorylierten TrkB (1E) zu aktivieren und stimulieren das Neuritenwachstum (1F), um das Ausmaß des rekombinanten menschlichen BDNF (rhBDNF). Immunfärbung gezeigt, dass QD-BDNF kolokalisiert mit TrkB in Hippocampus-Axone, die anzeigt, dass QD-BDNF bioaktiv (1G). Um die BDNF Transport zu untersuchen, wurde QD-BDNF zu distalen Axon Fach hinzugefügtMikrofluidik-Kulturen mit Rattenhippocampusneuronen E18 (2A). QD-BDNF retrograden Transport in Axonen wurde von Echtzeit-Live-Bildgebung des roten Fluoreszenzmarkierung (Trag Videos S1, S2) erfasst. Durch die Analyse der erzeugten kymograph, QD-BDNF beobachtet wurde retrograd mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s (3A) transportiert werden. GFP oder mCherry-markierten BDNF wurden zur axonalen Bewegung von BDNF zu verfolgen. Die Hauptnachteile sind, dass sie nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Auch die Gegenwart von sowohl anterograden und retrograden BDNF Bewegungen macht es schwierig, zu beurteilen, ob die retrograd transportiert BDNF war in einem Neurotrophin / Rezeptor-Komplex.
In diesem Video zeigen wir die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. Die ultrabrightness und ausgezeichnete Photoquantenpunkte makes es möglich, langfristige Verfolgung von BDNF Transport durchzuführen. Diese Techniken können genutzt werden, um Studien der axonalen Funktion in AD, HD, und andere neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern.
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Protocol
Chirurgische und Tierverfahren werden streng nach dem NIH-Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente, die die Verwendung der Tiere werden von UCSD Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Plasmid Klonierung, Expression und Reinigung von Mono-biotinyliert BDNF (mBtBDNF)
HINWEIS: Konstruieren Sie vor-und proBDNFavi BirA cDNA in pcDNA3.1-Vektor und coexprimieren in HEK293FT Zellen 10. Reinigen mBtBDNF mit Ni-NTA-Kügelchen nach bisher veröffentlichten Verfahren zur Herstellung von reifen und biologisch aktive monobiotinylierte Nervenwachstumsfaktor (mBtNGF) 10.
2. Herstellung von Mikrofluidik-Chambers
Mikrofluidik-Neuronenkultur-Vorrichtung ermöglicht es, fluidisch zu isolieren Axone von Neuron Zellkörper. Montieren Kammern mit frisch beschichtete Deckgläser Recht vor jeder Sektion. Mikrofluidischen Kammern verwendetin diesem Protokoll sind kommerziell erhältlich (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle). Handwäsche und wiederverwendet werden kommerziell erworben Kammern bis zu 5-6x.
- Handwäsche mikrofluidischen Kammern in 1% Alconox. Dreimal mit Milli-Q-Wasser spülen für 30 Minuten jeweils. Handwaschkammern wieder in 70% Ethanol.
- Legen Sie Kammern auf Parafilm in der Sterilbank trocknen. Strahlen und sterilisieren Sie beide Seiten der Kammern für 20 min unter UV. Speicher sterilisiert Kammern in einer sterilen 15-cm-Schale mit Parafilm verschlossen und bei Raumtemperatur.
- Platz 24 x 40 mm Nr 1 Deckgläser in einem Glasbehälter. Weichen Sie die Deckgläser in 35% Salzsäure über Nacht auf einem Rotator. Am folgenden Tag, spülen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 30 Minuten mit Wasser.
- Sterilisieren Sie die Deckgläser eine nach der anderen durch Eintauchen jedes Deckglas in 100% Ethanol und flammenden über einem Bunsenbrenner. Trocken lagern Deckgläser in einer sterilen Petrischale und halten Sie sie bei Raumtemperatur bis zur Beschichtung.
- Legen out die Deckgläser in einer 15 cm Kulturschale. Mantel jedes Deckglas mit 0,7 ml 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) und Inkubation in der Haube bei Raumtemperatur.
