ラジオ遠隔測定システムは、脊髄離断および胚性神経細胞移植片幹ラットの心臓血管機能を監視する

Summary

私たちは、8週間、胚性脳幹神経幹細胞は、病変部位に移植後T4脊髄離断ラットの心臓血管のパラメータを記録するために無線遠隔測定システムを使用するためのプロトコルを提示する。テレメトリーを正確に意識的に自由に移動し、脊髄損傷ラットにおける心血管機能を評価するための高度な技術です。

Abstract

ハイ胸部または頸髄損傷（SCI）は、心臓血管機能障害につながることができます。心臓血管のパラメータを監視するために、または緑色蛍光タンパク質を発現する胚性脳幹由来神経幹細胞の移植なしT4脊髄離断を受けたラットの大腿動脈に無線送信機に接続されたカテーテルを移植した。そのようなカニューレ挿入またはテールカフなどの他の方法に比べて、遠隔測定が連続的に自由に移動する動物における血圧および心拍数を監視することが有利である。また、長期複数のデータの取得が可能である。脊髄損傷ラットでは、結腸直腸拡張に応じて、非拘束状態と自律神経反射異常の下で基礎心血管データが正常に記録された。送信機は脊髄離断前に移植される場合に加えて、SCIの前と後の心血管パラメータは同じラットに比較することができる。記載されtelemetの1つの制限ryの手順は、大腿動脈内注入は、同側の後肢への血液供給に影響を与えることができることである。

Introduction

心血管機能障害は、高レベルでの脊髄損傷（SCI）後に発生します。それは、無秩序な血圧および心拍数安静時、起立性低血圧、運動誘発性低血圧、および損傷レベル^1,2下の感覚刺激に反応して高血圧や圧反射媒介徐脈のエピソードを特徴自律神経反射異常で明らかにされている。これらの症状は、脊髄損傷患者の日常生活を妨害する。したがって、SCIと実験的な治療法と動物での心血管系の変化の調査のための効果的なツールを確立することが重要である。

動物において心臓血管機能を調べるために、いくつかの技術は、血圧および心拍数をモニターするために使用されている。非侵襲尾カフ末梢血圧^3を測定するために使用することができるのに対し、中央の心血管パラメータは、カニューレ挿入およびテレメトリー記録することができる。他の方法、テレと比較するとmetryは、それが自由に動く動物および心血管機能⁴の長期モニタリングに連続記録を可能にする主な利点を有している。 SCIの動物モデルにおいて、実験的刺激後の末梢血圧の変化が検出されるのに十分な大きさでなくてもよい。したがって、適切な心臓監視技術は、SCIを持つ動物のために選択する必要があります。

本研究では、無線遠隔測定システムは、完全な脊髄離断後の成体ラットにおける血管機能をモニターするために導入した。ラットは、損傷部位に同系ラットの胚14日目（E14）脳幹由来神経幹細胞（BS-NSCの）の移植片を受けた。けがのない移植ナイーブラットは、損傷していないラットを対照とした。遠隔測定の手順は、送信機滅菌注入（ 図1）、基底心血管パラメータの記録、結腸直腸拡張によって誘発される応答、および送信機の洗浄とを含むストレージ。

Protocol

全ての動物プロトコールは施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。実験動物のケアと安全のためのNIHガイドラインは厳密に従っている。外科的処置による動物は、十分に痛みや不快感を最小限に抑えるために処理した。

1脊髄Curgeryおよび細胞移植

1. すべての手術の前にオートクレーブ手術器具。異なる動物での手続きの間に商品から病原体や微生物の汚染物質を除去するためにホットビーズ滅菌器（ファイン科学ツール）を使用します。手術中に無菌手術用手袋、ガウン、ドレープを使用してください。各外科的処置のための無菌手術法を採用しています。
2. 腹腔内注射（ 腹腔内 ）を介して投与ケタミンの組合せ（2ミリリットル/ kg）を（25 mg / ml）を、キシラジン（1.3 mg / ml）で、およびアセプロマジン（0.25 mg / ml）を用いて雌のフィッシャー344ラットを麻酔。
3. 後ろの領域を剃るとベタジンとエタノールで繰り返し肌をきれいにします。
4. ＃10ブレードを用いて皮膚をカットし、ぶっきらぼうに筋肉層を分析。 、椎骨を分離するのT3椎骨を公開し、先の細い骨鉗子を使用して、背側椎弓切除術を実行するためにメスを使用してください。
5. 長手方向に硬膜を切開し、脊髄断端の間に約1mm吻側尾ギャップを作成するために虹彩切除鋏と微小誤嚥の組み合わせを用いてT4レベルで脊髄を横断する。
6. 3-0 Vycrilと完全に出血を停止し、その後、縫合糸の筋肉まで2分と創傷クリップで皮膚を閉じ - 約1待ちます。
7. 皮下手術直後乳酸リンゲル（5ミリリットル）、ブプレノルフィン（0.035ミリグラム/ kg）であり、アンピシリン（33 mgの/ kg）を注入し、目を覚ましまで暖かいインキュベーター内でラットを維持する。
8. 注入リンゲル1日2回、3日間または痛みや苦痛の徴候が消えるまで、アンピシリン一日一回、10日までのソリューション、およびブプレノルフィン。 Fまで他の動物の会社に動物を返さないでくださいully回復した。
9. 手動で反射排尿の確立まで、約2週間1日2回、膀胱を空にしてから、必要に応じて生存全体で一日一回、膀胱を空にします。
10. 二週間後、上述したように、SCIラットを再麻酔し、脊髄損傷部位を再度露出させる。病変部位に移植された細胞を保持するために閉じた硬膜を保管してください。
11. 病変空洞の震源地と複数の噴射に病変の吻側および尾側インターフェースに、細胞液10μl（3.5×10 ^5μl）を、E14ユビキタスGFPトランスジェニックラットの胚から採取し、フィブリノゲンに埋め込 ​​まれ、トロンビン^5,6を注入ハミルトンシリンジに接続さ40μmの内径引っ張らガラスマイクロピペットを使用して、サイ​​ト、。
12. 筋肉層を縫合し、創傷クリップで皮膚を閉じます。
13. 1.8 - ステップ1.6で説明したように手術後の注入と膀胱のケアを行います。
14. 一週間であること前部灌流は、脊髄⁷に腹腔内に逆行ラベル交感神経節前ニューロンへの0.5％フルオロゴールド（FG、蒸留水0.4 ml）を注入する。

2トランスミッタ注入

1. 滅菌のために室温で（10時間まで）で2時間 - 少なくとも1 transmittersin 2％グルタルアルデヒド溶液（蒸留水96ミリリットルの50％glutaraldhyde 4 ml）に浸す。
2. 徹底的に滅菌0.9％食塩水で3回の送信機を洗浄し、使用（わずか1時間）まで生理食塩水に保管してください。
3. E14細胞移植後8週間（10週間損傷後）、細胞移植およびナイーブ対照ラットの有無にかかわらず、SCIを受けたラットreanesthetize。
4. 腹部と後肢を剃る。ベタジンで皮膚をきれいにしてください。仰臥位で手術台にラットを置きます。
5. ＃15ブレードを使用して右側の腹側腹部と太ももの内側の皮膚を切開。
6. 秒を切ってubcutaneous結合組織は、小さなハサミを使用して大腿血管や神経の束を露出させる。
7. 静脈と湾曲した先端の微細鉗子を用いて神経から大腿動脈を分離します。
8. 動脈の下に3絹縫合糸を入れて、それぞれの縫合糸の緩い結び目を作る。
9. その後のカテーテル挿入のための血管拡張を誘発するために動脈の表面に0.1ミリリットルリドカイン（2％）を適用します。
10. 近位に緩い絹縫合糸を延伸して恒久的な絹の結び目と一時ブロックと遠位に容器を固定します。
11. 20ゲージの湾曲した針を用いて動脈を穿刺し、カテーテル挿入ツールを使用してテレメータカテーテル（長さ8cm）の先端を挿入します。
12. これにより、胸部大動脈に先端を置く4センチメートルまで吻側にカテーテルを挿入します。
13. 大腿動脈の周りに3絹縫合糸を結ぶことにより、血管内にカテーテルを固定する。
14. 胸郭とtの尾側縁部との間の横腹に沿って皮下ポケットを作る彼鈍はさみで膝の範囲の中で最も頭側延長。
15. 過度の運動を避けるために、送信機を周囲の結合組織にポケットや縫合に送信機本体を挿入します。
16. 6号絹糸で皮膚を縫合。
17. 皮下手術直後乳酸リンゲル（5ミリリットル）、ブプレノルフィン（0.035ミリグラム/ kg）であり、アンピシリン（33 mgの/ kg）を注入し、目を覚ましまで暖かいインキュベーター内でラットを維持する。

3基礎平均動脈圧（MAP）および心拍数（HR）の記録

1. 早ければ、送信機移植後1日として、受信機パッドの上に単一の動物を入れて、上の送信機の電源を入れます。動物を慣らすと心血管パラメータを安定させるために15分 - 約10のを待ちます。
2. 少なくとも1時間、コンピュータ化されたデータ収集システムのパルス動脈圧から導出されたレコードの休止MAPおよびHR、。データごとに5秒を収集します。
3. ANを監視imals継続的に可視痙攣発生時のデータポイントを削除します。各動物について、平均データ点は平均値を得る。

4。結腸直腸拡張によって誘発される自律神経反射異常

1. トランスミッタ受信機内部の食物ペレットに付属のタオルでNSC-グラフトまたはSCIのコントロールラットを拘束。通常、ラットは処置の間に協調的に滞在することができます。
2. 約2cmのために、直腸にラテックスバルーンが先端に付いたカテーテルを挿入し、テープ⁸尾に固定します。
3. 上の送信機の電源を入れ、10を待つ - 血圧が予備挿入ベースラインに戻ることができるように、15分。
4. 約30mmHgの圧力を生成するために、ゆっくりと1分間空気1.4mlの10秒間に渡りバルーンの膨張によって、結腸直腸膨張を誘発する。
5. レコードマップおよびHR 1分前、途中で1分間、および結腸直腸拡張後の1分;サンプルデータ3分間の手順の間ごとに3秒。
6. 2つの試験の間に少なくとも15分間の回復間隔で動物あたり3試験 - 2を実行します。
7. がない場合はさらなる評価上記の二重線量麻酔の組み合わせで過量投与した動物（ 腹腔内 ）。 4％パラホルムアルデヒドに続いて食塩水で動物を灌流する。
8. 各動物について、前及び結腸直腸膨張の間に値を平均;各試験のベースラインおよび膨満によって誘発されるMAPおよびHRの変化との差を計算し、 2を超える平均 - 3試験の平均値を得た。

5。送信機のクリーニング

1. 麻酔後であるが、灌流の前に、動物の体からトランスミッターを外します。クリーニングまで蒸留水を満たしたビーカーに直ちに浸し;テレメータ装置の乾燥を避ける。
2. 室温で24時間、1％ターグ-A-ザイム、酵素洗浄溶液（10g / Lの水）にテレメータを転送する。
3. のReGel鈍30ゲージの針を用いて送信機のカテーテルの先端のReGel注射器に接続されている。
4. 慎重に折り畳まれた軟組織を使用して送信機を乾燥させ、元のプラスチックトレイに格納します。

Representative Results

上記の遠隔測定技術を用いて、成功した脊髄損傷動物における心血管パラメータを記録した。 HRは以前の報告⁹と一致して、ナイーブ動物と比較して増加したのに対し、単独のSCIと動物では、MAPは、有意に減少した。 BS-NSC移植した動物では、MAPおよびHRはナイーブ動物（ 図2）で測定されたレベルに近づいた。侵害刺激は、MAPの上昇およびHR ^3,8の減少をもたらした場合は、結腸直腸拡張時には、ラットをdysreflexicとした。エピソード高血圧および圧反射媒介徐脈、必然的に全ての動物において誘発されたが、程度はグループ間で異なっていた。 BS-NSCを用いてグラフト化された動物におけるMAPの増加ははるかに低かった（16.9±3.1 mmHgで、n = 3）を単独で損傷を有する動物（64.1±1.6 mmHgであり、n = 3）（ 図3）より。しかし、結腸直腸膨張時のHRの低下が著しく、グループ間で差がなかった秒。徐脈は、圧反射のメカニズムによって媒介されるように、この不一致は、SCI後¹⁰圧受容器の感受性の低下に起因する可能性がある。攣縮に関係なく治療の最もラットで結腸直腸拡張が発生しました。

組織学的分析の際、免疫標識は、移植することなく、優れたグラフトBS-NSCのを移植した脊髄における生存が、負傷したコントロール動物の脊髄のギャップを示した。胎児NSCは完全に病変部位を満たし、わずかな空洞が観察された。ホスト灰白質および白質の両方吻側および尾側に統合されたインプラント。 TH ⁺カテコールアミンおよび5-HT ⁺セロトニン作動性ニューロンの多数は、BS-NSCインプラント内で発見された、数多くの軸索は地形的に長い距離（ 図4）を介して中間外側細胞柱に尾交感神経節前ニューロンを神経支配。グラフトせず、損傷した動物において、対照的に、THは⁺ / 5-HTの⁺ f ^はibersが病変以下胸脊髄で検出されなかった（図示せず）。

図1：大腿動脈のカテーテル挿入を示す図である大腿動脈（A.）は、神経（N.）と静脈（V.）から切開した後、湾曲した針で穿刺する。送信機に接続されたカテーテルは、心臓血管記録胸部大動脈（約4センチ）のレベルでのカテーテルの先端を配置し、動脈に挿入される。

図2：基底MAPとHRは、BS-NSCのでグラフトされた脊髄損傷ラットで回復代表コホートでた（n = 3 /群）、遠隔測定記録が有意に低い基底MAPとSCIラットにおける高いHRと無治療10おしっこを示している。損傷後KSた（* p <0.05）。これとは対照的に、心血管系の両方のパラメータが（10週損傷後）（; ANOVAはフィッシャーのポストホックに続く両方のp> 0.05）8週間BS-NSCの移植後のナイーブラットのレベルにまで回復する。

図3：結腸直腸膨張（CRD）は 、自律神経過反射の両方のSCIとBS-NSC移植された動物での1分間のCRD中にトリガされ、自律dysreflexic誘発徐脈を伴うようなエピソード高血圧を明らかに。負傷した対照ラット（A）において、結腸膨満の間に約60 mmHgのよるMAP増加する。 BS-NSCのでグラフトされたラットでは20 mmHgの- （B）が、MAPの増加が強く10に低減される。

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図4：グラフトBSは、NSCは、ホスト大人の脊髄に統合し、カテコールアミン及びセロトニン作動性ニューロンへの分化（A）BS-NSCの移植後8週間、GFPおよびGFAP二重免疫標識は、内に移植、GFP標識細胞を損傷部位の充填を示しています。縦脊髄セクション。 （B）対照的に、ギャップがグラフトすることなく、離断脊髄内に存在する。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）及びセロトニン（5-HT）のための免疫標識（C、D）は、多くのTHおよび移植片内の5-HT陽性ニューロンを明らかにする。 （E、F）グラフト由来のTH ⁺および5-HT ⁺軸索は拡張し、中間外側細胞欄にフルオロゴールドで標識尾交感神経節前ニューロンを刺激。スケールバー：1ミリメートル（B）、25ミクロン（D）、及び50ミクロン（F）。

Discussion

伝統的に、流体充填されたカニューレを動脈に挿入し、各動物¹¹における端末スナップショットとして心臓血管のパラメータを記録するために圧力変換器に接続されている。連続して長い時間のための心血管系のパフォーマンスを監視するには、無線遠隔測定システムは、多くの研究室で使用される。このより洗練されたツールは、自由に動物を移動させること、意識的に血圧を記録することができます。流体が満たされたカテーテルと比較して、テレメトリは、より高度な技術を正確SCI動物において心臓血管機能を評価するために考えられている。本研究において、送信機は、1日だけ記録する前に移植したが、それは実験的要件¹²に応じて、複数のデータ取得のためにSCIの前または後に移植することができる。基礎血圧およびHR、どちら中枢または末梢記録達成することができる。しかし、結腸直腸拡張に対する心血管系応答は、非侵襲でのテールカフベースの方法では検出できない私たちの経験。最近の遠隔測定分析は、ラット^9,13における完全な高胸部脊髄切断後の低血圧および頻脈の長期持続性を検証した。私たちのSCI対照ラットより低い基底MAPおよび高いHRは同じ記録技術を用いた以前の報告と一致している。大腸誘発性の自律神経反射異常は、細胞の移植を受けたラットで緩和された。私たちの組織学的証拠に基づいて、複数の脊椎のセグメント間でのSPNのカテコールアミン及びセロトニン作動性入力は、生理的な改善を説明することができる。

トランスミッタカテーテル法は成功し、移植し、記録のために重要である。脊髄離断ラットでは、大腿動脈の直径は、モータ及び後肢の感覚機能の欠如のために通常よりも小さくなっている。完全な麻痺は通常、筋萎縮をもたらす。外科医は、動脈よりも大きくなるようにカテーテルの先端を見つけることができます。この場合、上の2％リドカインを適用すること血管拡張を誘発し、動脈の表面を容易に穿刺さ血管に挿入するカテーテルの先端を可能にする。 5分 - 注目すべきことに、リドカイン誘起血管拡張は、約4を持続する。したがって、血管穿刺およびカテーテル法は、可能な限り迅速に行われるべきである。基礎パラメータのデータ収集の期間では、データポイントを1時間ごとに5秒を収集した。 3分間の結腸直腸膨張誘導性記録時には、しかしながら、データがこの短い期間を通して、より正確な平均化のためのより多くのデータポイントを得るために3秒ごとにサンプリングした。

大腿動脈へのカテーテルの埋め込みは、遠位動脈を縫合する場合は特に、後肢の血液供給を妨害し、組織壊死を誘導することができる。代わりに絹縫合糸の組織接着剤の小滴動脈にカテーテル挿入ポイントをシールすることは、少なくとも部分的に血流を復元することができます。これにより、動物は、長期モニタリングのための健康的であろう。代替的に、送信機のカテーテルを腹腔内に送信機本体を配置する腹部大動脈に直接移植することができる。この方法は、同側後肢における組織崩壊を回避するが、消化管機能に影響を与える恐れがある。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension