Summary
Axonal transport av BDNF, en neurotrofisk faktor, är avgörande för överlevnaden och funktionen av flera neuronala populationer. Vissa degenerativa sjukdomar kännetecknas av avbrott i axonal struktur och funktion. Vi demonstrerade de tekniker som används för att undersöka levande handel med QD-BDNF i mikroflödeskammare som använder primära neuroner.
Abstract
BDNF spelar en viktig roll i flera aspekter av neuronal överlevnad, differentiering och funktion. Strukturella och funktionella brister i axoner alltmer ses som en tidig funktion av neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD) och Huntingtons sjukdom (HD). Ännu oklart är mekanismen (er) genom vilka axonal skada induceras. Vi rapporterade att utveckla en ny teknik för att producera biologiskt aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan användas för att spåra axonal transport av BDNF. Quantum dot-märkta BDNF (QD-BDNF) producerades genom konjugering quantum dot 655 till mBtBDNF. En mikrofluidikanordning användes för att isolera axoner från neuron cell organ. Tillsats av QD-BDNF till axonal utrymmet tillät levande avbildning av BDNF transporter i axoner. Vi visade att QD-BDNF flyttade huvudsak uteslutande retrograd, med mycket få pauser, vid en rörelsehastighet på cirka 1,06 um / sek. Detta system kan användas för att undersöka migchanisms av störd axonal funktion i AD eller HD, liksom andra degenerativa sjukdomar.
Introduction
Nervceller är starkt polariserade celler vars långa och ofta mycket utarbetade processer är grundläggande för att etablera och upprätthålla struktur och funktion av neurala kretsar. Axonet spelar en viktig roll i genomförandet laster till och från synapser. Proteiner och organeller syntetiserade i cellen soma behöva transporteras genom axoner att nå den presynaptiska terminalen att stödja neuronal funktion. På motsvarande mottagna signaler vid distala axoner måste transducerad och förmedlas till soma. Dessa processer är avgörande för neuronal överlevnad, differentiering och underhåll. I det axonal transport i vissa nervceller ska ske genom sträckor mer än 1000 gånger diametern på cellkroppen, är möjligheten lätt föreställa sig att även små underskotten markant kan påverka neuronala och kretsfunktion.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), en medlem av neurotrofin familjen av tillväxtfaktorer, finns i maNY hjärnan, bland annat hippocampus, hjärnbarken och basala framhjärnan. BDNF spelar en avgörande roll i kognition och minnesbildning genom att stödja överlevnad, differentiering och funktion av nervceller som deltar i kognitiva kretsar. BDNF binder till sin receptor, tyrosinkinaset TrkB, vid axonet terminalen där den aktiverar trkB-förmedlad signalvägar inklusive mitogen aktiverat proteinkinas / extracellulära signalreglerade proteinkinas (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K) och fosfolipas C-gamma (PLCγ). De proteiner som deltar i dessa signalvägar är förpackade på endocytiska vesikulära strukturer för att bilda BDNF / TrkB signal endosom 1-6 som sedan retrograd transporteras till neuronala soma.
