Summary
Nous présentons un protocole d'utilisation d'un système de radio-télémétrie pour enregistrer des paramètres cardio-vasculaires dans la moelle épinière des rats T4 sectionnés huit semaines après le tronc cérébral embryonnaire cellule souche neurale de greffage dans le site de lésion. La télémétrie est une technique de pointe pour évaluer avec précision la fonction cardiovasculaire en déplaçant librement la moelle épinière des rats conscients blessés.
Abstract
Haut lésion de la moelle épinière thoracique ou cervicale (SCI) peut conduire à un dysfonctionnement cardio-vasculaire. Pour contrôler les paramètres cardiovasculaires, nous avons implanté un cathéter relié à un émetteur radio dans l'artère fémorale de rats ayant subi une transection de la moelle épinière T4 avec ou sans greffe de cellules souches neurales du tronc cérébral dérivées d'embryons exprimant la protéine fluorescente verte. Comparé à d'autres méthodes telles que l'insertion de la canule ou queue-manchette, la télémétrie est avantageux de surveiller en permanence la pression artérielle et la fréquence cardiaque chez les animaux se déplacent librement. Il est également capable de multiples acquisitions de données à long terme. Dans la moelle épinière des rats blessés, les données de base sous cardiovasculaires état libre et hyperréflexie autonome en réponse à la distension du côlon ont été enregistrées avec succès. En outre, les paramètres cardiovasculaires avant et après la SCI peuvent être comparées dans le même rat si un émetteur est implantée avant une transection de la moelle épinière. Une des limites de la Telemet décritprocédure d'implantation qui est re dans l'artère fémorale peut influencer l'irrigation sanguine de la patte postérieure ipsilatérale.
Introduction
Dysfonctionnement cardiovasculaire survient après une blessure de la moelle épinière (SCI) à des niveaux élevés. Elle se manifeste dans désordonnée pression artérielle et la fréquence cardiaque au repos, hypotension orthostatique, hypotension induite par l'exercice, et hyperréflexie autonome caractérisé par des épisodes d'hypertension et bradycardie baroréflexe médiation en réponse à des stimuli sensoriels dessous du niveau de blessure 1,2. Ces symptômes interfèrent avec la vie quotidienne de la moelle épinière lésée patients. Ainsi, il est important d'établir des outils efficaces pour l'étude des changements cardio-vasculaires chez les animaux atteints de LM et les traitements expérimentaux.
Pour étudier la fonction cardiovasculaire chez les animaux, plusieurs techniques ont été utilisées pour contrôler la pression artérielle et du rythme cardiaque. Paramètres cardiovasculaires centrales peuvent être enregistrées par l'insertion de la canule et la télémétrie, tandis que la queue-poignets non invasifs peuvent être utilisés pour mesurer la pression du sang périphérique 3. Comparé à d'autres méthodes, télémétrie a le principal avantage qu'il permet d'enregistrer en continu les animaux se déplacent librement et suivi à long terme de la fonction cardiovasculaire 4. Dans les modèles animaux SCI, les changements dans la pression sanguine périphérique après stimulation expérimentale peuvent ne pas être assez grand pour être détecté. Par conséquent, la technique de monitorage cardiaque approprié doit être choisi pour les animaux avec la SCI.
Dans la présente étude, un système de radio-télémétrique a été introduit de surveiller la fonction cardio-vasculaire chez les rats adultes après complète sectionnement de la moelle épinière. Les rats ont reçu des greffes de rat syngénique jour embryonnaire 14 (E14) des cellules souches neurales dérivées du tronc cérébral (BS-CNS) dans le site de la lésion. Les rats ayant une lésion et aucune transplantation et, rats naïfs indemnes ont servi de témoins. Le mode opératoire de l'émetteur de télémesure comprend la stérilisation et l'implantation (figure 1), l'enregistrement de paramètre cardio-vasculaire basale, les réponses induites par distension colorectale-, et le nettoyage de l'émetteur etstockage.
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Protocol
Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel (IACUC). Directives du NIH pour laboratoire soins et la sécurité des animaux sont strictement suivies. Les animaux atteints de procédures chirurgicales ont été adéquatement traitées pour minimiser la douleur et l'inconfort.
1. moelle épinière Curgery et cellulaire greffage
- Instruments chirurgicaux autoclave avant toutes les chirurgies. Utilisez Hot Stérilisateurs à billes (Fine Outils scientifiques) pour éliminer les agents pathogènes et les contaminants microbiens des instruments entre les procédures sur différents animaux. Utiliser des gants stériles chirurgicaux, robe et des stores pendant la chirurgie. Employer la technique chirurgicale aseptique pour chaque intervention chirurgicale.
- Anesthésier des rats Fischer 344 femelles avec une combinaison (2 ml / kg) de la kétamine (25 mg / ml), de xylazine (1,3 mg / ml), et d'acépromazine (0,25 mg / ml) administrée par injection intrapéritonéale (IP).
- Rasez la zone arrière et nettoyer la peau à plusieurs reprises avec la Bétadine et l'éthanol.
- Couper la peau à l'aide d'une lame # 10 et carrément disséquer les muscles couches. Utiliser un scalpel pour isoler les vertèbres, exposer la vertèbre T3, et d'effectuer une laminectomie dorsale à l'aide d'un rongeur à pointe fine.
- Inciser la dure-mère et transect longitudinalement la moelle épinière au niveau de T4 en utilisant une combinaison de ciseaux iridectomie microaspiration et à créer un écart rostrocaudal environ 1 mm entre les souches de la moelle épinière.
- Attendez environ 1 - 2 min jusqu'à ce que le saignement tout s'arrête, puis les muscles de suture avec 3-0 Vycril et fermer la peau avec des agrafes.
- Injecter lactate de Ringer (5 ml), la buprénorphine (0,035 mg / kg), et l'ampicilline (33 mg / kg) par voie sous cutanée immédiatement après la chirurgie et de maintenir des rats dans un incubateur chaud jusqu'au réveil.
- Injecter la solution ampicilline une fois par jour jusqu'à 10 jours, et la buprénorphine deux fois par jour pendant 3 jours ou jusqu'à ce que des signes de douleur et de détresse disparaissent Ringer et. Ne retournez pas un animal de compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que fully récupéré.
- Vider manuellement la vessie deux fois par jour pendant environ deux semaines jusqu'à ce que la mise en place de la vessie réflexe de vidange, puis vider la vessie une fois par jour tout au long de la survie si nécessaire.
- Deux semaines plus tard, les rats nouveau-anesthésier SCI tel que décrit ci-dessus et re-exposer le site de la lésion de la moelle épinière. Gardez la dure fermé pour conserver les cellules implantées sur le site de la lésion.
- Injecter 10 ul de solution de cellules (3,5 x 10 5 pi), collectées à partir de E14 GFP ubiquitaire embryons transgéniques de rat et incorporé dans le fibrinogène et la thrombine de 5,6, dans l'épicentre de la cavité de lésion et l'interface rostrale et caudale de la lésion par injection multiple des sites, en utilisant une micropipette de verre tiré avec un diamètre intérieur de 40 um, relié à une seringue Hamilton.
- Suturer les couches musculaires et fermer la peau avec des pinces plaies.
- Effectuer injection après la chirurgie et les soins de la vessie comme décrit dans les étapes 01.06 à 01.08.
- Une semaine êtreavant la perfusion, injecter 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml dans de l'eau distillée) par voie intrapéritonéale à l'étiquette rétrograde des neurones sympathiques préganglionnaires dans la moelle épinière 7.
2 Transmetteur Implantation
- Faire tremper transmittersin solution de glutaraldéhyde à 2% (4 ml de glutaraldéhyde à 50% dans 96 ml d'eau distillée) pendant au moins 1-2 heures (jusqu'à 10 heures) à température ambiante pendant la stérilisation.
- Laver abondamment à l'émetteurs stérile saline à 0,9% 3 fois et de les stocker dans une solution saline jusqu'à utilisation (pas plus de 1 h).
- Huit semaines après la transplantation de cellules E14 (après des blessures de 10 semaines), reanesthetize les rats qui ont subi une SCI avec ou sans greffe de cellule et les rats témoins naïfs.
- Rasez la zone abdominale et des membres postérieurs. Nettoyer la peau à la Bétadine. Placez le rat sur la table d'opération en position couchée.
- Inciser la peau de la cuisse et l'abdomen ventral interne sur le côté droit à l'aide d'une lame n ° 15.
- Couper à travers les stissus conjonctifs ubcutaneous d'exposer l'ensemble des vaisseaux fémoraux et le nerf en utilisant une petite paire de ciseaux.
