无线电遥测系统，以监测大鼠脊髓横断和胚胎神经干细胞移植在心血管功能

Summary

我们提出了一个协议，使用无线电遥测系统，记录在T4脊髓横断大鼠心血管参数八个星期后胚胎脑干神经干细胞移植到病变部位。遥测是一种先进的技术来准确地评估在有意识的自由移动脊髓损伤大鼠的心血管功能。

Abstract

高胸或颈脊髓损伤（SCI），可导致心脑血管功能障碍。为了监测心血管参数，我们植入连接到一个无线发射到大鼠的经历了T4脊髓横断伴或不表达绿色荧光蛋白的胚胎脑干源性神经干细胞移植的股动脉导管。相对于其他方法，例如套管插入或尾套，遥测有利的是连续地监测血压和心脏速率在自由活动动物。它也能够长期的多个数据采集。在脊髓损伤大鼠，针对结直肠扩张奔放的状态，自主神经反射异常在基础的心血管数据被成功记录。此外，前和损伤后的心血管参数可在相同的大鼠进行比较，如果发射器是脊髓横断前注入。所描述的telemet的一个限制Ry的过程是，植入股动脉可影响血液供给到同侧后肢。

Introduction

脊髓损伤（SCI）在较高水平后心血管功能障碍发生。它表现在无序的血压和心脏率在休息，体位性低血压，运动性低血压及自主神经反射异常响应损伤水平以下的^1,2感官刺激特征是高血压和压力反射介导的心动过缓发作。这些症状干扰日常生活脊髓损伤患者。因此，为了建立有效的工具，用于在动物中与脊髓损伤和试验性治疗心血管变化的调查是很重要的。

研究在动物的心血管功能，一些技术已经被用于监测血压和心脏速率。中央心血管参数可以通过套管插入和遥测记录，而无创尾袖口可以用来测量外周的血压^3。相对于其他方法，远程13655具有的主要优势在于它允许连续记录中自由活动动物和长期监测心血管功能^4。在脊髓损伤的动物模型，实验刺激后的变化周血压可能并不大到足以被检测到。因此，合适的心脏监测技术应该被选择用于动物SCI患者。

在本研究中，无线电遥测系统导入后脊髓横断监测成年大鼠心血管功能。大鼠接受的同基因大鼠胚胎第14天（E14）脑干源性神经干细胞（BS-神经干细胞）移植物在病灶部位。大鼠损伤，无移植和天真，没有受伤大鼠作为对照。遥测的步骤包括发送器灭菌并注入（ 图1），记录基底心血管参数，结直肠扩张诱导的反应，并且发送器的清洗和存储。