- Nach 1 Stunde, spülen Sie die Deckgläser dreimal mit sterilem Wasser. Trockendeckgläser mit Vakuum und findet jedes Deckglas in eine 6 cm Kulturschale.
- Um die mikrofluidische Kammer montieren, platzieren Sie die Kammer mit Mikrorille Seite an der Unterseite auf die PLL beschichtete Deckglas mit Vorsicht die Mikrorillen nicht zu berühren. Sanft in die Kammer gedrückt, mit einer Pipettenspitze, um sicherzustellen, wurde die Kammer dicht verschlossen.
3. Dissection neuronaler Kultur und Platte auf Chambers
- Legen Sie zwei E17-E18 Rattenhippokampi (ein Gehirn) in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Puffer Dissektion (HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium seziert, mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10 mM HEPES. Spülen die Gewebe 3x mit 5 ml Dissektion Puffer jeder Zeit. Entfernen Sie die Dissektion Puffer so viel wie möglich und fügen Sie 900 ml frisches dissection Puffer.
- , Um das Gewebe zu verdauen, 100 l 10x Trypsin (2,5%) in die Dissektion Puffer 1x Arbeitskonzentration zu machen. Legen Sie die konische Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Nach 10 min wurde der Verdau wird mit 100 ul 10 mg / ml DNase I bis zu einer Endkonzentration ca. 1 mg / ml.
- Mit Hilfe eines feuerpolierten Pasteur Glaspipette, sanft verreiben das Gewebe durch Auf-und Abpipettieren 5-10x. Gleich nach Verreiben, löschen den Trypsin mit 2 ml Agarmedium (Neurobasal mit 10% FBS, 2 mM Glutamax, 2% B27).
- Verlassen Sie die Probe in der Haube für 5 min auf alle Ablagerungen der Gewebe ermöglichen, auf den Boden niederzulassen. 2 ml Überstand vorsichtig entfernen in eine saubere sterilen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Das Pellet in 50 ul Plattierungsmedien
- Zählen Sie die Zellen mit Zählkammer. Last 15-20 ul Zellsuspension (~ 40.000 Zellen) in einem Abteil des mikrofluidischen Kammer. Legen Sie die Kammerin den Inkubator für 10 Minuten, damit sich die Zellen an den Deck befestigen. Nach 10 Minuten, fügen Sie mehr Plattenmedien zu füllen beide Fächer der Kammer.
- Am zweiten Tag der Präparation vollständig die Plattenmedien mit wartungs Medien ersetzen (Neurobasal mit 2 mM Glutamax, 2% B27) sowohl in der Zellkörper und das Axon Fach. Axone von den Neuronen im Hippocampus zu starten, um die Mikrorillen in Tag 3 überqueren und erreichen das Axon Raum zwischen Tag 5-7. Während dieser Zeit ersetzen die Hälfte der Kulturmedien mit frischem Erhaltungsmedium alle 24 ~ 48 Stunden.
4. axonalen Transport von QD-BDNF
- Vor der Live-Imaging von QD-BDNF axonalen Transport, Abbau von BDNF sowohl die Zellkörper und Axon Fächer des mikrofluidischen Kammer gründlich beide Fächer mit BDNF-frei, Serum kostenlos Neurobasal Medien alle 30 Minuten für 2 Stunden.
- Während BDNF Erschöpfung, bereiten Sie die QD-Konjugate BDNF. Mischungs 50 nM biotinyliertem mono-BDNF-Dimer mit 50 nM QD655-Streptavidin-Konjugate in Neurobasalmedium Medien und Inkubation auf Eis für 60 min.
- Entfernen Medien im Axon Fach und 300 ul QD-BDNF mit einer Endkonzentration von 0,25 nM für 4 h bei 37 ° C aufweist. Um die Streu von QD-BDNF in den Zellkörper Raum zu minimieren, ist es sehr wichtig, um ein höheres Niveau der Medien in der Zellkörperraum immer halten als im Axon Fach. Abwaschen ungebundenen QD-BDNF nach Inkubation vor Live-Bildgebung.
