Summary
BDNF, bir nörotrofik faktör, bir aksonal taşınması birçok nöron popülasyonlarının hayatta kalma ve fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bazı dejeneratif bozukluklar aksonal yapı ve fonksiyon bozulması ile işaretlenmiştir. Biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikler gösterdi.
Abstract
BDNF nöronal hayatta kalmasını, farklılaşmasını ve fonksiyon bir çok alanda önemli bir rol oynar. Akson yapısal ve fonksiyonel açıkları giderek Alzheimer hastalığı (AH) ve Huntington hastalığı (HD) olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar, erken bir özelliği olarak görülmektedir. Henüz tam olarak açıklanamamıştır aksonal yaralanma kaynaklı olduğu mekanizma (ler) idir. Bu biyolojik olarak aktif bir üretmek için yeni bir teknik gelişme rapor BDNF aksonal taşınması takip etmek için kullanılabilir BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. Kuantum nokta-etiketli BDNF (QD-BDNF) mBtBDNF kuantum nokta 655 konjuge tarafından üretildi. Mikroakışkan cihaz nöron hücre gövdeleri aksonlar izole etmek için kullanılmıştır. Aksonal bölmesine QD-BDNF eklenmesi akson BDNF ulaşım canlı görüntüleme izin verdi. Biz, QD-BDNF yaklaşık 1.06 mm / sn bir hızda hareket azından çok az duraklar, retro-esas olarak sadece hareket ettiğini gösterdi. Bu sistem beni araştırmak için kullanılabilirAH veya bozulmuş HD aksonal fonksiyonu gibi başka dejeneratif bozukluklar chanisms.
Introduction
Nöronlar yüksek olan uzun ve genellikle son derece özenli süreçleri kurmak ve nöral devrelerin yapısını ve işlevini korumak için temel olan hücreler polarize. Akson ve sinapsların yük taşıyan hayati bir rol oynar. Hücre soma sentezlenen proteinler ve organelleri nöronal fonksiyonu desteklemek için presinaptik terminale ulaşmak için aksonlar aracılığıyla taşınması gerekir. Buna karşılık, sinyalleri uzak aksonlar transdüse gerekir alınan ve soma aktarıldı. Bu işlemler, nöronal canlı kalmasını, farklılaşmasını ve bakım için çok önemlidir. Bazı nöronlarda aksonal taşınmasının bu mesafeler üzerinden 1.000 'den fazla kez hücre gövdesi çapının yürütülmesi gereken olarak, olasılık bile hali hazırda küçük eksikliklerin belirgin nöronal devre fonksiyonunu etkileyebilir düşünülmüştür.
, Beyin türevli nörotropik faktör (BDNF), büyüme faktörlerinin nörotrofin ailesinin bir üyesi, ma mevcutturhipokampus, serebral korteks ve bazal ön dahil ny beyin bölgeleri,. BDNF, bilişsel devrelerinde katılma nöronların hayatta kalmasını, farklılaşmasını ve fonksiyon destekleyerek idrak ve hafıza oluşumunda önemli bir rol oynar. BDNF, bu mitojen tarafından aktive edilen protein kinaz / hücre dışı sinyal ile düzenlenen protein kinaz (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-kinaz dahil olmak üzere, TrkB aracılı sinyalleme yolunu aktive akson terminal, kendi reseptörü, tirosin kinaz TrkB bağlanan (PI3K) ve fosfolipaz C-gama (PLCγ). Bu sinyal yolları katılan proteinler daha sonra retrograd nöronal soma taşınır endosome 1-6 sinyalizasyon BDNF / TrkB oluşturmak için endositik veziküler yapıların üzerine paketlenir.