Protocol

所有动物协议获得批准的机构动物照顾及使用委员会（IACUC）。实验动物照护及安全指引，美国国立卫生研究院严格遵循。动物外科手术得到充分的治疗减少疼痛和不适。

1，脊髓Curgery和细胞移植

1. 之前，所有的手术高压灭菌手术器械。用热珠灭菌器（精细的科学工具），以从不同的动物之间的程序删除工具病原体和微生物污染物。在手术过程中使用无菌手术手套，长袍，和窗帘。采用无菌手术技术为每个外科手术。
2. 麻醉雌性费希尔344大鼠氯胺酮（25毫克/毫升），甲苯噻嗪（1.3毫克/毫升），以及乙酰丙嗪（0.25毫克/毫升）的一个组合（2毫升/千克）经腹膜内注射（IP）给药。
3. 剃须后区和优碘和乙醇反复擦拭皮肤。
4. 使用＃10刀片切开皮肤并直言不讳地剖析肌肉层。用手术刀分离椎骨，露出T3椎体，并用细尖咬骨钳进行椎板切除术背。
5. 切开硬脑膜纵向和使用虹膜切除术剪刀和microaspiration的组合来创建脊髓树桩之间的约1mm rostrocaudal间隙在T4水平横切脊髓。
6. 等待大约1 - 2分钟，直到出血停止完全，然后缝合肌肉3-0 Vycril，关闭伤口剪辑皮肤。
7. 注入乳酸林格氏液（5毫升）中，叔丁啡（0.035毫克/千克），和氨苄青霉素（33毫克/千克）经皮下立即手术后和维持大鼠在温暖的培养箱中，直到清醒。
8. 注入林格氏液和氨苄青霉素溶液每日达10天一次，和丁丙诺啡每日3天或直到疼痛和痛苦的迹象消失两次。不要一个动物返回其他动物，直到f的公司ully恢复。
9. 每天大约两个星期手动排空膀胱两次，直到建立反射性膀胱排空，然后在必要时排空膀胱，每天一次整个生存。
10. 两周后，如上述那样重新麻醉SCI大鼠并重新露出脊髓病灶部位。保持关闭，以保持植入细胞在病变部位的硬脑膜。
11. 注入10微升的细胞溶液（3.5×10 ⁵微升），从E14，无处不在的绿色荧光蛋白转基因大鼠胚胎收集和嵌入在纤维蛋白原和凝血酶^5,6，进入病灶腔的震中和病变多注射头端和尾端接口位点，用拉玻璃微量移为40微米的内径，连接到Hamilton注射器。
12. 缝合肌肉层，关闭伤口剪辑皮肤。
13. 1.8 - 按照步骤1.6中所述进行手术后注射和膀胱护理。
14. 一个星期前灌注，在脊髓⁷注入0.5％荧光金（FG，0.4毫升蒸馏水）腹膜内给逆行标签交感神经节前神经元。

2，发射器植入术

1. 浸泡transmittersin 2％戊二醛溶液（4毫升50％的戊二醛的96毫升蒸馏水的水）为至少1 - 2小时（最多10小时），在室温下进行灭菌。
2. 用无菌的0.9％生理盐水彻底冲洗发射机3次，并将它们存储在盐水中，直到使用（不超过1小时）。
3. E14细胞移植（10周后受伤）八周后，reanesthetize是经历了脊髓损伤有或无细胞移植和天真的对照组老鼠。
4. 剃腹部和后肢。请用聚维酮碘皮肤。将大鼠上手术台取仰卧位。
5. 切开上使用＃15刀片右侧腹腹部和大腿内侧的皮肤上。
6. 通过S切ubcutaneous结缔组织，露出用小剪刀股血管和神经束。
7. 分开的静脉和神经用细镊子尖端弯曲股动脉。
8. 把三丝缝合动脉的下方，并在各缝合一松结。
9. 申请0.1毫升利多卡因（2％）的动脉表面，以引起血管舒张用于随后导尿。
10. 近端通过拉伸一个松散的丝线缝合固定远端血管具有永久丝结和临时块。
11. 使用20号弯针的穿刺动脉，插入使用导管插入工具的遥测导管（8厘米长）的一角。
12. 插入导管吻侧最多到4厘米，从而将前端在胸主动脉。
13. 通过捆扎的股动脉周围三丝缝线锚定在血管内的导管。
14. 使皮下口袋沿着肋骨和T的尾部边缘之间的侧翼他的膝盖的范围最颅延用钝的剪刀。
15. 插入发射机体装入口袋并缝合到周围的发射机，以避免过度的运动的结缔组织。
16. 缝合用6号丝线皮肤。
17. 注入乳酸林格氏液（5毫升）中，叔丁啡（0.035毫克/千克），和氨苄青霉素（33毫克/千克）经皮下立即手术后和维持大鼠在温暖的培养箱中，直到清醒。

3，基础平均动脉压（MAP）和心率（HR）拍摄

1. 由于早一天以下变送器植入，把一个单一的动物在接收器垫，打开发射器。等待大约10 - 15分钟至，观察者的动物和稳定的心血管参数。
2. 记录静息血压和心率，这是来自于脉冲动脉压与计算机数据采集系统至少1小时。收集的数据每5秒。
3. 监测的imals的可见痉挛的发生过程中连续，并删除数据点。每只动物的平均数据点，得到平均值。