- Führen Sie die Live-Darstellung von QD-BDNF Transport mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Öl Objektiv ausgestattet. Aufwärmen des Umfangs und der Klimakammer befestigt sein, um eine konstante Temperatur (37 ° C) und CO 2 (5%). Verwenden Sie einen Satz von Texas rot Anregung / Emission, um den Würfel QD655 Signal sichtbar zu machen.
- Erwerben und zu erfassen Zeitraffer-Bilder innerhalb der Mitte Axone mit der Geschwindigkeit von 1 Bild / s für insgesamt 2 min mit einer CCD-Kamera. Verwendung Mikrorillen ohne Axone that keine QD und somit kein Signal als Kontrolle für die Infiltration.
- Analysieren BDNF Transport mit jedem Bildanalyse-Software oder NIH ImageJ.
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Representative Results
Herstellung und Reinigung von biologisch aktiven Mono-biotinylierten BDNF
Der Expressionsvektor der BDNF mit einer AviTag Sequenz (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fusioniert wurde nach einem früher veröffentlichten Protokoll 10 erstellt. Die Molekularmasse des vollständigen Fusionsprotein wurde vorhergesagt ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) monobiotinyliertes reifen BDNF mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 18 kDa (1A) hergestellt wurde in HEK293FT Zellen und gereinigt aus konditioniertem Medium, wie beschrieben 10.
Unterschiedliche Fraktionen wurden gesammelt und auf einem 15% SDS-PAGE getrennt. Verwendung eines Kaninchen-anti-Avi-Tag-Antikörper, eine Bande mit einem Molekulargewicht von ~ 18 kDa wurde in der ersten Fraktion (1B) detektiert. Um die Reinheit der Präparation zu testen, wurden Proben auf SDS-PAGE getrennt und wurden gebeiztilver-Färbung. Wie in 1C gezeigt, wurde die 18 kDa-Bande die vorherrschende Spezies in der ersten Elution. Streptavidin-Agarose-Perlen-Pulldown-Assays wurden durchgeführt, um das Ausmaß der Biotinylierung des mBtBDNF Herstellung zu beurteilen. Folgende Pulldown mit Streptavidin-Agarose-Perlen wurden Proteine, die in dem Überstand verblieb bei 7% Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Diese Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert, und die Blots wurden entweder mit anti-Avi-Antikörper (oben) sondiert, um das Gesamtprotein oder HRP-Streptavidin an biotinylierte Proteine detektieren erfassen. Unsere Ergebnisse gezeigt, dass alle Signale mit den Kügelchen assoziiert, während keine Bande wurde in dem Überstand (1D) detektiert. Wir schließen also, dass mBtBDNF wurde mit einem Wirkungsgrad> 99,9% biotinyliert.
Um die biologische Aktivität von mBtBDNF der Bindung und Aktivierung der TrkB-Rezeptor zu testen, behandelten wir eine 3T3-Zelllinie, die TrkB entweder rhBDNF (20 ng / ml) exprimiert oder purified mBtBDNF (20 ng / ml) für 10 min. Zellen, die keine Behandlung erhalten wurden ebenfalls als Kontrolle gesammelt. Lysate wurden auf einem 4-12% SDS-PAGE aufgetrennt und ein Kaninchen-anti-pTrkB Antikörper wurde verwendet, um die phosphorylierten TrkB sondieren. Wie in 1E, ähnlich rhBDNF gezeigt, war mBtBDNF der Lage, die Phosphorylierung von TrkB auf einem ähnlichen Niveau zu induzieren. Wir behandelten Ratten-Hippocampus-Neuronen entweder rhBDNF (20 ng / ml) oder gereinigt mBtBDNF (20 ng / ml) für 48 Stunden. Gereinigtes mBtBDNF konnte hippocampalen Neuritenwachstum im Umfang rhBDNF (1F) zu stimulieren. Um die Co-Lokalisation von QD-BDNF-Rezeptors TrkB mit zu untersuchen, wurde QD-BDNF hinzugefügt Hippocampus Axon für 4 Stunden bei 37 Ratten ° C ist. Neuronen wurden dann fixiert und für TrkB immun. Wie in 1G gezeigt, QD-BDNF mit TrkB-co lokalisiert. Wir schließen also, dass mBtBDNF ist in seiner biologischen Funktion voll aktiv.