Den mikroflödes kulturen Kammaren är en mycket användbar plattform för att studera axonal biologi under normala förhållanden och i fastställandet av skada och sjukdom 7,8. Genom att isolera axonernafrån cellkroppar, har enheten får en att studera transport specifikt i axoner 8-10. PDMS baserade mikroflödes plattformar med 450 | im mikrospår barriärer användes i denna studie var kommersiellt köpt (se Material tabell). För att undersöka BDNF transporter har vi utvecklat en ny teknik för att producera monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Vi drog fördel av biotin accept peptiden, AP (även känd som AviTag). Det är en 15 aminosyrasekvens som innehåller en lysinrest som specifikt kan ligeras till en biotin från Escherichia coli enzym biotin-ligas, BirA. Vi fuserade den AviTag till C-terminalen av mus-pre-proBDNF cDNA genom PCR (Figur 1A). Konstruktionen klonades in i däggdjursexpressionsvektor, pcDNA3.1 myc-sin vektor. Vi klonade också den bakteriella BirA DNA i pcDNA3.1 myc-hans vektor. De två plasmiderna transient samtransfekteras in HEK293FT celler att uttrycka båda proteinerna. BirA katalyseras ligering av bioti specifikt till lysin uppehålla sig inom AviTag vid C-terminalen av BDNF vid en 1: 1-förhållande för att producera monobiotinylated BDNF-monomeren. Biotinylated, mogen BDNF med en molekylmassa på ~ 18 kDa utvinns och renas från media med Ni-harts (Figur 1C). Den biotinylering av BDNF var fullständig, att döma av oförmågan att upptäcka omodifierad BDNF genom immun (Figur 1D). Streptavidin konjugerade kvantprickar, QD 655, användes för att märka mBtBDNF att QD-BDNF. Närvaron av AviTag inte störa aktiviteten av BDNF som mBtBDNF kunde aktivera fosforyleras TrkB (Figur 1E) och stimulera neuritutväxt (Figur 1F) i den omfattning av rekombinant humant BDNF (rhBDNF). Immunfärgning visat att QD-BDNF colocalized med TrkB i hippocampus axoner, vilket indikerar att QD-BDNF är bioaktiva (figur 1G). För att studera BDNF transport, var QD-BDNF läggs till distal axon fackmikroflödes kulturer innehållande råtta E18 hippocampus nervceller (Figur 2A). QD-BDNF retrograd transport inom axoner fångades av realtids levande avbildning av den röda fluorescerande tagg (Supporting videos S1, S2). Genom att analysera kymograph genereras, var QD-BDNF observerade transporteras retrograd vid en rörelsehastighet på cirka 1,06 um / s (Figur 3A). GFP eller mCherry-märkt BDNF har använts för att spåra axonal rörelse av BDNF. De största nackdelarna är att de inte är tillräckligt ljust för enstaka molekyl studier. Även förekomsten av både antero och bakåtsträvande BDNF rörelser gör det svårt att bedöma om den retrograd transporteras BDNF var i en neurotrofin / receptorkomplexet.
I den här videon visar vi de tekniker som används för att undersöka levande handel med QD-BDNF i mikroflödeskammare med hjälp av primära neuroner. Den ultrabrightness och utmärkt fotostabilitet av kvantprickar makes det möjligt att utföra långsiktiga spårning av BDNF transport. Dessa tekniker kan utnyttjas för att öka studier av axonal funktion i AD, HD och andra neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kirurgiska och djurförsök utförs strikt enligt NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Alla experiment som omfattar användning av djur är godkända av UCSD Institutional Animal Care och användning kommittén.
1 Plasmid Kloning, Expression och rening av Mono-biotinylerad BDNF (mBtBDNF)
OBS: Konstruera pre-proBDNFavi och BirA cDNA in pcDNA3.1 vektor och samtidigt uttrycka i HEK293FT celler 10. Rena mBtBDNF användning av Ni-NTA-pärlor enligt tidigare publicerat förfarande för framställning av mogna och biologiskt aktiva monobiotinylated nervtillväxtfaktor (mBtNGF) 10.
2 Beredning av Mikroflödes Chambers
Mikrofluidumanordning neuron odling enhet gör det möjligt att fluid isolera axoner från neuron cell organ. Montera kammare med nyligen belagda täck precis innan varje dissekering. Mikroflödes kamrar användsi detta protokoll är kommersiellt köps (se material och utrustning bord). Handtvätt och åter kommersiellt inköpta kammare upp till 5-6x.
- Handtvätt mikroflödeskammare i 1% Alconox. Skölj tre gånger med Milli-Q-vatten i 30 minuter vardera. Handtvätt kammare igen i 70% etanol.
- Lägg ut kamrarna att torka på Parafilm i laminärt flöde huva. Radiate och sterilisera båda sidorna av kamrarna för 20 minuter under UV. Butiks steriliserad kammare i en steril 15 cm skål förseglade med Parafilm vid rumstemperatur.
- Placera 24 x 40 mm nr 1 av glas i en glasbehållare. Blötlägg täckglas i 35% saltsyra över natten på en rotator. På den följande dagen, skölj täckglasen tre gånger i 30 min vardera med vatten.