- Séparer l'artère fémorale de la veine et le nerf en utilisant une pince fine à bout recourbé.
- Mettez trois sutures de soie sous l'artère et faire un noeud lâche dans chaque suture.
- Appliquer 0,1 ml de lidocaïne (2%) de la surface de l'artère pour provoquer une vasodilatation pour le cathétérisme ultérieur.
- Fixez le navire distale avec un noeud de soie permanent et temporaire bloc proximale par étirage d'un fil de suture de soie lâche.
- La perforation de l'artère à l'aide d'une aiguille courbe de calibre 20 et insérer l'extrémité du cathéter à télémètre (8 cm de longueur) en utilisant un outil d'insertion du cathéter.
- Insérer le cathéter rostralement jusqu'à 4 cm plaçant ainsi la pointe dans l'aorte thoracique.
- Ancrer le cathéter dans le vaisseau en l'attachant trois sutures en soie autour de l'artère fémorale.
- Faire une poche sous-cutanée sur le flanc entre le bord extrême de la cage thoracique et til extension la plus crânienne de la gamme de genou avec une paire de ciseaux émoussés.
- Insérez le corps de l'émetteur dans la poche et à la suture de tissu conjonctif entoure l'émetteur afin d'éviter tout mouvement excessif.
- Suturer la peau avec n ° 6 du fil de soie.
- Injecter lactate de Ringer (5 ml), la buprénorphine (0,035 mg / kg), et l'ampicilline (33 mg / kg) par voie sous cutanée immédiatement après la chirurgie et de maintenir des rats dans un incubateur chaud jusqu'au réveil.
3. basale Pression artérielle moyenne (PAM) et de la fréquence cardiaque (HR) Enregistrement
- Dès le lendemain de l'émetteur implantation, mettre un seul animal sur le clavier du récepteur et mettez l'émetteur. Attendez environ 10 - 15 min d'habituer l'animal et de stabiliser les paramètres cardiovasculaires.
- Fiche repos TAM et la FC, qui sont dérivés de la pression pouls artériel avec un système d'acquisition de données informatisées pendant au moins 1 h. Recueillir des données toutes les 5 sec.
- Surveiller la uneimals continu et supprimer des points de données lors de l'accident de spasmes visibles. Pour chaque animal, la moyenne des points de données pour obtenir des valeurs moyennes.
4. colorectal distension induite Dysréflexie autonome
- Retenez rats NSC-greffés ou contrôle SCI dans une serviette fournie avec des boulettes de nourriture à l'intérieur du récepteur de l'émetteur. Habituellement les rats peuvent rester coopération lors de la procédure.
- Insérez un ballon-cathéter à de latex dans le rectum pendant environ 2 cm et fixez-le à la queue avec du ruban 8.
- Mettez l'émetteur sous tension et attendez pendant 10 - 15 min permettant à la pression de retour du sang vers préinsertion base.
- Provoquer distension colorectale par l'inflation du ballon lentement en 10 sec avec 1,4 ml d'air pendant 1 min, à générer une pression d'environ 30 mmHg.
- CARTE d'enregistrement et HR 1 min avant, 1 min pendant 1 min et après distension colorectale; données de l'échantillon tous les 3 sec au cours de la procédure 3 min.
- Effectuer 2 - 3 essais par animal avec au moins 15 minutes d'intervalle de récupération entre les deux essais.
- Animaux Surdosage (ip) avec double combinaison d'anesthésie de dose décrite ci-dessus, si aucune autre évaluation. Perfuser les animaux avec une solution saline suivie par 4% de paraformaldéhyde.
- Pour chaque animal, la moyenne des valeurs avant et pendant distension colorectale respectivement; calculer la différence entre le début et la PAM et RH changements induits par la distension-pour chaque essai; moyenne sur les 2 - 3 essais pour obtenir des valeurs moyennes.
5. émetteur nettoyage
- Retirer l'émetteur à partir du corps de l'animal après l'anesthésie mais avant la perfusion. Faire tremper immédiatement dans un bécher rempli d'eau distillée jusqu'à ce que le nettoyage; éviter le séchage du dispositif télémétrique.
- Transférer le télémètre à la solution de nettoyage enzymatique Terg-A-Zyme 1% (10 g / L d'eau) pendant 24 heures à température ambiante.
- Regel la pointe de l'émetteur cathéter avec une aiguille de calibre 30 émoussérelié à la seringue de regel.
- Séchez soigneusement l'émetteur à l'aide d'un chiffon doux plié et le stocker dans le bac de plastique d'origine.
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Representative Results
En utilisant la technique de télémétrie décrit ci-dessus, nous avons enregistré avec succès les paramètres cardiovasculaires dans la moelle épinière des animaux blessés. Chez les animaux avec SCI seul, MAP a été réduite de manière significative tandis que RH a augmenté par rapport à des animaux naïfs, en conformité avec les rapports précédents 9. Chez les animaux avec BS-NSC greffage, TAM et la FC approché les niveaux mesurés dans les animaux naïfs (Figure 2). Au cours de la distension colo-rectal, un rat a été considérée comme dysreflexic si la stimulation nociceptive a produit une augmentation de la MAP et une diminution de 3,8 HR. Hypertension épisodique et bradycardie de baroréflexes médiation ont été inévitablement déclenché chez tous les animaux, mais la mesure diffèrent entre les groupes. augmentation de MAP chez les animaux greffés avec BS-CSN était beaucoup plus faible (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3) que les animaux présentant une lésion seul (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (Figure 3). Cependant, la diminution de la FC au cours distension colorectale ne différait pas significativement entre le groupes. Bradycardie est médiée par des mécanismes du baroréflexe, cet écart peut être dû à une sensibilité réduite de barorécepteurs après SCI 10. Spasme s'est produite au cours de la distension colo-rectal dans la plupart des rats quel que soit le traitement.
Lors de l'analyse histologique, immuno-marquage indiqué excellente survie du greffon dans la moelle épinière implantés avec BS-CNS mais une lacune dans la moelle épinière des animaux de contrôle blessés sans greffe. CNS fœtales complètement remplis le site de la lésion et que des cavités mineurs ont été observés. Implants intégrés dans le gris de l'hôte et la substance blanche à la fois rostralement et caudale. Un grand nombre de neurones TH + catécholaminergiques et 5-HT + sérotoninergiques ont été trouvés dans les implants BS-NSC, et de nombreux axones des neurones préganglionnaires topographiquement innervé caudale sympathiques dans la colonne de la cellule intermédiolatérale sur de longues distances (figure 4). En revanche, chez les animaux lésés sans greffage, TH + / 5-HT + fIBERS n'ont pas été détectés dans thoraco-lombaire de la moelle épinière au-dessous de la lésion (non représentées).
Figure 1:. Schéma montrant cathétérisme de l'artère fémorale L'artère fémorale (A.) est disséqué du nerf (N.) et la veine (V.), puis percé avec une aiguille courbe. Le cathéter relié à l'émetteur est inséré dans l'artère, en plaçant la pointe de cathéter au niveau de l'aorte thoracique pour l'enregistrement cardiovasculaire (~ 4 cm).
Figure 2: CARTE basale et RH récupérer chez les rats de la moelle blessés de la colonne vertébrale greffés avec BS-CNS Dans une cohorte représentative (n = 3 / groupe), l'enregistrement de télémétrie indique CARTE basale significativement plus faible et HR supérieur chez les rats avec SCI et aucun traitement 10 wee. ks après une blessure (* p <0,05). En revanche, les paramètres cardiovasculaires récupérer au niveau de rats naïfs 8 semaines après la greffe BS-NSC (10 semaines après la lésion) (tous deux p> 0,05; ANOVA suivie de post hoc de Fisher).
Figure 3: distension colorectale (CRD) induite par dysreflexic autonome dysréflexie autonome est déclenchée lors d'une CRD 1 min chez les animaux greffés médullaires et BS-CSN, qui se manifeste hypertension épisodique accompagnée de bradycardie.. (A) Dans un rat témoin blessé, PAM augmente d'environ 60 mmHg pendant la distension colique. (B) Toutefois, l'augmentation de la PAM est fortement réduite à 10 - 20 mmHg chez un rat greffé avec BS-CSN.
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Figure 4: Greffé BS-CSN à s'intégrer dans l'adulte hôte moelle épinière et se différencient en neurones catécholaminergiques et sérotoninergiques (A) Huit semaines après BS-NSC greffage, GFP et double immunomarquage GFAP démontre remplissage du site de la lésion avec des cellules GFP étiqueté implantés dans. une section longitudinale de la moelle épinière. (B) En revanche, il existe un écart dans une moelle épinière sectionnée sans greffage. (C, D) Immunomarquage de la tyrosine hydroxylase (TH) et la sérotonine (5-HT) révèle beaucoup TH et 5-HT neurones positifs au sein de la greffe. (E, F) du greffon dérivé TH + et 5-HT + axones s'étendent et innervent les neurones pré-ganglionnaires sympathiques caudale marqués avec FluoroGold dans la colonne de cellule intermédiolatérale. Barres d'échelle: 1 mm (B), 25 um (D) et 50 pm (F).
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Discussion
Traditionnellement, une canule remplie de fluide est inséré dans l'artère et relié à un transducteur de pression pour enregistrer les paramètres cardiovasculaires comme un instantané terminal dans chaque animal 11. Pour surveiller en continu les performances cardio-vasculaire pendant une longue période, les systèmes de radio-télémétrie sont utilisées dans de nombreux laboratoires. Cet outil plus raffinée peut enregistrer la pression artérielle en conscient, les animaux se déplaçant librement. Par rapport aux cathéters remplis de fluide, la télémétrie est considérée comme une technique plus avancée d'évaluer avec précision la fonction cardiovasculaire chez les animaux SCI. Bien que dans la présente étude a été implanté un émetteur seulement 1 jour avant l'enregistrement, il peut être implanté avant ou après la SCI pour l'acquisition de données multiples en fonction des conditions expérimentales 12. Pour la pression artérielle de base et HR, soit l'enregistrement central ou périphérique peut être obtenue. Cependant, la réponse à la distension colorectale cardiovasculaire ne peut pas être détectée par méthode non invasive basée sur la queue à ballonnetnotre expérience. Analyse télémétrique récente vérifié la persistance à long terme de l'hypotension et la tachycardie après complète thoracique sectionnement de la moelle épinière élevée chez le rat 9,13. Le MAP basal et HR plus élevé dans nos rats témoins SCI sont compatibles avec le rapport précédent en utilisant même technique d'enregistrement. Induite colorectal dysréflexie autonome a été atténuée chez les rats qui ont reçu une greffe cellulaire. Sur la base de nos données probantes histologique, catécholaminergiques et sérotoninergiques entrées à SPN pour de nombreux segments de la colonne vertébrale peut expliquer les améliorations physiologiques.
Transmetteur cathétérisme est essentiel pour une implantation réussie et l'enregistrement. Dans la moelle épinière des rats sectionnés, le diamètre de l'artère fémorale est inférieure à la normale en raison de l'absence de fonctions motrices et sensorielles des membres postérieurs. Paralysie complète se traduit généralement par une atrophie musculaire. Les chirurgiens peuvent trouver la pointe du cathéter d'être plus grand que l'artère. Dans ce cas, l'application de 2% de lidocaïne sur l'surface de l'artère provoquant une vasodilatation permet la pointe du cathéter pour être facilement inséré dans les vaisseaux crevés. Notamment, la lidocaïne induit-vasodilatation persiste environ 4 - 5 min. Ainsi, à la perforation de la cuve et le cathétérisme doivent être effectuées aussi rapidement que possible. Dans la période d'acquisition de données de paramètres de base, nous avons recueilli les points de données toutes les 5 secondes pendant 1 heure. Au cours de l'enregistrement colorectal induite par distension-3 min, toutefois, les données ont été échantillonnées toutes les 3 secondes afin d'obtenir plus de points de données pour une moyenne plus précis tout au long de cette courte période.
L'implantation d'un cathéter dans l'artère fémorale peut interférer avec l'alimentation en sang de la patte arrière et induire une nécrose des tissus, en particulier si l'artère distale est suturée. Le point d'étanchéité dans l'artère d'insertion de cathéter avec une petite goutte de colle tissulaire à la place d'une suture de soie peut au moins partiellement restaurer le flux sanguin. Ainsi, les animaux seraient en meilleure santé pour le suivi à long terme.En variante, le cathéter de l'émetteur peut être directement implanté dans l'aorte abdominale de placer le corps du transmetteur dans la cavité abdominale. Cette méthode évite la décomposition des tissus dans le membre postérieur ipsilatéral mais elle comporte un risque d'influer sur la fonction gastro-intestinale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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