Summary
Мы приводим протокол за использование радио-телеметрическая система для записи сердечно-сосудистых параметров в Т4 спинного мозга перерезанных крыс через восемь недель после эмбрионального ствола мозга нервной стволовой клетки прививки в месте повреждения. Телеметрия продвинутая техника, чтобы точно оценить сердечно-сосудистую функцию в сознательных свободно движущихся с повреждением спинного мозга крыс.
Abstract
Высокое грудной или шейки травмы спинного мозга (SCI) может привести к сердечно-сосудистой дисфункции. Чтобы контролировать параметры сердечно-сосудистой системы, мы имплантировали катетер, соединенный с радиопередатчиком в бедренную артерию крыс, что была проведена T4 спинного мозга рассечение с или без прививки эмбриональных стволовых полученных нервных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок. По сравнению с другими методами, такими как вставки канюли или хвост манжеты, телеметрии выгодно постоянно контролировать артериальное давление и частоту сердечных сокращений в свободно движущихся животных. Он также способен долгосрочных нескольких поглощений данных. В повреждением спинного мозга крыс, базальные сердечно-сосудистые данных под безудержной состояния и вегетативной дисрефлексии в ответ на колоректального живота были успешно записаны. Кроме того, сердечно-сосудистые параметры до и после ТСМ можно сравнить в том же крысы, если передатчик имплантируют перед спинного мозга рассечения. Одним из ограничений описанного telemetПроцедура ры является то, что имплантация в бедренную артерию может повлиять на кровоснабжение ипсилатеральном задней конечности.
Introduction
Сердечно-сосудистая дисфункция возникает после травмы спинного мозга (SCI) на высоких уровнях. Это проявляется в неупорядоченной артериального давления и частоты сердечных сокращений в состоянии покоя, ортостатической гипотензии, вызванной физической нагрузкой гипотония и вегетативной дисрефлексии характеризуется эпизодами гипертензии и барорефлекторной опосредованного брадикардии в ответ на сенсорные стимулы ниже уровня травмы 1,2. Эти симптомы вмешиваться в повседневной жизни спинальных больных мозга ранения. Таким образом, важно создать эффективные инструменты для исследования сердечно-сосудистых изменений у животных с ТСМ и экспериментальных методов лечения.
Для исследования сердечно-сосудистой системы у животных, несколько методов, которые были использованы для мониторинга артериального давления и частоты сердечных сокращений. Центральные сердечно-сосудистые параметры могут быть записаны с помощью вставки канюли и телеметрии, в то время как неинвазивные хвост-манжеты могут быть использованы для измерения периферической крови давление 3. По сравнению с другими методами, телеметрия имеет главное преимущество, что она позволяет для непрерывной записи в свободно движущихся животных и долгосрочного мониторинга сердечно-сосудистой функции 4. В моделях с повреждением спинного мозга животных, изменения в периферической крови давления после экспериментальной стимуляции не может быть достаточно большим, чтобы быть обнаружены. Соответственно, подходящая методика кардиоконтроля должны быть выбраны для животных с ТСМ.
В настоящем исследовании, система радиотелеметрическими был введен для контроля сердечно-сосудистой системы у взрослых крыс после полной перерезки спинного мозга. Крысы получил трансплантацию сингенными крысы эмбриональных день 14 (E14) ствола мозга, полученных нервные стволовые клетки (BS-НСК) в месте повреждения. Крысы с травмой и не трансплантации и наивных, неповрежденной крыс были контрольной группой. Порядок телеметрии включает стерилизацию передатчика и имплантации (рисунок 1), запись базальной сердечно-сосудистой параметра, колоректальный живота, вызванного ответов и очистку передатчика ихранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были утверждены уходу и использованию комитета за животными (IACUC) по. NIH руководящие принципы для ухода за лабораторными животными и безопасности строго соблюдаются. Животные с хирургическими процедурами были адекватное лечение для минимизации боли и дискомфорта.