- Sterilisera täckglasen en efter en genom att doppa varje täckglas i 100% etanol och flammande över en bunsenbrännare. Förvara torrt täckglas i en steril petriskål och förvara det i rumstemperatur tills beläggningen.
- Lay out täck i en 15 cm odlingsskål. Coat varje täckglas med 0,7 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) och inkubera i huven vid rumstemperatur.
- Efter 1 timme, skölj täckglasen tre gånger med sterilt vatten. Torra täckglas med vakuum och plats varje täckglas till en 6 cm odlingsskål.
- För att montera mikroflödeskammaren, placera kammaren med Microgroove sida längst ner på PLL belagda täckglas med försiktighet inte röra mikrospåren. Tryckte försiktigt ned i kammaren med en pipett för att säkerställa kammaren var tätt tillsluten.
3 Dissekering av neuronal kultur och Plate på Chambers
- Placera två E17-E18 rått hippocampi (en hjärna) dissekeras i ett 15 ml koniskt rör innehållande 2 ml dissektion buffert (HBSS, ingen kalcium, ingen magnesium, med en% pen / strep och 10 mM HEPES. Skölj vävnaderna 3 gånger med 5 ml dissektion buffert varje gång. Ta dissektion bufferten så mycket som möjligt och tillsätt 900 l av färska dissection buffert.
- För att smälta den vävnad, tillsätt 100 | il av 10x trypsin (2,5%) i dissektion buffert för att göra 1x arbetskoncentration. Placera den koniska röret i ett 37 ° C vattenbad. Efter 10 min av matsmältning, tillsätt 100 | il av 10 mg / ml DNas I till en slutlig koncentration cirka 1 mg / ml.
- Med hjälp av en brand-polerat Pasteur glaspipett försiktigt mal sönder vävnaderna genom att pipettera upp och ned 5-10x. Direkt efter triturering, släcka trypsinet med 2 ml plätering-medium (Neurobasal med 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27).
- Låt provet i huven i 5 minuter för att låta eventuellt skräp i vävnaderna för att slå sig ner till botten. Avlägsna försiktigt 2 ml av supernatanten till ett rent sterilt 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 200 xg under 5 min för att pelletera cellerna. Återsuspendera pelleten i 50 | il plating media
- Räkna celler med hemocytometer. Last 15-20 pl cellsuspension (~ 40000 celler) in i ett fack av mikroflödeskammaren. Placera kammareni inkubatorn under 10 min för att tillåta cellerna att fästa vid täckglas. Efter 10 minuter, tillsätt mer plätering media för att fylla upp både fack i kammaren.
- På den andra dagen av dissektion, helt ersätta plätering media med underhålls media (Neuro med 2 mM GlutaMax, 2% B27) i både cellkroppen och axonet utrymmet. Axoner från hippocampus nervceller börjar passera mikrospåren i dag 3 och nå axonet utrymmet mellan dag 5-7. Under denna tidsperiod, byta ut hälften av odlingsmedier med färsk underhålls media varje 24 ~ 48 timmar.
4 axonal transport av QD-BDNF
- Före levande avbildning av QD-BDNF axonal transport, bryter BDNF från både cellkroppen och axon fack i mikroflödeskammaren genom Skölj både fack med BDNF-free, serumfritt Neurobasal media varje 30 min under 2 timmar.
- Under BDNF utarmning, förbereda QD-BDNF konjugat. Blanda 50 nM av mono-biotinylerad BDNF dimer med 50 Nm QD655-streptavidin konjugat i Neurobasal media och inkubera på is i 60 min.
- Avlägsna media i axonet utrymmet och lägg 300 pl QD-BDNF med en slutlig koncentration av 0,25 nM för 4 h vid 37 ° C. För att minimera spridnings av QD-BDNF i cellkroppen facket, är det mycket viktigt att alltid ha en högre nivå av media i cellkroppen utrymmet än i axonet utrymmet. Tvätta obundet QD-BDNF efter inkubation innan levande avbildning.