4，结直肠扩张引起的自主神经反射异常

1. 抑制NSC接枝或脊髓损伤对照组大鼠在里面的食物颗粒发射机接收机提供的毛巾。通常只可以留在合作过程中。
2. 插入乳胶气球尖导管插入直肠大约2厘米，它固定到尾部用胶带^8。
3. 打开发射器，等待10 - 15分钟，使血压恢复到preinsertion基线。
4. 诱发结直肠扩张由充气气球慢慢在10秒内用1.4毫升空气1分钟，以产生大约30毫米汞柱的压力。
5. 记录血压和心率1分钟前，中1分钟，结直肠扩张后1分钟;样本数据的3分钟过程中，每3秒。
6. 执行2 - 每只动物3项试验有两个审判之间至少有15分钟的恢复时间。
7. 过量的动物（IP）以上，如果没有进一步的评估描述双倍剂量的麻醉组合。动物灌注生理盐水后4％多聚甲醛。
8. 对于每一个动物，之前分别在结直肠扩张平均的值;计算的基准，并为每个审判腹胀引起的血压和心率的变化之间的差异;平均在2 - 3的试验，以获得平均值。

5，发射器清洗

1. 麻醉后但灌注前请清除动物体内发射器。在充满蒸馏水清洗，直到烧杯中浸泡，立即;避免的遥测设备的干燥。
2. 的遥测传输到1％的Terg-A-ZYME酶清洗溶液（10g / L的水）中24小时，在室温下进行。
3. 葱发射机导管的前端有一个钝的30号针连接到葱注射器。
4. 使用折叠软组织仔细擦干发射机，并将其存储在原始塑料托盘。

Representative Results

使用上述的遥测技术，我们成功地记录在脊髓损伤的动物的心血管参数。在动物脊髓损伤独自一人，地图是人力资源，而相比增加了天真的动物，与以前的报告⁹一致显著减少。在动物BS-NSC嫁接，MAP和HR走近天真的动物测量水平（ 图2）。在结直肠扩张，一只老鼠被视为dysreflexic如果伤害性刺激所产生的上升在MAP和人力资源^3,8的下降。阵发性高血压和压力感受器介导的心动过缓者不可避免地引发了所有的动物，但两组之间的差异程度。在动物中接枝有BS-神经干细胞MAP增加是低得多（16.9±3.1毫米汞柱，n = 3时）比动物用单独损伤（64.1±1.6毫米汞柱，N = 3）（ 图3）。然而，在结直肠扩张减少在人力资源没有显著组间差异第心动过缓是由压力反射机制介导，这种差异可能是由于压力感受器的SCI ¹⁰后的敏感性降低。在结直肠扩张的最大鼠发生痉挛而不管治疗。

经组织学分析，免疫标记显示优异的移植物的存活植入BS-神经干细胞脊髓，但没有嫁接在受伤的对照组动物脊髓的差距。胎儿神经干细胞完全充满了病变部位和只观察到很小的空腔。植入整合到宿主灰质和白质两个吻侧和尾侧。 BS-NSC植入物内均发现了大量TH ⁺儿茶酚胺和5 -羟色胺⁺羟色胺能神经元和轴突众多地形支配骶交感节前神经元在长距离（ 图4）的中间外侧细胞柱。与此相反，在受伤的动物没有接枝，TH ⁺ / 5-HT ⁺ F在病变下面胸腰脊髓未检出IBERS（未示出）。

图1：图中显示了股动脉插管的股动脉（答）从神经（北）和静脉（五）解剖，然后用弯曲的针头刺破。连接到发射器的导管插入动脉，将导管尖端在胸主动脉心血管记录（〜4公分）的电平。