Mikroakışkan kültür oda normal şartlar altında yanı sıra yaralanma ve hastalık 7,8 ayarı aksonal biyoloji eğitimi için çok yararlı bir platform. Izole aksonlarlahücre gövdeleri, cihaz aksonlar 8-10, özellikle taşıma anlaşılmasına bir sağladı. Bu çalışmada kullanılan ve 450 um microgroove bariyerli PDMS göre mikro-akışkan platformlar ticari (Malzemeler tabloya bakınız) satın alınmıştır. BDNF, taşıma incelemek için monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) üretimi için yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. (Da AviTag olarak da bilinir), biyotin alıcı peptidin, AP yararlandı. Bu, özellikle Escherichia coli enziminin biyotin ligazı, Bira ile biyotine bağlanabilir bir lisin kalıntısı ihtiva eden bir 15 amino asit dizisidir. Bu PCR (Şekil 1 A), fare pre-proBDNF cDNA'nın C terminaline AviTag kaynaşık. Bu yapı, memeli ekspresyon vektörü pcDNA3.1 myc-his vektörü içine klonlandı. Ayrıca, pcDNA3.1 myc-his vektörü içine bakteri, BirA DNA klonlanmıştır. Iki plasmid geçici olarak her iki proteini ifade etmek için HEK293FT hücrelerine eş-transfekte edilmiştir. BirA biotun ligasyonu katalizeözel olarak bir lizin 1 de BDNF C-terminalindeki AviTag içinde ikamet: 1 oranında, BDNF monomer monobiotinylated üretmek. Biyotinile edilmiş, ~ 18 kDa bir moleküler kütleye sahip BDNF olgun geri kazanılmış ve Ni-reçinesi (Şekil 1C) kullanılarak ortamdan saflaştırılmıştır. (Şekil 1D) imüno-benekleme ile değiştirilmemiş BDNF saptamak mümkün ile karar kılındığı üzere BDNF biyotinilasyon, tamamlandı. Streptavidin konjüge kuantum noktaları, QD 655, QD-BDNF yapmak mBtBDNF etiketlemek için kullanıldı. MBtBDNF fosforile TrkB (Şekil 1E) ve rekombinant insan aktive BDNF (rhBDNF) ölçüsünde nörit gelişimini (Şekil 1F) teşvik etmek için mümkün olduğu gibi AviTag varlığı BDNF aktivitesine müdahale etmedi. QD-BDNF QD-BDNF biyoaktif (Şekil 1G) olduğunu belirten, hipokampal aksonlardaki trkB ile birlikte yerleştiğini göstermiştir immünolekeleme. BDNF taşıma incelemek için, QD-BDNF distal akson bölmesine eklenmiştirsıçan E18 hipokampal nöronlar (Şekil 2A) içeren mikrosıvı kültürler. Akson içindeki QD-BDNF retrograd taşıma kırmızı floresan etiketi (Desteklenmesi videolar S1, S2) gerçek-zamanlı canlı görüntüleme tarafından yakalandı. Oluşturulan kymograph analiz ederek, QD-BDNF yaklaşık 1.06 mm / sn (Şekil 3A) bir hızda hareket eden bir retrograd taşınacak gözlenmiştir. GFP veya MCherry etiketli BDNF BDNF aksonal hareketini izlemek için kullanılır olmuştur. Büyük dezavantajı, tek bir molekülün çalışmaları için yeterince parlak değil olmasıdır. Ayrıca, her iki anterograd ve retrograd BDNF hareketlerinin bulunması zor retrograd olarak taşınan, BDNF bir nörotrofinin / reseptör kompleksi olup olmadığını değerlendirmek için yapar.
Bu videoda, biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikleri göstermek. Ultrabrightness ve kuantum noktaları mak mükemmel fotostabilitees mümkün BDNF ulaşım uzun vadeli izleme gerçekleştirmek için. Bu teknikler, MS, HD ve diğer nörodejeneratif hastalıklar aksonal çalışmalar fonksiyonunun arttırılması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cerrahi ve hayvan prosedürleri Bakımı NIH Kılavuzu'na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre kesinlikle yapılır. Hayvanlarının kullanıldığı bütün deneyler UCSD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Plazmid Klonlama, mono-biyotinlenmiş BDNF sentezlenmesi ve saflaştırılması (mBtBDNF)
NOT: HEK293FT hücrelerde 10 pcDNA3.1 vektörü ve birlikte açığa içine önceden proBDNFavi ve BirA cDNA Construct. MBtBDNF olgun ve biyolojik olarak aktif monobiotinylated sinir büyüme faktörü (mBtNGF) üretilmesi için 10, daha önce yayınlanmış bir metoda göre Ni-NTA boncuklar kullanılarak saflaştınlır.