- Utför levande avbildning av QD-BDNF transport med ett inverterat mikroskop utrustat med ett 100X olja objektiv. Värm upp omfattningen och miljökammaren fäst vid den till en konstant temperatur (37 ° C) och CO 2 (5%). Använd en uppsättning Texas röd excitation / emissions kuber att visualisera QD655 signalen.
- Förvärva och fånga tidsförlopp bilder inom de mellersta axoner med en hastighet av 1 bild / sek för totalt 2 min med hjälp av en CCD-kamera. Använd mikrospår utan axoner that har ingen QD och därmed ingen signal som en kontroll för infiltration.
- Analysera BDNF transporter använder någon bildanalys programvara eller NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framställning och rening av biologiskt aktiva Mono-biotinylerad BDNF
Expressionsvektom av BDNF kondenserad med en AviTag sekvens (GGGLNDIFEAQKIEWHE) skapades enligt ett tidigare publicerat protokoll 10. Molekylmassan för fullängdsfusionsproteinet spås bli ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated mogen BDNF med en förutsedd molekylmassa på 18 kDa (Figur 1A) producerades i HEK293FT celler och renades från konditionerat medium som beskrivits 10.
Olika fraktioner samlades upp och separerades på en 15% SDS-PAGE. Med användning av en kanin-anti-Avi tag-antikropp, ett band med en molekylvikt av ~ 18 kDa detekterades i den första fraktionen (Figur 1B). För att testa renheten av beredningen togs prover separerades på SDS-PAGE och färgades av silver-färgning. Såsom visas i figur 1C, kDa-bandet 18 var de dominerande arterna i den första elueringen. Streptavidin-agarospärlor pulldown analyser utfördes för att bedöma omfattningen av biotinylering av mBtBDNF preparatet. Efter neddragning med streptavidin-agarospärlor, var proteiner som förblev i supernatanten fälldes ut med 7% triklorättiksyra (TCA). Dessa prover analyserades med SDS-PAGE och blottarna sonderades med antingen anti-Avi antikroppar (överst) för att detektera det totala proteinet eller HRP-streptavidin för att detektera biotinylerade proteiner. Våra resultat visade att alla de signaler som var associerade med pärlorna medan inget band detekterades i supematanten (figur 1D). Vi avslutar alltså att mBtBDNF biotinylerades vid en verkningsgrad> 99,9%.
För att testa den biologiska aktiviteten av mBtBDNF i bindning och aktivering av TrkB-receptor, behandlade vi en 3T3-cellinje som uttrycker TrkB med antingen rhBDNF (20 ng / ml) eller purified mBtBDNF (20 ng / ml) under 10 min. Celler som inte fick någon behandling ades också in som kontroll. Lysat separerades på en 4-12% SDS-PAGE och en kanin-anti-pTrkB antikropp användes för att sondera den fosforylerade TrkB. Såsom visas i figur 1E, liknande rhBDNF, var mBtBDNF förmåga att inducera fosforylering av TrkB på en liknande nivå. Vi behandlade också råtta hippocampusneuroner med antingen rhBDNF (20 ng / ml) eller renas mBtBDNF (20 ng / ml) under 48 tim. Renat mBtBDNF kunde stimulera hippocampus neuritutväxt till omfattningen av rhBDNF (Figur 1F). För att undersöka samlokalisering av QD-BDNF med TrkB receptorn, var QD-BDNF läggas till rått hippocampus Axon under 4 timmar vid 37 ° C. Nervceller fixerades sedan och immun för TrkB. Såsom visas i figur 1G, QD-BDNF samlokaliserade med TrkB. Vi avslutar alltså att mBtBDNF är fullt aktiv i sin biologiska funktion.
Live avbildning av axonal transport av QD-BDNF in hippocampus nervceller
Primära embryonala råtta hippocampus nervceller (E17-18) dissekerades och klädd i cellkroppen utrymmet på mikroflödeskammare. På dag 4 eller 5, axoner utvidgas till hela mikrospåren i axonet facket. På dag 7, de flesta axoner växte till axonet facket. QD-BDNF framställdes genom inkubering av streptavidin QD655 med mBtBDNF vid en 1: 1-förhållande (QD: BDNF dimer) på is under 1 tim. QD-BDNF (0,25 nM) tillsattes därefter till axonet utrymmet och inkuberades under 4 h vid 37 ° C före avbildning (Figur 2A).