1 спинного мозга Curgery и сотовый Прививка
- Автоклав хирургические инструменты Предыдущие всем операций. Используйте Hot бисера стерилизатор (Fine Наука Tools), чтобы удалить болезнетворные микроорганизмы и микробные загрязнения из инструментов между процедурами на различных животных. Используйте стерильные хирургические перчатки, халат и шторы во время операции. Применять асептический хирургическую технику для каждого хирургического вмешательства.
- Женский Обезболить Фишеру 344 крыс с комбинацией (2 мл / кг) кетамина (25 мг / мл), ксилазина (1,3 мг / мл), и ацепромазина (0,25 мг / мл) вводили через внутрибрюшинной инъекции (IP).
- Бритье тыл и очистить кожу неоднократно бетадином и этанола.
- Разрежьте кожу с помощью # 10 лезвие и тупо рассекают мышцы слоев. Используйте скальпель, чтобы изолировать позвонков, подвергайте T3 позвонок, и выполнить спинной ламинэктомию используя остроконечный кусачек.
- Надрезать твердую мозговую оболочку в продольном направлении и секут спинной мозг на уровне Т4, используя комбинацию иридэктомия ножницами и микроаспирацией создать рострокаудальных разрыв примерно 1 мм от спинного пней мозга.
- Подождите около 1 - 2 мин, пока кровотечение полностью останавливается, тогда шовных мышц с 3-0 Vycril и закрыть кожу раны клипов.
- Введите Рингер-лактата (5 мл), бупренорфин (0,035 мг / кг), и ампициллин (33 мг / кг) подкожно сразу после операции и не поддерживают крыс в теплой инкубаторе до проснулся.
- Введите Рингера и раствор ампициллин один раз в день до 10 дней, и бупренорфин два раза в день в течение 3 дней или до признаки боли и страданий исчезают. Не вернуть животное к компании других животных, пока FУлли восстановлены.
- Вручную опорожнить мочевой пузырь два раза в день в течение приблизительно двух недель до установления рефлекторной опорожнения мочевого пузыря, а затем опорожнить мочевой пузырь раз в день на протяжении выживания при необходимости.
- Через две недели вновь анестезию SCI крыс, как описано выше, и повторно подвергать спинного мозга сайт поражения. Держите твердую мозговую оболочку закрыт сохранить имплантированных клеток в месте повреждения.
- Введите 10 мкл раствора клеток (3,5 × 10 5 мкл), собранной из E14 повсеместно GFP эмбрионов трансгенных крыс и встроенного в фибриногена и тромбина 5,6, в эпицентре полости поражения и ростральной и хвостового интерфейса поражения с распределенным впрыском сайтов, с использованием вытащил стеклянный микропипетки с внутренним диаметром 40 мкм, подключенного к шприца Гамильтона.
- Шовный мышечные слои и закрыть кожу раневых клипов.
- Действия после инъекции хирургии и ухода мочевого пузыря, как описано в шагах 1,6 - 1,8.
- Неделю бытьпередние перфузии, вводят 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 мл в дистиллированной воде) внутрибрюшинно к ретроградно этикеток симпатических преганглионарных нейронов в спинном мозге 7.
2 Передатчик Имплантация
- Замачивание transmittersin 2% раствор глутарового альдегида (4 мл 50% glutaraldhyde в 96 мл дистиллированной воды) в течение по крайней мере 1 - 2 часов (до 10 ч) при комнатной температуре в течение стерилизации.
- Промыть тщательно передатчиков стерильной 0,9% физиологического раствора 3 раза, и не хранить их в физиологическом растворе до использования (не более 1 часа).
- Через восемь недель после трансплантации клеток E14 (10 недель после травмы), reanesthetize крыс, которые прошли в SCI с или без клеток прививки и наивных контрольных крыс.
- Бритье области живота и задних конечностей. Очистите кожу с Бетадин. Поместите крысу на операционном столе в положении лежа на спине.
- Надрезать кожу на брюшной живота и внутренней поверхности бедра на правой стороне с помощью # 15 лезвие.