Live-Imaging von axonalen Transport von QD-BDNF in Neuronen im Hippocampus
Primären embryonalen Ratten-Hippocampus-Neuronen (E17-18) wurden seziert und in den Zellkörper Fach von mikrofluidischen Kammer plattiert. Am Tag 4 oder 5, erweitert Axone in den Mikrorillen in den Axons Fach. Am Tag 7, wuchs die meisten Axone in das Axon Fach. 1-Verhältnis (QD: BDNF-Dimer) auf Eis für 1 h QD-BDNF wurde durch Inkubieren der Streptavidin QD655 mit mBtBDNF bei einer 1 hergestellt. QD-BDNF (0,25 nM) wurde dann zu der Axon Raum zugegeben und 4 h bei 37 ° C vor der Bildgebung (2A) inkubiert.
Nach der Inkubation QD-BDNF wurde festgestellt, speziell auf Axone im Axon Raum zu binden. Im Zellkörper Raum wurden QD-Signale in den meisten proximalen Axone und Zellkörper anzeigt, die QD-BDNF wurde bei der Axone internalisiert und retrograd zum Zellkörper transportiert akkumuliert. Zeitraffer-Bildserien von QD-BDNF-Signale innerhalb Axone wurden in den Mikrorillen durchgeführt. QD signals wurden in den meisten der Mikrorillen mit Axone beobachtet, während keine QD-Signal in den Mikrorillen in der Abwesenheit von Axonen, die wenig oder keine Diffusion von QD-Signal von dem Axon Fach zum Zellkörper Raum (2B) zu sehen.
In 2C, wurden eine 80 um langen Segment der Axone von Neuronen im Hippocampus fluoreszenz für 100 sec aufgezeichnet. Insgesamt 6 QD-BDNF-Signale wurden während der Video-Aufnahme deutlich zu erkennen. Drei QD Signale aufgezeichnet bewegt unidirektional in Richtung Zellkörper (linke Seite). Die QD Falle von weißen Pfeil markiert (t: 31 sec bis T: 101 sec) bewegt, sanft zu dem Zellenkörper über den gesamten Bereich in ~ 70 Sekunden. Ein weiterer QD Veranstaltung grünen Pfeil gekennzeichnet (t: 1 s bis t: 61 sec) bewegt retrograd zuerst. Bei t: 21 sec, die QD-BDNF bewegt anterograd für 10 bis 20 sec, und dann geändert Richtung wieder in Richtung des Zellkörpers. Die QD Veranstaltung durch den gelben Pfeil markiert (t: 1 s bis t: 71 sec) bewegt auch retrograd Ely, aber für ~ 20 Sekunden Pause während der Bewegung. QD-BDNFs, die nicht in dieser 100 sec bewegt wurden, wurden als stationär. Nur bewegte Objekte wurden später analysiert werden, um die Bewegungsgeschwindigkeit, Durchschnittsgeschwindigkeit zu berechnen, und die Zeit angehalten.
Datenanalyse in der QD-BDNF Transport Kymograph
Kymographen wurden von jedem Film mit Metamorph-Software erfasst erstellt. Wie in den repräsentativen Kymographen von QD-BDNF Verkehr (3A) gezeigt, wurden QD-BDNF Bewegungen während 120 Sekunden in einem 80 um langen Segment der Axone erfasst. In repräsentativen kymograph 1, QD-BDNF bewegt schnell und reibungslos nach links (Zellkörper), überquerte das Feld (80 um) in ~ 60 sec, mit sehr kurzen Pausen (Unterstützung Video S1). Während in repräsentativen kymograph 2 eine QD-BDNF Paar ~ 50 um 120 sec retrograd, mit wenigstens drei Segmenten längere Pausen (durch Pfeile angezeigt) (Unterstützung Video S2).
Inhalt "> 3B ist das Streudiagramm der Bewegungsgeschwindigkeit, Durchschnittsgeschwindigkeit und hielt inne Zeit jedes einzelnen QD-BDNF. Die Bewegungsgeschwindigkeit der QD-BDNF war relativ schnell, bis hin 0,47-1,97 um / s mit dem Mittelwert der 1,06 ± 0,05 um / s herzustellen. Die durchschnittliche Geschwindigkeit des QD-BDNF wurde als Bewegungsdistanz / Zeit multipliziert wird. Und weil BDNF beim Transport unterbrochen wurde Schnittsgeschwindigkeit viel geringer als die Bewegungsgeschwindigkeit mit dem Mittelwert von 0,48 ± 0,03 um / s (zwischen 0,17-1,59 um / s). Pause Zeit wurde auch als eine Charakterisierung des BDNF Bewegung analysiert. Die mittlere Dauer der Pausen war 15,88 ± 1,30 s (Bereich 6-33 sec) (Tabelle 1).
Abbildung 1. Reinigung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF). (A) Eine schematische Zeichnung zeigt die Herstellung mBtBDNF. Sowohl Vor-und proBDNFavi BirA wurden in die pcDNA3.1myc-Vektor sein, wie beschrieben, 10 geklont. (B) Verschiedene Fraktionen der Eluate aus Ni-Harz wurden gesammelt und auf einem 15% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Ein Kaninchen-Anti-Avi-Tag-Antikörper wurde in der Blot verwendet. Eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ~ 18 kDa wurde im Eluat, was mit der vorhergesagten Molekülmasse des reifen mBtBDNF Protein erkannt. (C) Eine Silberfärbung Gel zeigt die 18 kDa mBtBDNF war die vorherrschende Spezies in der Elutionsfraktion. (D) gereinigt mBtBDNF wurde mit Streptavidin-Agarose-Beads inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen und in SDS-Beladungspuffer gekocht, während der Überstand wurde mit TCA vor SDS-PAGE-Analyse ausgefällt. Der Blot wurde mit entweder Anti-Avi-Antikörper oder mit HRP-Streptavidin sondiert. (E) 20 ng / ml gereinigtes mBtBDNF oder rhBDNF wurde auf eine 3T3-Zelllinie, E hinzugefügtxpresses TrkB für 10 min. Lysate wurden geerntet und auf einem 4-12% SDS-PAGE getrennt. Steuer Zelllysat wurde ebenfalls analysiert. Der Blot wurde mit einem Kaninchen-anti-pTrkB Antikörper sondiert. Gesamt TrkB wurde mit Hilfe eines Maus-Anti-TrkB Antikörper enthüllt. (F) 20 ng / ml gereinigtes mBtBDNF oder rhBDNF zugegeben Hippokampusneuronen 48 h Ratte. DIC Bilder wurden genommen, um Neuritenwachstum zu analysieren. (G) QD-BDNF wurde mit Ratten-Hippocampus Nervenbahnen 4 Stunden (Maßstab 5 um) inkubiert. Neuronen wurden dann fixiert und für TrkB immun.
. Abbildung 2. Einzelmolekülmessungen der retrograden Transport von BDNF in QD-Axone (A) Draufsicht: Eine schematische Zeichnung von mikrofluidischen Kammer mit primären Neuronen im Zellkörper Fach plattiert. Axone wuchsen über die MikrogrammDächer in das Axon Fach. QD655 markierten BDNF wurde dem Axon Fach aufgenommen. Seitenansicht: Die Medien-Ebene im Axon Fach wurde niedriger gehalten als die Zellkörper Fach für die Diffusion von QD-Signal zu minimieren. (B) Rot-Fluoreszenzbilder und Bilder der DIC Zellkörper Fach, Mikrorillen und Axon Fach. QD-BDNF speziell auf Axone gebunden, internalisiert und retrograd zu den Zellkörper entlang der Axone transportiert. Kein QD-Signal wurde in den Mikrorillen von Axonen abwesend beobachtet. (C) Zeitraffer-Video Bild-Serie von QD-BDNF Transport entlang des Axons. Sowohl bewegenden und stationären QD-BDNF Signale waren in den meisten der Filme anwesend. Zum Zeitpunkt t 1 Sekunde, mindestens 4 QD sehen. Nach 10 Sekunden werden zwei QDs (von grünen und gelben Pfeile) in Richtung der Zellkörper (links im Bild) in Bewegung. Diese beiden QDs bewegen und Pause in den ersten paar Bildern und schließlich bewegen von den Bildern auf der linken Seite (bei ~ 70 sec). Ein weiterer QD zog in das Feldbei t: 31 sec (durch weiße Pfeilrichtung) bewegt und schnell ohne großen Pausen nach links.
Abbildung 3. QD-BDNF Transport kymograph und Datenanalyse. (A) Repräsentative Kymographen von QD-BDNF Transport in primären Hippocampus-Neuronen. In kymo 1, zog eine helle QD über das Feld bei relativ hoher Geschwindigkeit mit nur wenigen kurzen Pausen. In kymo 2, die Bewegungsgeschwindigkeit der QD war langsamer, und die Bewegung wurde mit häufiger und längere Pausen unterbrochen. (B) Streudiagramm der QD-BDNF Bewegungsgeschwindigkeit, Durchschnittsgeschwindigkeit (berechnet als Reise Distanz / Zeit verwendet wird) und blieb Zeit. Die mittlere Bewegungsgeschwindigkeit des QD-BDNF war 1,06 ± 0,05 um / s (im Bereich von 0,47 bis 1,97 um / s herzustellen. Die durchschnittliche Geschwindigkeit des QD-BDNF betrug 0,48 ± 0,03 um / s (im Bereich von 0. 17 bis 1,59 um / s). Die mittlere Dauer der Pausen war 15,88 ± 1,30 s (im Bereich von 6 bis 33 sec).
Unterstützung Video S1 . Vertreter QD-BDNF Transportvideo 1. Mehrere QD-BDNF bewegen sich schnell in Richtung der linken Seite (Zellkörper) mit sehr wenigen kurzen Pausen.
Unterstützung Video S2 . Vertreter QD-BDNF Transportvideo 2. Mehrere QD-BDNF bewegen Richtung der linken Seite (Zellkörper) mit häufigen und langen Pausen relativ langsam.
| Minimum | Maximum | Bedeuten | 88px; "> Std Fehler.||
| Bewegungsgeschwindigkeit (Mikrometer / sec) | 0,47 | 1,97 | 1,06 | 0,05 |
| Durchschnittsgeschwindigkeit (Mikrometer / sec) | 0,17 | 1,59 | 0,48 | 0,03 |
| Pausiert Zeit (sec) | 6 | 33 | 15.88 | 1,30 |
Tabelle 1. Die Datenanalyse von QD-BDNF Transport.
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Discussion
In dieser Studie wurde die Entwicklung einer neuen Technik berichten wir produzieren biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Durch Konjugieren des Proteins Quantenpunkt Streptavidin, und unter Verwendung eines Mikrofluidkammer ermöglicht das Verfahren eine bis axonalen Transport von BDNF in primären Neuronen mit Einzelmolekülempfindlichkeit, in Echtzeit und mit räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen. Die hier verwendeten Tools bieten eine Mittel, um die molekularen Maschinen, die axonalen Transport von BDNF / TrkB Signal Endosomen in Neuronen in Gesundheit und Krankheit zu vermitteln studieren.
BDNF-GFP oder -mCherry wurden zur axonalen Bewegung von BDNF in verschiedenen neuronalen Kulturen in vitro zu verfolgen. Diese Reagenzien bieten eine Option für die Prüfung anterograde Transport und gegebenenfalls für die Prüfung autokrine Aktivierung von TrkB. Es gibt jedoch bedeutende Nachteile für die Untersuchung retrograden Transport der markantesten der WHIch ist, dass GFP oder mCherry sind nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Frühere Studien zeigten, dass unter physiologischen Konzentrationen von NGF, eine einzige NGF-Dimer wurde verinnerlicht 11 und retrograd transportiert 8. Wichtig ist, ermöglicht die Verwendung von BDNF QD auch, die subzelluläre Stelle, an der BDNF-Rezeptoren bindet seine TrkB definieren. Bei der Verwendung von GFP oder mCherry-markierten Proteine werden Somal Ausdruck in der Präsenz innerhalb des Axons von Proteinen unterziehen anterograde und retrograden Transport sowie führen. Als solches kann es schwierig, zu beurteilen, ob oder wo retrograd transportiert BDNF begegnet seinen Rezeptor vor dem Transport rückläufig. In der Tat, als Spekulation, retrograden Transport in Axonen von BDNF-GFP oder BDNF-mCherry in der gleichen Neuron erzeugt wird, kann von diesem nach der Bindung von BDNF in der Ziel der Innervation abweichen.
Obwohl die chemische Vernetzung hat für die Herstellung von biologisch aktiven Nervenwachstumsfaktor verwendet(NGF), ist die hier vorgestellte Verfahren überlegen. Erstens ist es schwierig, das Ausmaß der Biotinylierung genau zu steuern; So wurde jeder NGF mit 5-9 Biotingruppierungen 8,9,12 markiert. Zweitens kann die Vernetzung des Proteins zu inaktivieren. Im Fall von NGF, erforderte das Vernetzen des die Befestigung an Carboxylgruppen 13. Im Fall von BDNF wird die Aktivität oft folgende chemische Vernetzung an Biotin verloren. Schließlich kann das Ausmaß der Vernetzung unvollständig sein. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass ~ 0.8 Biotin / BDNF-Molekül wurde durch chemische Vernetzung erzeugt wird; als solche ~ 20% der BDNF nicht 9 gekennzeichnet. Die Anwesenheit von nicht-markierten BDNF könnte die Interpretation der Ergebnisse erschweren.
Unsere Technik bietet einzigartige Vorteile, die BDNF-Moleküle werden mit einem einzigen Biotin an der gleichen Stelle markiert, damit die eine homogene Zubereitung von biotinyliertem BDNF. Durch Konjugation zu nanofluorescent Partikel wie Quantenpunkte können sein mBtBDNFin Dendriten, Axonen in als auch in Zellkörpern: für die Verfolgung der Wege und Prozesse, die BDNF internalisiert, in Neuronen Handel eingesetzt. Diese Methode ermöglicht den Einsatz von alternativen Tags für BDNF. Die Entwicklung anderer Typen von Nanopartikeln verspricht zusätzliche Vorteile.
Defekte in der axonalen Handel und Signalisierung von BDNF in neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Starke Beweise defekten Transport von BDNF auf kortikale Atrophie-Striatum bei Chorea Huntington 14,15 verbunden. Mutierten Huntingtin-Proteins stört die Interaktion zwischen Huntingtin-assoziierte Protein-1 (HAP1) und Dynein Motor in sympathischen Neuronen hemmt BDNF Transport und führt zu einem Verlust von neurotrophen Unterstützung neuronaler Toxizität und 16-18. Unsere Techniken zur Verfolgung von BDNF axonalen Bewegung kann als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der axonalen Funktion bei neurodegenerativen Erkrankungen dienen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit für ihre technische Unterstützung danken. Die Studie wird von NIH (PN2 EY016525) und durch die Finanzierung von Down-Syndrom-Forschung und Behandlung-Stiftung und der Larry L. Hillblom Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
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