Efter inkubation till QD-BDNF befanns binda specifikt till axoner i axonet utrymmet. I cellkroppen facket, var QD signaler ackumuleras i de flesta av de proximala axoner och cellkroppar indikerar QD-BDNF interna på axoner och retrograd transporteras till cellkroppar. Time-lapse bildserie av QD-BDNF signaler inom axoner genomfördes i mikrospåren. QD arignals observerades i de flesta av mikrospåren med axoner medan ingen QD signal kan ses i mikrospåren i frånvarande av axoner, vilket indikerar liten eller ingen diffusion av QD signal från axonet utrymmet till cellkroppen utrymmet (Figur 2B).
I figur 2C, var en 80 nm långt segment av axoner av hippocampus nervceller fluorescerande noterats för 100 sek. Totalt 6 QD-BDNF signaler tydligt under videoinspelning. Tre QD signaler inspelade förflyttas ensriktat mot cellkroppen (vänster sida). Den QD händelsen märkta med vita pilen (t: 31 sek för att t: 101 sek) flyttade smidigt till cellkroppen passerar hela fältet i ~ 70 sek. En annan QD händelse märkta med grön pil (t: 1 sek till t: 61 sek) flyttade retrograd först. Vid t: 21 sek, flyttade QD-BDNF anterogradely för 10 till 20 sekunder, och sedan bytte riktning igen mot cellkroppen. Den QD händelsen märkta med gula pilen (t: 1 sek för att t: 71 sek) också flyttat retrograd ely, men pausade för ~ 20 sek under rörelsen. QD-BDNFs som inte rör sig under denna 100 sek ansågs stilla. Endast rörliga objekt senare analyseras för att beräkna rörliga hastighet, medelhastighet, och tid i pausläge.
Dataanalys i QD-BDNF Transport kymograph
Kymographs skapades från varje film som spelats in med metamorfa programvara. Såsom visas i de representativa kymographs av QD-BDNF transport (fig 3A), var QD-BDNF rörelser som registrerats under 120 s i en 80 ^ m långa segmentet av axoner. I representativa kymograph 1, flyttade QD-BDNF snabbt och smidigt åt vänster (cellkroppen), korsade fältet (80 pm) i ~ 60 sek, med mycket korta pauser (Supporting Video S1). Medan i representativ kymograph 2, en QD-BDNF rest ~ 50 | im i 120 sek retrograd, med åtminstone tre segment av längre pauser (indikerade med pilar) (Stödjer Video S2).
innehåll "> Figur 3B är ett spridningsdiagram av rörliga hastighet, medelhastighet, och paustiden för varje enskild QD-BDNF. förflyttningshastigheten av QD-BDNF var relativt snabb, som sträcker sig från 0,47 till 1,97 ^ m / sek med medelvärdet av 1,06 ± 0,05 um / sek. Den genomsnittliga hastigheten för QD-BDNF beräknades som reser distans / tid används. Och eftersom BDNF pausad under transporten, medelhastighet var mycket lägre än att flytta hastighet med medelvärde 0,48 ± 0,03 um / sek (allt 0,17-1,59 um / s). Pausad tid analyserades också som en karakterisering av BDNF rörelsen. Den genomsnittliga längden på pauser var 15,88 ± 1,30 sek (mellan 6-33 sek) (Tabell 1).