Mikroakışkan Odaları 2. Hazırlık
Mikroakışkan nöron kültür cihazı akışkan nöron hücre gövdeleri aksonlar izole edilmesini mümkün kılar. Sağ her diseksiyon önce taze kaplı lamelleri ile odaları birleştirin. Kullanılan mikroakışkan odalarıBu protokolde ticari (malzeme ve ekipmanın tabloya bakınız) satın alınır. Handwash ve 5-6x kadar yeniden piyasadan satın odaları.
- El yıkama% 1 Alconox içinde mikroakışkan odaları. 30 dakika her biri için Milli-Q su ile üç kez durulanır. % 70 etanol içinde tekrar el yıkama odaları.
- Laminer akış kaputu Parafilmlerin üzerinde kurumaya odaları dışarı yatıyordu. Yayar ve UV altında 20 dakika boyunca odacıkların her iki tarafını da sterilize edin. Mağaza oda sıcaklığında Parafilm ile mühürlenmiş steril bir 15 cm çanak odaları sterilize.
- Cam bir kap içinde 24 x 40 mm 1 numaralı cam lamelleri yerleştirin. Gece boyunca, bir döndürücü üzerinde% 35 hidroklorik asit lamelleri bekletin. Ertesi gün, 30 dakika su ile her biri için lamelleri üç kez yıkayın.
- % 100 etanol içine Her lamel daldırma ve bir Bunsen beki üzerinde yanan tarafından lamelleri tek tek sterilize edin. Steril bir petri tabağında muhafaza edilir ve kuru lamelleri kaplaması elde edilinceye kadar oda sıcaklığında saklayın.
- Ou Lay15 cm kültür çanak lamelleri t. Kaplama% 0.01 poli-L-Lisin (PLL), 0.7 ml ile her lamel ve oda sıcaklığında kaputu inkübe edin.
- 1 saat sonra, lamelleri steril su ile üç kez durulanır. 6 cm kültür kabına vakum ve yerde her lamel ile kuru lamelleri.
- Mikroakışkan bölmesini monte etmek için, Mikroyivlerin temas etmemek için tedbir ile PLL kaplanmış bir örtücü camın üzerine altındaki microgroove yüzü bölmenin. Yavaşça odası sıkıca kapatılmıştır sağlamak için bir pipet ile odasını basılı.
Chambers 3. Nöronal Kültür Diseksiyon ve Levha
- % 1 pen / strep, 10 mM HEPES, 2 ml tahlil tamponuna (HBSS, herhangi bir kalsiyum, magnezyum ihtiva eden herhangi bir 15 ml konik bir tüp içinde kesildi iki E17-E18 sıçan hipokampları (bir beyin) yerleştirin. Dokular, 5 ml ile 3 kere yıkayın diseksiyonu mümkün olduğunca diseksiyon tamponu çıkarın. her zaman tampon ve taze di 900 ulssection tamponu.
- , Doku sindirmek 1x çalışma konsantrasyonunu yapmak için diseksiyon tamponuna 10x tripsin (% 2.5) 100 ul ekleyin. Bir 37 ° C su banyosu içinde konik tüp yerleştirin. Sindirim 10 dakika sonra, 1 mg / ml civarında nihai bir konsantrasyona kadar, 10 mg / ml Dnaz I, 100 ul ilave edin.
- Bir yangın cilalanmış Pasteur cam pipet kullanarak, hafifçe aşağı ve yukarı pipetlenerek 5-10x dokuyu Karışım. Sağ toz haline getirildikten sonra, (% 10 FBS, 2 mM Glutamax,% 2 ile B27 Neuro temelli) ortam maddesi 2 ml tripsin söndürün.
- Dibe oturmaya dokuların birikintileri girmesi için 5 dakika için başlık örnek bırakın. Dikkatlice pelet hücreleri 5 dakika 200 x g'de, temiz, steril 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine 2ml'si çıkarın. 50 ul ortam kaplama pelletini
- Hemositometre ile hücreleri saymak. Yük mikroakışkan odasının bir bölmesine 15-20 ul hücre süspansiyonu (~ 40.000 hücre). Bölmenininkübatör 10 dakika hücreler lamel takmak için izin için. 10 dakika sonra, bölmenin her iki bölümü doldurmak için daha fazla kaplama ortamı eklenir.
- Diseksiyon ikinci gününde, tamamen bir hücre gövdesi ve akson bölmesinin her iki (2 mM glutamax,% 2 B27 ile Neurobasal) bakım medya ile kaplama ortamı değiştirin. Hipokampal nöronların aksonları, 3. gün Mikroyivlerin çapraz ve günün 5-7 arasındaki akson bölüme ulaşmak başlar. Bu süre boyunca, Bakım ortamının her 24 ~ 48 saat ile kültür ortamının yarısı değiştirin.
QD-BDNF 4. Akson Taşıma
- , QD-BDNF aksonal taşıma Canlı görüntülemeye mikroakışkan odasının hücre gövdesi ve akson hem bölmelerden BDNF tüketmek için önce iyice ile 2 saat boyunca, BDNF içermeyen serumsuz Neuro temelli ortam her 30 dakikada bir, her iki bölümü ile yıkayın.
- BDNF tükenmesi sırasında, QD-BDNF eşleniklerini hazırlamak. Mono-biyotinile BD 50 nM karıştırınNF Neurobasal ortam içinde, 50 nM QD655 streptavidin eşlenikleri ile, dimer ve 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Akson bölmesinde Ortamı çıkarın ve 37 ° C'de 4 saat boyunca 0.25 nM'lik nihai bir konsantrasyona sahip 300 ul QD-BDNF ekleyin. Hücre gövdesi bölmesine QD-BDNF difüzyon en aza indirmek için, her zaman akson bölmesine göre hücre gövdesi bölmesinde ortamın daha yüksek bir düzeyde tutmak için çok önemlidir. Canlı görüntüleme önce kuluçkadan sonra bağlanmamış QD-BDNF yıkayın.
- Bir 100X yağ objektif lens ile donatılmış ters bir mikroskop kullanılarak QD-BDNF taşıma canlı görüntüleme yürütmek. Kapsam ve sabit bir sıcaklıkta (37 ° C), CO2 (% 5), kendisine bağlı kazanı ısıtın. QD655 sinyalini görselleştirmek için Texas kırmızı uyarma / emisyon küpler bir dizi kullanın.
- Edinme ve CCD kamera kullanarak 2 dakika bir toplam 1 kare / sn hızında orta akson içindeki time-lapse görüntüleri yakalayabilir. Aksonlar ile kullanımı microgrooves That hiçbir QD ve dolayısıyla infiltrasyon için bir kontrol olarak sinyal yok.
- Herhangi bir görüntü analizi yazılımı veya NIH ImageJ kullanarak BDNF taşıma analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üretim ve biyolojik olarak aktif mono-biyotinlenmiş BDNF saflaştırılması
Bir AviTag dizisi (GGGLNDIFEAQKIEWHE) ile birleştirilir BDNF sentezleme vektörü, daha önce yayınlanan bir protokolün 10 ile tespit edildi. Tam uzunluklu füzyon proteininin moleküler kütlesi yaklaşık 32 kDa (olduğu kestirilmiştir http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) 18 kDa (Şekil 1A) tahmin edilen moleküler kütleye sahip Monobiotinylated olgun BDNF üretildi koşullanmış ortamdaki HEK293FT hücrelerinde ve saflaştırılmış 10 tarif edildiği gibi.
Farklı fraksiyonlar toplandı ve 15% SDS-PAGE üzerinde ayrıldı. Bir tavşan anti-takı antikoru AVI, 18 kDa'lık bir birinci fraksiyon (Şekil 1B) tespit edilmiştir ~ bir molekül ağırlığı olan bir bant kullanılması. Preparatın saflığı test etmek için, numuneler, SDS-PAGE üzerinde ayrılmış ve S ile boyanmıştırilver boyanması sergilerler. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, 18 kDa bandı Birinci akıtmada baskın tür olarak belirlenmiştir. Ve streptavidin-agaroz taneleri açılan deneyler mBtBDNF hazırlanması biyotinilasyonunun ölçüde değerlendirmek için gerçekleştirilmiştir. Ve streptavidin-agaroz taneleri ile aşağı çekme etkisi sonra, üstte yüzen madde içinde kalan proteinler, 7% trikloroasetik asit (TCA) ile çökeltilmiştir. Bu numuneler, SDS-PAGE ile analiz edildi ve lekeleri biyotinile proteinleri tespit etmek için toplam protein ya da HRP-streptavidin tespit etmek için ya anti-Avi antikorları (üstte) ile problandı. Sonuçlarımız bant süpernatan (Şekil 1D) tespit edilirken, tüm sinyaller boncuklar ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Biz böylece mBtBDNF bir verimlilik>% 99.9 biyotinillenen sonucuna varmak.