- Вырезать через хubcutaneous соединительные ткани, чтобы разоблачить связку бедренных сосудов и нервов, используя маленькие ножницы.
- Отделите бедренную артерию от вены и нерва, используя тонкий пинцет с загнутыми кончиками.
- Положите три шелковых швов под артерии и сделать свободный узел в каждой шва.
- Применение 0,1 мл Лидокаин (2%) с поверхностью артерии, чтобы вызвать расширение кровеносных сосудов для последующей катетеризации.
- Закрепите судно дистально с постоянным шелковой узлом и временного блока проксимально, растягивая свободную шелковой нитью.
- Прокол артерии с помощью 20 калибра изогнутую иглу и вставьте кончик телеметрической катетера (длиной 8 см), используя инструмент ввода катетера.
- Вставьте катетер рострально до 4 см, таким образом помещая кончик в грудной аорты.
- Закрепите катетер в сосуде, связывая три шелковых швов вокруг бедренной артерии.
- Сделайте подкожный карман вдоль фланга между хвостового края грудной клетки и Тон наиболее черепно расширение диапазона колена с тупыми ножницами.
- Вставьте корпус датчик в карман и швом к соединительной ткани, окружающей передатчик, чтобы избежать чрезмерного движения.
- Шовный кожу под № 6 шелковой нитью.
- Введите Рингер-лактата (5 мл), бупренорфин (0,035 мг / кг), и ампициллин (33 мг / кг) подкожно сразу после операции и не поддерживают крыс в теплой инкубаторе до проснулся.
3 базальной Среднее артериальное давление (САД) и частоты сердечных сокращений (HR) Запись
- Еще в один день следующей передатчика имплантации, поставить одного животного на приемнике площадку и включить передатчик. Подождите примерно 10 - 15 мин, чтобы приучить животное и стабилизировать сердечно-сосудистых параметров.
- Запись отдыха MAP и HR, которые являются производными от импульсов артериального давления с компьютеризированной системой сбора данных, по крайней мере 1 часа. Сбор данных каждые 5 секунд.
- Монитор Анimals непрерывно и удаления точек данных во время появления видимых судорог. Для каждого животного, средние точки данных для получения средних значений.
4 Колоректальный Вздутие вызванной автономная дисрефлексия
- Задержите NSC-привитые или управления SCI крыс в полотенце, поставляемой с пищевыми гранул внутри на ресивере передатчика. Обычно крысы могут остаться совместно во время процедуры.
- Вставьте воздушный шар латекса наконечником катетера в прямую кишку в течение примерно 2 см и закрепите его в хвост с лентой 8.
- Включить передатчик и дождитесь 10 - 15 мин позволяя кровяное давление, чтобы вернуться к preinsertion базовой линии.
- Вызвать колоректального растяжение надуванием баллона медленно в течение 10 сек с 1,4 мл воздуха в течение 1 мин, чтобы генерировать давление от примерно 30 мм рт.
- Запись MAP и HR 1 мин до 1 мин во время, и 1 мин после колоректального живота; выборочные данные каждые 3 сек во время процедуры 3 мин.
- Выполните 2 - 3 испытания на животных, по крайней мере 15 мин восстановления промежутке между двумя испытаний.
- Передозировка животные (IP) с двойным комбинации доза анестезии, описанной выше, если не дальнейшей оценки. Заливать животных с физиологическим раствором с последующим 4% параформальдегидом.
- Для каждого животного, средние значения до и во время колоректального растяжения соответственно; вычислить разницу между исходным и вздутие-индуцированное отображение и HR изменений для каждого испытания; среднем за 2 - 3 испытаний для получения средних значений.
5 передатчик для очистки
- Снимите передатчик от тела животного после анестезии, но до перфузии. Замочите сразу в стакан не с дистиллированной водой до очистки; избежать сушку телеметрической устройства.
- Передача дальномер до 1% Terg--Zyme моющим раствором ферментативную (10 г / л воды) в течение 24 ч при комнатной температуре.