Figur 1 Rening av biologiskt aktiva, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) En schematisk ritning visar produktionen av mBtBDNF. Både pre-proBDNFavi och BirA klonades in i pcDNA3.1myc-hans vektor som beskrivits 10. (B) olika fraktioner av eluerar från Ni-harts samlades upp och separerades på en 15% SDS-PAGE-gel. En kanin-anti-Avi tag-antikropp användes i blot. Ett band med en skenbar molekylvikt av ~ 18 kDa erkändes i eluatet, som överensstämmer med den förutsagda molekylmassan för det mogna mBtBDNF proteinet. (C) En silverfärgning gel visar 18 kDa mBtBDNF var de dominerande arterna i elueringsfraktionen. (D) Renat mBtBDNF inkuberades med streptavidin-agaroskulor. Pärlorna tvättades och kokades i SDS-laddningsbuffert medan supernatanten fälldes ut med TCA före SDS-PAGE-analys. Blotten sonderades med antingen anti-Avi-antikropp eller med HRP-streptavidin. (E) 20 ng / ml av renat mBtBDNF eller rhBDNF sattes till en 3T3-cellinje som expresses TrkB för 10 min. Lysaten skördades och separerades på en 4-12% SDS-PAGE. Kontroll cellysat analyserades också. Blotten sonderades med ett kanin-anti-pTrkB antikropp. Total TrkB avslöjades med hjälp av en mus anti-TrkB antikropp. (F) 20 ng / ml av renat mBtBDNF eller rhBDNF sattes till rått hippocampusneuroner för 48 tim. DIC bilder togs för att analysera neuritutväxt. (G) QD-BDNF inkuberades med rått hippocampus neuron axoner för 4 h (skal 5 pm). Nervceller fixerades sedan och immun för TrkB.
. Figur 2 Single molekyl avbildning av retrograd transport av QD-BDNF i axoner (A) Ovanifrån: En schematisk ritning av mikroflödeskammare med primära nervceller pläterade i cellkroppen facket. Axoner växte över mikrogrooves i axonet facket. QD655 märkt BDNF sattes till Axon utrymmet. Från sidan: Medienivån i axonet utrymmet hölls lägre än cellkroppen utrymmet för att minimera spridningen av QD-signal. (B) Red fluorescens bilder och DIC bilder av cellkroppen fack, mikrospår och Axon utrymmet. QD-BDNF bundna specifikt till axoner, internaliseras och retrograd transporteras till cellkropparna längs axoner. Ingen QD signal observerades i mikrospåren frånvarande av axoner. (C) Time-lapse video bildserie av QD-BDNF transporter längs axonet. Både rörliga och stationära QD-BDNF signaler var närvarande i de flesta filmer. Vid tiden t: 1 sek, kan minst 4 QDs ses. Efter 10 sekunder är två QDs (anges med gröna och gula pilar) rör sig mot cellkroppen (till vänster på bilden). Dessa två QDs flytta och pausa i de första par bilder och så småningom flytta ut bilderna till vänster (vid ~ 70 sek). En annan QD flyttade in i fältetvid t: 31 sek (anges med vit pil) och flyttade snabbt utan större pauser till vänster.
Figur 3 QD-BDNF transport kymograph och dataanalys. (A) Representativa kymographs av QD-BDNF transporter i primära hippocampus nervceller. I Kymo 1, flyttade en ljus QD över fältet vid relativt snabb hastighet med bara några korta pauser. I Kymo 2, rörelsehastigheten av QDs var långsammare, och rörelsen avbröts med fler och längre pauser. (B) Punktdiagram för QD-BDNF glidande hastighet, medelhastighet (beräknat som reser distans / tid används) och pausade tiden. Den genomsnittliga rörelsehastighet av QD-BDNF var 1,06 ± 0,05 um / sek (mellan 0,47-1,97 um / sek. Den genomsnittliga hastigheten för QD-BDNF var 0,48 ± 0,03 um / s (från 0. 17-1,59 im / sek). Den genomsnittliga längden på pauser var 15,88 ± 1,30 sek (mellan 6-33 sek).
Stödjande Video S1 . Representant QD-BDNF transport video 1 Flera QD-BDNF gå snabbt mot vänster sida (cellkropp) med mycket få korta pauser.