Bağlanması ve TrkB reseptörünü aktive edilmesinde mBtBDNF biyolojik aktivitesini test etmek için, bir işlenmiş 3T3 hücre rhBDNF (20 ng / ml) ile ya TrkB ifade hattı ya da tedavi purified mBtBDNF 10 dakika boyunca (20 ng / ml) eklenmiştir. Hiçbir tedavi Alınan hücreler de kontrol olarak toplanmıştır. Lizatlar bir 4-12% SDS-PAGE üzerinde ayrılmış ve bir tavşan anti-pTrkB antikoru fosforile TrkB problanması için kullanılmıştır. RhBDNF Benzer Şekil 1E, gösterildiği gibi, mBtBDNF benzer bir düzeyde TrkB fosforilasyonunu uyarabildi. Ayrıca rhBDNF (20 ng / ml) ya da 48 saat süre ile arıtılmış, mBtBDNF (20 ng / ml) ya da sıçan hippokampal nöronlar tedavi. Saflaştırılmış mBtBDNF rhBDNF (Şekil 1F) ölçüsünde hipokampal nörit büyümesinin uyarılması için başardı. TrkB reseptörü ile QD-BDNF birlikte-lokalizasyonunu incelemek için, QD-BDNF 37 ° C'de 4 saat süre ile hipokampal akson sıçan eklendi ° C'dir. Nöronlar sonra sabit ve trkB için boyama yapıldı. Şekil 1G 'de gösterildiği gibi, QD-BDNF TrkB birlikte lokalize. Biz böylece mBtBDNF biyolojik fonksiyonu tam olarak aktif olduğu sonucuna varıldı.
QD-BDNF i Akson Ulaştırma Canlı Görüntülemen Hipokampal Nöronlar
Temel embriyonik sıçan hipokampal nöronlar (E17-18) ayrılmıştır ve mikroakışkan odacığın hücre gövdesi bölmesine konuldu. Günde 4 veya 5 de, aksonlar akson bölmeye mikro oluklarda yayılmış. 7. günde, en aksonlar akson bölmeye büyüdü. 1 saat boyunca buz üzerinde: 1 oranında (BDNF dimeri QD:) QD-BDNF 1 de mBtBDNF ile streptavidin QD655 inkübe edilerek yapıldı. QD-BDNF (0.25 nM), daha sonra akson bölmeye ilave edilmiş ve 37 ° C'de önce görüntüleme (Şekil 2A) ile 4 saat süreyle inkübe edildi.
İnkübasyondan sonra, QD-BDNF, akson bölmesine aksonlarla spesifik olarak bağlanan bulunmuştur. Hücre gövdesi bölmesinde, QD sinyalleri proksimal akson ve QD-BDNF akson içselleştirildiğinden ve retrograd hücre gövdeleri nakledildi gösteren hücre organlarının çoğu toplanmış. Akson içinde QD-BDNF sinyallerinin zaman atlamalı bir görüntü serisi mikro oluklarda gerçekleştirilmiştir. QD sherhangi bir QD sinyalinin hücre gövdesi bölmeye (Şekil 2B) akson bölmeden QD sinyalin çok az veya hiç difüzyon gösteren akson, olarak eksik olan mikro oluklarda görülebilir ise ignals aksonlar mikro oluklarda çoğunda gözlenmiştir.
Şekil 2C'de, hipokampal nöronlar akson 80 mikron uzunlukta bir bölüm flüoresan 100 saniye kaydedildi. 6 QD-BDNF sinyallerinin Toplam açıkça video kaydı sırasında görüldü. Kaydedilen Üç QD sinyalleri hücre gövdesinden (sol taraf) doğru tek yönlü hareket. Beyaz ok ile işaretlenmiş QD olayı (t: 31 sn t: 101 sn) ~ 70 sn içinde tüm alanı geçerken hücre gövdesine sorunsuz taşındı. (T: 1 sn: t 61 sn) yeşil ok ile işaretlenmiş bir başka QD olay ilk retrograd taşındı. T: 21 sn, QD-BDNF 20 sn 10 için anterogradely taşındı ve ardından hücre gövdesi doğru tekrar yön değiştirdi. Sarı bir ok ile işaretlenmiş QD olayı (t: 1 sn t: 71 sn) da retrograd taşındı ely, ancak hareketi sırasında 20 sn ~ durakladı. Bu 100 sn boyunca hareket değildi QD-BDNFs sabit kabul edildi. Sadece hareketli nesneler daha sonra hareketli hız ve ortalama hızı hesaplamak için analiz ve zaman durduruldu.