- REGEL кончик передатчика катетера с тупым 30 иглыподключен к REGEL шприца.
- Тщательно высушите передатчик используя сложенную мягкую ткань и хранить его в оригинальной пластиковый лоток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанную выше технику телеметрии, мы успешно записаны сердечно-сосудистых параметров в с повреждением спинного мозга животных. У животных с только ТСМ, MAP был значительно сокращен в то время как HR увеличилась по сравнению с наивными животных, в соответствии с предыдущими докладами 9. У животных с BS-НСК прививки, MAP и HR подошел уровень, составляющий в наивных животных (Рисунок 2). Во колоректального живота, крыса считался dysreflexic если вредные стимуляция производится повышение MAP и уменьшение HR 3,8. Эпизодическая гипертония и барорефлекторных опосредованного брадикардия неизбежно вызвало у всех животных, но степень отличались между группами. Увеличение MAP в животных, привитых с BS-НСК была значительно ниже (16,9 ± 3,1 мм рт ст, п = 3), чем животные с только травмы (64,1 ± 1,6 мм рт.ст., н = 3) (рисунок 3). Тем не менее, снижение ЧСС во время колоректального растяжения существенно не различались между группойс. Как брадикардии опосредуется барорефлекторных механизмов, это несоответствие может быть обусловлено снижением чувствительности барорецепторов после ТСМ 10. Спазм произошел во колоректального растяжения в большинстве крыс независимо от лечения.
После гистологического анализа, иммунноокрашивания указано отличную выживаемость трансплантата в спинном мозге с имплантированными BS-НСК, но брешь в спинном мозге травмированных контрольных животных без трансплантата. Эмбриональные НСК полностью заполнен месте повреждения и были обнаружены лишь незначительные полости. Имплантаты интегрированы в принимающей серого и белого вещества как рострально и каудально. Большое количество TH + катехоламинергических и 5-HT + серотонергических нейронов были найдены в имплантатов BS-НСК, а также многочисленные аксоны топографически иннервируются хвостовой симпатические преганглионарные нейронов в колонке intermediolateral клеток на большие расстояния (рисунок 4). В отличие от этого, в травмированных животных без трансплантата, Th + / 5-НТ + Жibers не были обнаружены в грудопоясничного спинного мозга ниже поражения (не показан).
Рисунок 1:. Схема катетеризации бедренной артерии бедренная артерия (А.) рассекают от нерва (N.) и вены (В.), а затем прокалывается с изогнутым иглы. Катетер подсоединен к передатчику вставляется в артерию, помещая наконечник катетера на уровне грудной аорты для сердечно-сосудистой системы записи (~ 4 см).
Рисунок 2: Основную MAP и HR восстановить в с повреждением спинного мозга крыс, привитые BS-НСК В репрезентативной когорты (п = 3 / группа), записи телеметрии показывает значительно более низкий базальный ПДЧ и более высокую HR у крыс с ТСМ и не лечение 10 пи. кс после травмы (* р <0,05). В отличие от этого, как сердечно-сосудистые параметры восстановления до уровня наивных крыс 8 недель после БС-НСК прививки (10 недель после травмы) (оба р> 0,05; ANOVA с последующим Апостериорные Фишера).
Рисунок 3: Колоректальный живота (CRD) -индуцированных вегетативную dysreflexic Автономная дисрефлексия срабатывает во время 1 мин CRD в обоих SCI и BS-НСК привитых животных, проявляется как эпизодический гипертонии сопровождается брадикардии.. () В травмированной контрольной крысы, MAP увеличивается примерно на 60 мм рт.ст. в течение толстой кишки живота. (B) Тем не менее, увеличение MAP сильно снижается до 10 - 20 мм рт.ст. у крысы с привитым BS-НСК.
14 / 51914fig4highres.jpg "/>
Фигура 4: Привитые BS-НСК интегрироваться в хост взрослого спинного мозга и дифференцируются в катехоламинергических и серотонинергических нейронов () через восемь недель после BS-НСК прививки, GFP и GFAP дважды иммуномечение демонстрирует заполнение месте повреждения с имплантированными GFP меченых клеток в. продольный спинной секции шнур. (В) В отличие от этого, существует разрыв в пересечённого спинного мозга без трансплантата. (C, D) иммунноокрашивания для тирозингидроксилазы (TH) и серотонина (5-HT) показывает много-й и 5-HT положительные нейроны внутри трансплантата. (E, F) Привитые происхождения TH + и 5-HT + аксоны расширить и иннервируют каудальный симпатические преганглионарные нейронов, меченных fluorogold в столбце intermediolateral клеток. Шкала баров: 1 мм (В), 25 мкм (D), и 50 мкм (F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционно, наполненной жидкостью полая игла вставлена в артерию и соединен с датчиком давления для записи параметров сердечно-сосудистой системы в качестве терминального снимка в каждом животном 11. Чтобы постоянно следить сердечно-сосудистой производительность в течение длительного времени, радиотелеметрическими системы используются во многих лабораториях. Это более изысканный инструмент может записывать кровяное давление в сознании, свободно передвигающихся животных. По сравнению с наполненных жидкостью катетеров, телеметрии считается более передовую технику, чтобы точно оценить сердечно-сосудистую функцию в SCI животных. Хотя в настоящем исследовании передатчик был имплантирован только 1 день до записи, он может быть имплантирован до или после SCI для приобретения нескольких данных в зависимости от потребностей эксперимента 12. Для базисной артериального давления и ЧСС, либо центральной или периферической записи может быть достигнуто. Тем не менее, сердечно-сосудистые реакции на растяжение колоректального не могут быть обнаружены с помощью неинвазивной хвостовой манжеты на основе метода внаш опыт. Последние телеметрическая анализ проверяется долгосрочный сохранение гипотонии и тахикардии после полной высокой грудной перерезки спинного мозга у крыс 9,13. Нижний базальная MAP и выше HR в наших контрольных крыс с повреждением спинного мозга согласуются с предыдущего доклада, используя ту же технику записи. Колоректальный вызванной автономная дисрефлексия была смягчена в крыс, получавших клеток трансплантата. Основываясь на наших гистологические признаки, катехоламинергических и серотонинергической входов в SPNs по нескольким сегментов спинного может объяснить физиологические улучшений.
Передатчик катетеризация имеет решающее значение для успешной имплантации и записи. В спинного мозга крыс перерезанных, диаметр бедренной артерии меньше, чем обычно, в связи с отсутствием моторной и сенсорной функции задних конечностей. Полный паралич обычно приводит к атрофии мышц. Хирурги могут найти кончик катетера, чтобы быть больше, чем артерии. В этом случае, применяя 2% лидокаина наПоверхность артерии элиситорного сосудов позволяет кончику катетера, чтобы быть легко вставлен в проколотые сосудов. Примечательно, лидокаин наведенного расширение сосудов сохраняется около 4 - 5 мин. Таким образом, прокола сосуда и катетеризации должна быть выполнена как можно быстрее. В период сбора данных базальных параметров, мы собрали точек данных каждые 5 секунд в течение 1 часа. В ободочной живота индуцированного записи на 3 мин, однако, данные отбирали каждые 3 сек, чтобы получить больше точек данных для более точного усреднения в течение этого короткого периода времени.
Имплантация катетера в бедренную артерию может помешать кровоснабжения задних конечностей и вызывают некроз тканей, особенно если дистальный артерии зашивается. Уплотнение точку вставки катетер в артерию с небольшим падением ткани клеем вместо шелковой нити может по крайней мере частично восстановить кровоток. Таким образом, животные были бы здоровее для долгосрочного мониторинга.Кроме того, катетер передатчика может быть имплантирован непосредственно в брюшной аорты размещения корпусе датчика в брюшную полость. Этот метод позволяет избежать распада тканей в ипсилатеральной задней конечности, но имеет риск влияния на желудочно-кишечную функцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329 (2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