Stöd Video S2 . Representant QD-BDNF transport video 2 Flera QD-BDNF gå relativt långsamt åt vänster sida (cellkropp) med täta och långa pauser.
| Minsta | Maximal | Medelvärde | 88px;. "> Std fel||
| Rörliga hastighet (mikron / sek) | 0,47 | 1,97 | 1,06 | 0,05 |
| Genomsnittlig hastighet (mikron / sek) | 0,17 | 1,59 | 0,48 | 0,03 |
| Paused tid (sek) | 6 | 33 | 15,88 | 1,30 |
Tabell 1 Data-analys av QD-BDNF transporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie rapporterar vi utvecklingen av en ny teknik för att producera biologiskt aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan användas för att spåra axonal transport av BDNF. Genom att konjugera proteinet till quantum dot streptavidin, och med användning av en mikroflödeskammare, tillåter metoden ett att detektera axonal transport av BDNF i primära nervceller med enda molekyl känslighet, i realtid och med rumslig och temporal upplösning. De verktyg som används här ger ett medel för att studera de molekylära maskiner som förmedlar axonal transport av BDNF / trkB signalerings endosomer i nervceller i hälsa och sjukdom.
BDNF-GFP eller -mCherry har använts för att spåra axonal rörelse av BDNF i olika neuronala kulturer in vitro. Dessa reagenser erbjuder ett alternativ för att pröva antero transport och eventuellt för att pröva autokrin aktivering av TrkB. Men det finns stora nackdelar för att studera retrograd transport, den mest framträdande av which är att GFP eller mCherry inte tillräckligt ljust för enstaka molekyl studier. Tidigare studier visade att under fysiologiska koncentrationer av NGF, var ett enda NGF dimer intern 11 och retrograd transporteras 8. Viktigt är, tillåter användningen av QD BDNF också ett för att definiera den subcellulära plats där BDNF binder sina TrkB-receptorer. Vid användning av GFP eller mCherry-märkta proteiner, kommer Somal uttryck resultera i närvaro inom axonet av proteiner genomgår antero och även retrograd transport. Som sådant kan det vara svårt att bedöma om eller när retrograd transporteras BDNF mötte sin receptor före retrograd transport. Ja, som en spekulation, retrograd transport inom axoner av BDNF-GFP eller BDNF-mCherry på samma neuron kan skilja sig från den som binds BDNF i målet innervation.
Även om kemisk tvärbindning har använts för framställning av biologiskt aktiv nervtillväxtfaktor(NGF), är den metod som infördes häri överlägsen. För det första är det svårt att styra den exakta omfattningen av biotinylering; till exempel, var varje NGF märktes med 5-9 biotindelar 8,9,12. För det andra kan tvärbindnings inaktivera proteinet. I fallet med NGF, tvärbindning necessitated fastsättning karboxylgrupper 13. I fallet med BDNF, är aktiviteten ofta förlorad efter kemisk tvärbindning till biotin. Slutligen kan graden av tvärbindning vara ofullständig. En färsk rapport visar att ~ 0,8 biotin / BDNF-molekylen har producerats av kemisk tvärbindning; som sådan ~ 20% av BDNF var märkt 9. Förekomsten av omärkt BDNF kunde försvåra tolkningen av resultaten.
Vår teknik ger de unika fördelar som BDNF molekyler alla är märkta med en enda biotin på samma plats, och utgör således en homogen beredning av biotinylerad BDNF. Genom att konjugera till nanofluorescent partiklar såsom kvantprickar, kan mBtBDNF varaanvänds för att spåra de vägar och processer som BDNF är internaliserade, trafikerade inom neuroner: i dendriter i axoner och i cellkroppar. Denna metod gör det möjligt att använda alternativa taggar för BDNF. Utvecklingen av andra typer av nanopartiklar lovar ytterligare fördelar.
Defekter i axonal handel och signalering av BDNF har varit inblandade i neurodegenerativa sjukdomar. Starka bevis har kopplat defekt transport av BDNF till kortikal-striatala atrofi i Huntingtons sjukdom 14,15. Mutant Huntingtin protein stör interaktionen mellan Huntingtin-associerat protein-1 (HAP1) och dynein motorn i sympatiska neuroner, hämmar BDNF transporter, och resulterar i förlust av neurotrophic stöd och neuronal toxicitet 16-18. Våra tekniker för spårning axonal rörelse BDNF kan fungera som ett värdefullt verktyg för att studera axonal funktion i neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit för deras tekniska stöd. Studien stöds av NIH bidrag (PN2 EY016525) och genom finansiering från Down Syndrome Research and Treatment Foundation och Larry L. Hillblom Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