QD-BDNF Ulaştırma kymograph Veri Analizi
Kymographs Metamorph yazılımı kullanarak kaydedilen her filmden oluşturuldu. QD-BDNF taşıma (Şekil 3A) temsil kymographs gösterildiği gibi, QD-BDNF hareketleri akson 80 mikron uzunluğunda segmentinde 120 saniye kaydedildi. Temsilcisi kymograph 1, QD-BDNF, çok kısa aralıklarla (Video S1 Destekleme) ile ~ 60 saniyede alan (80 mikron) geçti sol (hücre gövdesi) doğru hızlı ve sorunsuz taşındı. Temsilcisi kymograph 2, bir QD-BDNF seyahat ederken ~ 50 mikron retrograd sn, uzun duraklamalar en az üç kesimleri ile (oklarla gösterilen) 120 (Video S2 Destekleme).
içeriği "> Şekil 3B, hız ve ortalama hızı hareket saçılma grafiğidir ve her bir QD-BDNF süresi durduruldu. QD-BDNF hareket hızı ortalama ile 0.47-1.97 um / sn arasında değişen, göreceli olarak hızlı 1.06 ± 0.05 mm / sn. QD-BDNF ortalama hızı mesafe / zaman el gezici olarak hesaplandı. Ve BDNF, sevkiyat sırasında durduruldu çünkü, ortalama hız 0.48 ± 0.03 mm / sn ortalama ile hız hareket çok daha düşük oldu (değişen 0.17-1.59 mm / san) elde edilmiştir. duraklatma zamanı da BDNF hareketinin karakterize edildiği gibi analiz edildi. duraklar ortalama süresi 6-33 saniye arasında değişen 15.88 ± 1.30 saniye () (Tablo 1).
Aktif biyolojik 1. Arıtma, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) Şekil. (A) Şematik bir çizimi mBtBDNF üretimini göstermektedir. Ön ve proBDNFavi, BirA Yöntemin anlatılan iki 10 olarak onun pcDNA3.1myc-vektörüne klonlanmıştır. Ni-reçine elute olur (B) Farklı fraksiyonlar toplandı ve% 15 SDS-PAGE jeli üzerinde ayrıldı. Bir tavşan anti-takı antikoru Avi leke kullanılmıştır. ~ 18 kDa kadar bir görünür molekül ağırlığına sahip bir bant, olgun mBtBDNF proteini için tahmin edilen molekül kütlesi ile tutarlı elute fark etmiştir. (C) gümüş boyama jel 18 kDa mBtBDNF elüsyon fraksiyonu içinde baskın olan türlerdir olduğunu gösteriyor. (D) Saflaştırılmış mBtBDNF streptavidin-agaroz taneleri ile inkübe edilmiştir. Boncuklar yıkandı ve süpernatan SDS-PAGE analizi öncesinde TCA ile çöktürüldü ise SDS yükleme tamponu içinde kaynatılmıştır. Blot, ya anti-Avi antikoru ile ya da HRP-streptavidin ile problanmıştır. Saflaştınldı mBtBDNF veya rhBDNF (E) 20 ng / ml olarak işlenmiş 3T3 hücre hattı, e e eklendi10 dakika boyunca TrkB xpresses. Lizatlar hasat edildi ve bir 4-12% SDS-PAGE üzerinde ayrıldı. Kontrol hücre lizatı de analiz edildi. Blot, bir tavşan anti-pTrkB antikoru ile problanmıştır. Toplam TrkB, bir fare anti-TrkB antikoru ile ortaya çıkarılmıştır. Saflaştınldı mBtBDNF veya rhBDNF (F) 20 ng / ml, 48 saat süreyle sıçan hipokampal nöronlar ilave edildi. DIC görüntüleri nörit gelişimini analiz etmek için alınmıştır. (G) QD-BDNF, 4 saat (ölçek çubuğu 5 um) için sıçan hipokampal aksonları ile inkübe edilmiştir. Nöronlar sonra sabit ve trkB için boyama yapıldı.
. Şekil 2. akson QD-BDNF retrograd taşıma Tek molekül görüntüleme (A) Üst görünüm: hücre gövdesi bölmesinde kaplama primer nöronlar ile mikroakışkan odasının şematik bir çizimi. Aksonlar microg genelinde büyüdüakson bölmesine rooves. QD655 etiketli BDNF, akson bölmesine eklenmiştir. Yan görünüm: akson bölmesindeki medya seviyesi QD sinyalinin yayılmasını en aza indirmek için hücre gövdesi bölmesine daha düşük tutuldu. (B) Kırmızı floresan görüntüleri ve hücre gövdesi bölmesi, mikro oluklarda ve akson bölmesi DIC görüntüleri. QD-BDNF, aksonlar özellikle bağlı içselleştirilmiş ve retrograd akson boyunca hücre organlarına taşınır. Hiçbir QD sinyal akson absent mikro oluklarda gözlendi. (C) akson boyunca QD-BDNF taşıma Time-lapse video görüntü serisi. Hem hareketli ve sabit QD-BDNF sinyalleri filmlerin çoğunda mevcut idi. T 'de: 1 saniye, en az 4 QDS görülebilir. 10 saniye sonra, iki QDS (yeşil ve sarı oklar ile gösterilmektedir) (görüntünün sol) hücre gövdesine doğru hareket etmektedir. Bu iki QDS taşımak ve ilk çift görüntüleri duraklatmak ve sonunda (70 sn ~ at) sola görüntülerin dışına taşımak. Başka bir QD alana taşındıt: 31 sn (beyaz okla gösterilen) ve sola çok duraklar olmadan hızlı bir şekilde taşındı.
Şekil 3. QD-BDNF taşıma kymograph ve veri analizi. (A) Birincil hipokampal nöronlarda QD-BDNF taşıma Temsilcisi kymographs. Kymo 1, parlak QD sadece birkaç kısa duraklar ile oldukça hızlı bir hızda alan üzerinde taşındı. Kymo 2'de QDS hareket hızı daha yavaş olan ve hareketi daha sık ve daha uzun aralar ile kesildi. Hızı hareketli QD-BDNF (B) Dağılım arsa ve (kullanılan mesafe / zaman seyahat olarak hesaplanır) ortalama hızı zaman durakladı. QD-BDNF ortalama hareket hızı 0.47-1.97 mm / sn arasında değişen 1.06 ± 0.05 mm / sn (idi. QD-BDNF ortalama hızı 0'dan değişen ± 0.03 mm / sn (0,48 oldu. 17-1,59 mm / sn). Duraklar süresi ortalama (6-33 sn arası) 15.88 ± 1.30 sn idi.
Video S1 desteklenmesi . Temsili QD-BDNF taşıma Video 1. Çeşitli QD-BDNF çok az kısa duraklar sol tarafında (hücre gövdesi) doğru hızlı hareket.
Video S2 desteklenmesi . Temsili QD-BDNF taşıma Video 2. Çeşitli QD-BDNF sık ve uzun aralar sol tarafında (hücre gövdesi) doğru nispeten yavaş hareket.
| Asgari | Maksimum | Ortalama | 88px;. "> Std hata||
| Hızı Hareketli (mikron / sn) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| Ortalama hız (mikron / sn) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| Paused süresi (sn) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
QD-BDNF taşıma Tablo 1. Veri analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biyolojik olarak aktif bir üretmek için yeni tekniğin gelişimleri, BDNF aksonal taşınması takip etmek için kullanılabilir BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. Kuantum dot streptavidin konjüge proteini ve bir mikroakışkan odacığı kullanılarak, yöntem, bir gerçek zamanlı olarak ve uzamsal ve zamansal çözünürlüğe kadar tek molekül hassasiyet ile primer nöronlarda aksonal taşınması BDNF algılamasını sağlar. Burada kullanılan aletler sağlık ve hastalık nöronlar BDNF / TrkB sinyalizasyon endosomlarda aksonal transport aracılık moleküler makineleri incelemek için bir yol sağlar.
BDNF-GFP veya -mCherry in vitro çeşitli sinir hücresi kültürlerinde akson BDNF hareketini takip etmek için kullanılmaktadır. Bu reaktifler trkB otokrin aktivasyonunun incelenmesi için, muhtemelen, anterograde taşıma incelenmesi ve için tek bir seçenek sunuyoruz. Ancak, WHI retrograd taşıma eğitimi için, en çarpıcı önemli dezavantajları vardırch GFP veya MCherry tek molekül çalışmalar için yeterince parlak olmamasıdır. Önceki çalışmalar, NGF'nin fizyolojik konsantrasyonlarda altında tek NGF dimer 11 içerirler ve retrograd 8 taşınan olduğunu göstermiştir. Önemlisi, QD BDNF kullanımı da bir BDNF onun TrkB reseptörleri bağlayan hangi hücrealtı konumunu tanımlamak için izin verir. GFP veya MCherry etiketli proteinler olarak kullanımında, lizozomal sentezleme anterograd geçiren proteinler akson içinde mevcudiyetinde, ve de retrograd ulaşım gibi sonuçlanacaktır. Retrograd taşınan BDNF taşıma retrograd onun reseptörü önce karşılaşılan olsun ya da bulunmadığı ya da bu gibi, değerlendirmek zor olabilir. Gerçekten de, bir kurgu olarak BDNF-GFP veya BDNF-mCherry akson içinde geriye doğru aktarıma innervasyon hedef BDNF aşağıdaki bağlama farklı olabilir, aynı nöron üretilir.
Kimyasal çapraz bağlama, biyolojik olarak aktif, sinir büyüme faktörünü üretmek için kullanılmış olsa da(NGF), yer belirleme yöntemi üstündür. İlk olarak, tam biyotinilasyonunun ölçüde kontrol etmek zordur; Örneğin, her bir NGF 5-9 biyotin kısımları 8,9,12 ile etiketlenmiştir. İkincisi, çapraz proteini etkisiz hale getirebilir. NGF söz konusu olduğunda, çapraz bağlama karboksil grupları 13 eki gerektirmiştir. BDNF durumunda, etkinlik çoğu zaman biyotine kimyasal çapraz bağlama aşağıdaki kaybolur. Son olarak, çapraz bağlanma derecesi eksik olabilir. Yeni bir rapor gösterdi ki ~ 0.8 biyotin / BDNF molekül kimyasal çapraz üretildi; gibi ~ BDNF 20% 9 etiketli değildir. Etiketlenmemiş BDNF varlığı sonuçlarının yorumlanmasını karmaşık hale getirebilir.
Bizim teknik BDNF, moleküller bu şekilde biyotinile BDNF homojen hazırlanması oluşturan, aynı yerde tek bir biyotin ile etiketlenmiş olduğu özel avantajlar sunmaktadır. Kuantum noktaları gibi nanofluorescent parçacıklara konjüge tarafından, mBtBDNF olabilir,akson yanı sıra hücre gövdelerinde, dendrit: BDNF içselleştirilir yolları ve süreçleri, nöronların içindeki insan ticareti izlemek için kullanılır. Bu yöntem, BDNF için alternatif etiketleri mümkün kullanır. Nanopartiküllerin diğer türleri geliştirilmesi ek faydalar vaat ediyor.
Aksonal ticareti ve BDNF sinyal kusurlar nörodejeneratif hastalıklar suçlanmıştır. Güçlü kanıtlar Huntington hastalığı 14,15 kortikal-striatal atrofi BDNF kusurlu taşıma bağladı. Mutant proteinin Huntingtin Huntingtin ilişkili protein-1 (HAP1) ve sempatik nöronlar dinein motor arasındaki etkileşimi engelleyen BDNF taşınmasını inhibe eden ve nörotrofik destek ve nöronal toksisite 16-18 kaybına neden olur. BDNF izleme aksonal hareketinin Bizim teknikleri nörodejeneratif hastalıklarda aksonal fonksiyonu çalışmak için değerli bir araç olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz kendi teknik yardım için Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit teşekkür etmek istiyorum. Çalışma NIH hibe (PN2 EY016525) tarafından ve Down Sendromu Araştırma ve Tedavi Vakfı ve Larry L. Hillblom Vakfı fon tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