图2：基础血压和心率恢复脊髓损伤大鼠移植与BS-神经干细胞在有代表性的世代（N = 3 /组），遥测记录表明显著降低基础MAP和大鼠脊髓损伤较高的人力资源和未治疗10凌晨。伤后KS（* P <0.05）。与此相反，这两个心血管参数恢复到幼稚大鼠8周后，BS-NSC移植的水平（10周后的损伤）（p均 > 0.05; ANOVA，然后用Fisher的事后）。

图3：结直肠扩张（CRD）引起的植物神经dysreflexic在1分钟的CRD在这两个SCI和BS-NSC移植动物的自主神经反射异常被触发，表现为阵发性高血压伴有心动过缓。 （a）在受伤的对照组大鼠，通过在结肠扩张约60毫米汞柱地图增加。 （B）但是，MAP的增加，强烈降低到10 - 20毫米汞柱的接枝有BS-神经干细胞的老鼠。

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图4：嫁接BS-神经干细胞整合到宿主成人脊髓和分化成儿茶酚胺和血清素神经元（A）八周BS-NSC移植后，绿色荧光蛋白和GFAP双重免疫标记表明充填病灶部位植入绿色荧光蛋白标记的细胞。纵向脊髓节。 （二 ）相比之下，差距存在于脊髓横断没有移植。 （C，D）免疫标记的酪氨酸羟化酶（TH）和五羟色胺（5-HT）揭示了许多TH和内移植物的5-HT阳性神经元。 （E，F）接枝衍生TH ⁺和5 -羟色胺⁺轴突延伸和支配的中间外侧细胞柱标有荧光金尾交感神经节前神经元。比例尺为1mm（B），25微米（D）和50微米（F）。

Discussion

传统上，流体填充的套管插入动脉并连接到压力换能器来记录心血管参数在每个动物¹¹的终端快照。连续监测心血管性能很长一段时间，无线电遥测系统被应用在许多实验室。这更精致的工具可以记录在有意识的血压，自由活动动物。相较于充满液体的导管，遥测被认为是一种更先进的技术来准确地评估心血管功能的脊髓损伤动物。虽然在本研究中的发射机被记录之前植入仅1天，它可前或SCI为多个数据采集根据实验要求¹²后植入。对基础血压和心率，或者中枢或外周的记录就可以实现。然而，为了结直肠扩张心血管响应不能被在无创尾套系法检测我们的经验。最近的遥测分析，验证性低血压及心动过速的长期持续性后，大鼠^9,13完整的高胸段脊髓横断。较低的基础地图和较高的人力资源在我们的SCI对照组大鼠与使用相同的记录技术，以前的报告是一致的。大肠癌引起的自主神经反射异常明显减轻在接受细胞移植的影响。基于我们在多个节段的组织学证据，儿茶酚胺和血清素投入的SPN可能占的生理改善。

变送器导管是成功的植入和记录的关键。在脊髓横断大鼠股动脉的直径比通常更小，由于缺乏马达和后肢的感觉功能。完全瘫痪通常会导致肌肉萎缩。外科医生可能会发现在导管的尖端，以大于动脉。在这种情况下，应用2％利多卡因的动脉引发的血管舒张的表面允许导管的尖端可容易地插入穿刺血管。值得注意的是，利多卡因诱导血管舒张持续约4 - 5分钟。因此，容器的穿刺和插管应迅速地进行成为可能。在数据采集的基础参数的时期，我们所收集的数据点，每5秒1小时。在3分钟结直肠扩张诱导的记录，但是，数据被采样，每3秒，以获得更多的数据点为整个短时间内更准确的平均值。

将导管插入股动脉植入可能会干扰血液供应的后肢和诱导组织坏死，特别是当远端动脉缝合。密封导管插入点插入动脉小降组织胶代替丝线缝合至少可以部分地恢复血流。因此，动物会更健康的长期监测。备选地，发射器的导管可直接注入到腹主动脉放置发射机体进入腹腔。这种方法避免了组织腐烂在同侧后肢但具有影响胃肠功能的危险。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension