Summary
Se presenta un protocolo para el uso de un sistema de radio-telemétrico para registrar los parámetros cardiovasculares en la T4 de la médula espinal de ratas cortados transversalmente ocho semanas después del tronco cerebral embrionaria de células madre neurales de injerto en el sitio de la lesión. La telemetría es una técnica avanzada para evaluar con precisión la función cardiovascular en conscientes de la médula espinal de ratas lesionadas con libertad de movimientos.
Abstract
Lesión de la médula espinal torácica o cervical alta (SCI) puede conducir a la disfunción cardiovascular. Para controlar los parámetros cardiovasculares, se implantó un catéter conectado a un transmisor de radio en la arteria femoral de ratas que se sometieron a una transección de la médula espinal T4 con o sin injerto de células madre neurales embrionarias del tallo cerebral derivados que expresan la proteína verde fluorescente. En comparación con otros métodos, como la inserción de la cánula o manguito de la cola, la telemetría es ventajoso para controlar continuamente la presión arterial y la frecuencia cardíaca en los animales se mueven libremente. También es capaz de múltiples adquisiciones de datos a largo plazo. En la médula espinal lesionada ratas, se registraron los datos con éxito cardiovasculares basales bajo condición desenfrenada y la DA en respuesta a la distensión colorrectal. Además, los parámetros cardiovasculares antes y después de SCI pueden compararse en la misma rata si un transmisor se implanta antes de una transección de la médula espinal. Una limitación de la Telemet descritoRY procedimiento es que la implantación en la arteria femoral puede influir en el suministro de sangre a la extremidad posterior ipsilateral.
Introduction
Disfunción cardiovascular se produce después de una lesión de la médula espinal (SCI) en niveles altos. Se manifiesta en la presión desordenada arterial y frecuencia cardíaca en reposo, hipotensión ortostática, hipotensión inducida por el ejercicio, y la DA se caracteriza por episodios de hipertensión y bradicardia baroreflex mediada en respuesta a estímulos sensoriales por debajo del nivel de la lesión 1,2. Estos síntomas interfieren con la vida diaria de los pacientes con lesión medular. Por lo tanto, es importante establecer herramientas eficaces para la investigación de cambios cardiovasculares en animales con SCI y los tratamientos experimentales.
Para investigar la función cardiovascular en animales, varias técnicas se han utilizado para controlar la presión arterial y la frecuencia cardíaca. Los parámetros cardiovasculares centrales pueden ser registrados por inserción de la cánula y la telemetría, mientras que la cola no invasivos esposas se pueden emplear para medir la presión arterial periférica 3. En comparación con otros métodos, telemetría tiene la ventaja principal que permite la grabación continua en animales con libertad de movimientos y el seguimiento a largo plazo de la función cardiovascular 4. En modelos animales de SCI, los cambios en la presión de la sangre periférica después de la estimulación experimental no pueden ser lo suficientemente grande para ser detectado. En consecuencia, la técnica de monitorización cardiaca adecuada debe ser seleccionado para animales con SCI.
En el presente estudio, un sistema de radio-telemetría se introdujo para controlar la función cardiovascular en ratas adultas después de la sección completa de la médula espinal. Las ratas recibieron injertos de rata singénico día embrionario 14 (E14) células madre neuronales del tronco cerebral derivado (BS-NSC) en el sitio de la lesión. Ratas con lesiones y no de trasplante e ingenuos, ratas ilesos sirvieron como controles. El procedimiento de la telemetría incluye la esterilización transmisor y la implantación (Figura 1), la grabación del parámetro cardiovascular basal, respuestas inducidas por distensión colorrectal, y la limpieza y transmisoralmacenamiento.
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Protocol
Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC). Directrices del NIH para el cuidado de animales de laboratorio y seguridad se siguen estrictamente. Los animales con los procedimientos quirúrgicos fueron tratados adecuadamente para minimizar el dolor y el malestar.
1. Médula Espinal Curgery e injerto celular
- Instrumentos quirúrgicos autoclave antes de todas las cirugías. Utilice Hot bolas Esterilizador (Herramientas de Bellas Ciencia) para eliminar los agentes patógenos y contaminantes microbianos de instrumentos entre los procedimientos en diferentes animales. Utilice guantes estériles quirúrgicos, batas y cortinas durante la cirugía. Emplear técnica quirúrgica aséptica para cada procedimiento quirúrgico.
- Anestesie hembra Fischer 344 ratas con una combinación (2 ml / kg) de ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml), y acepromacina (0,25 mg / ml) administrados a través de inyección intraperitoneal (ip).
- Afeitarse la zona de la espalda y limpiar la piel en varias ocasiones con Betadine y etanol.
- Cortar la piel con una cuchilla # 10 y sin rodeos disecar los músculos capas. Utilice un bisturí para aislar las vértebras, exponer la vértebra T3, y realizar una laminectomía dorsal usando una punta fina gubia.
- Incisión en la duramadre longitudinalmente y seccionar la médula espinal a nivel de T4 utilizando una combinación de iridectomía tijeras y microaspiración para crear un espacio de rostrocaudal aproximadamente 1 mm entre los muñones de la médula espinal.
- Espere alrededor de 1 - 2 min hasta que el sangrado se detenga y luego totalmente los músculos de sutura con 3-0 Vycril y cerrar la piel con grapas para heridas.
- Inyectar con lactato de Ringer (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg) y ampicilina (33 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía y mantener ratas en una incubadora caliente hasta que despierta.
- Se inyecta la solución Ampicilina una vez al día hasta 10 días, y la buprenorfina dos veces al día durante 3 días o hasta que aparezcan signos de dolor y angustia desaparecen de Ringer y. No devuelva un animal a la compañía de otros animales hasta fully recuperó.
- Vaciar manualmente la vejiga dos veces al día durante aproximadamente dos semanas hasta que el establecimiento de la vejiga reflejo de vaciado, y luego vaciar la vejiga una vez al día a lo largo de la supervivencia si es necesario.
- Dos semanas después, volver a anestesiar ratas SCI como se describe anteriormente y volver a exponer el sitio de la lesión de la médula espinal. Mantenga la duramadre cerrado para retener las células implantadas en el sitio de la lesión.
- Inyectar 10 l de solución de células (3,5 × 10 5 l), obtenida de GFP ubicua E14 embriones de rata transgénica y embebidos en fibrinógeno y trombina 5,6, en el epicentro de la cavidad de la lesión y la interfaz rostral y caudal de lesión con inyección múltiple sitios, utilizando una micropipeta de vidrio desmenuzado con un diámetro interior de 40 m, conectada a una jeringa Hamilton.
- Suturar las capas musculares y cerrar la piel con grapas para heridas.
- Lleve a cabo después de la inyección de la cirugía y el cuidado de la vejiga, como se describe en los pasos 1.6 a 1.8.
- Una semana estarla perfusión tanto, se inyectan 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml en agua destilada) por vía intraperitoneal a la etiqueta retrógradamente las neuronas preganglionares simpáticas en la médula espinal 7.
2. Transmisor Implantación
- Remojar transmittersin solución de glutaraldehído al 2% (4 ml de 50% glutaraldhyde en 96 ml de agua destilada) durante al menos 1 - 2 horas (hasta 10 horas) a temperatura ambiente durante la esterilización.
- Lávese a fondo con transmisores estéril al 0,9% de solución salina 3 veces y almacenarlos en solución salina hasta su uso (no más de 1 hora).
- Ocho semanas después del trasplante de células E14 (10 semanas después de la lesión), reanesthetize las ratas que se sometieron a un SCI con o sin injerto celular y las ratas de control no tratados previamente.
- Afeitar el área abdominal y extremidades posteriores. Limpie la piel con Betadine. Coloque la rata en la mesa de operaciones en posición supina.
- Incisión en la piel en el abdomen y el muslo interno ventral en el lado derecho utilizando una cuchilla # 15.
- Corte a través de los stejidos conectivos ubcutaneous para exponer el conjunto de vasos femorales y nervio utilizando una tijera pequeña.
- Separar la arteria femoral de la vena y el nervio usando una pinza fina con puntas curvadas.
- Ponga tres suturas de seda debajo de la arteria y hacer un nudo flojo en cada sutura.
- Aplicar 0,1 ml de lidocaína (2%) a la superficie de la arteria para provocar la vasodilatación para su posterior cateterización.
- Asegure el recipiente distalmente con un nudo de seda permanente y temporal de bloques proximalmente por el estiramiento de una sutura de seda floja.
- La punción de la arteria mediante una aguja curvada de calibre 20 e inserte la punta del catéter telémetro (8 cm de largo) con una herramienta de inserción del catéter.
- Inserte el catéter rostral hasta 4 cm que coloca a la punta en la aorta torácica.
- Anclar el catéter dentro del vaso mediante la vinculación de tres suturas de seda alrededor de la arteria femoral.
- Hacer un bolsillo subcutáneo a lo largo del flanco entre el borde caudal de la caja torácica y el tque la extensión más craneal de gama de la rodilla con unas tijeras romas.
- Insertar el cuerpo del transmisor en el bolsillo y la sutura al tejido conectivo que rodea el transmisor para evitar el movimiento excesivo.
- Suturar la piel con el número 6 de hilo de seda.
- Inyectar con lactato de Ringer (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg) y ampicilina (33 mg / kg) por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía y mantener ratas en una incubadora caliente hasta que despierta.
3. Basal presión arterial media (PAM) y la frecuencia cardíaca (FC) de grabación
- Ya en un día después de la implantación del transmisor, poner un solo animal en la plataforma de receptor y encienda el transmisor. Espere unos 10 - 15 minutos a habituar al animal y estabilizar los parámetros cardiovasculares.
- Registro de PAM y FC de reposo, que se derivan de la presión arterial del pulso con un sistema de adquisición de datos computarizado durante al menos 1 h. Recopilar datos cada 5 segundos.
- Monitorear la unaanimalesque eliminan continuamente y puntos de datos durante la ocurrencia de los espasmos visibles. Para cada animal, los puntos de datos promedio para obtener valores medios.
4. colorrectal Distensión inducida Disreflexia Autónoma
- Restringir ratas NSC injertados o de control SCI en una toalla suministrado con bolitas de comida en el interior del receptor transmisor. Por lo general, las ratas pueden permanecer cooperativamente durante el procedimiento.
- Insertar un catéter con punta de globo de látex en el recto durante aproximadamente 2 cm y fijarlo a la cola con cinta 8.
- Encienda el transmisor y esperar durante 10 - 15 min permitiendo que la presión de la sangre para volver al inicio del estudio previo a la inserción.
- Inducir la distensión colorrectal mediante el inflado del globo lentamente durante 10 segundos con 1,4 ml de aire por 1 min, para generar una presión de aproximadamente 30 mmHg.
- MAPA Grabar y HR 1 min antes, durante 1 min, y 1 min después de la distensión colorrectal; datos de ejemplo cada 3 s durante el procedimiento de 3 min.
- Realizar 2 - 3 ensayos por animal con al menos 15 min intervalo de recuperación entre dos ensayos.
- Animales de sobredosis (ip) con la combinación de anestesia dosis doble descrito anteriormente, si no más evaluación. Perfundir animales con solución salina seguido de paraformaldehído al 4%.
- Para cada animal, la media de los valores antes y durante la distensión colorrectal, respectivamente; calcular la diferencia entre el valor inicial y el PAM y FC cambios inducidos por distensión-para cada ensayo; promedio durante los 2 - 3 ensayos para obtener los valores medios.
5. Transmisor Limpieza
- Retire el transmisor del cuerpo de un animal después de la anestesia, pero antes de la perfusión. Remojar inmediatamente en un vaso de precipitados lleno con agua destilada hasta que la limpieza; evitar el secado del dispositivo de telémetro.
- Transferir el telémetro a la solución de limpieza enzimática 1% Terg-A-Zyme (10 g de agua / L) durante 24 horas a temperatura ambiente.
- Regel la punta del catéter del transmisor con una aguja de punta roma de calibre 30conectado a la jeringa regel.
- Secar cuidadosamente el transmisor usando un paño suave plegada y almacenarlo en la bandeja de plástico original.
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Representative Results
Utilizando la técnica de telemetría antes descrito, se registró con éxito los parámetros cardiovasculares en la médula espinal lesionada animales. En los animales con solo SCI, MAP se redujo significativamente, mientras que HR aumentó en comparación con los animales no tratados previamente, en consonancia con los informes anteriores 9. En los animales con BS-NSC injerto, PAM y FC acercado niveles medidos en los animales no tratados previamente (Figura 2). Durante la distensión colorrectal, una rata fue considerado como dysreflexic si la estimulación nociva produce un aumento en MAP y una disminución de 3,8 HR. Hipertensión episódica y baroreflex mediada bradicardia fueron provocados inevitablemente en todos los animales, pero la medida difirieron entre los grupos. Aumento MAP en los animales injertados con BS-NSC fue mucho menor (16.9 ± 3.1 mmHg, n = 3) que los animales con lesión solo (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (Figura 3). Sin embargo, la disminución de la FC durante la distensión colorrectal no difirió significativamente entre los gruposs. Como bradicardia está mediada por mecanismos barorreflejos, esta discrepancia puede ser debido a la reducción de la sensibilidad de los barorreceptores después de la lesión 10. El espasmo se produjo durante la distensión colorrectal en la mayoría de las ratas independientemente del tratamiento.
Tras el análisis histológico, immunolabeling indicado excelente supervivencia del injerto en médulas espinales implantados con BS-NSC pero un vacío en la médula espinal de los animales de control lesionados sin injerto. NSCs fetales llenaron por completo el lugar de la lesión y sólo se observaron cavidades menores. Implantes integrados en el anfitrión gris y la materia blanca tanto rostral y caudal. Se encontró un gran número de neuronas TH + catecolaminérgicos y 5-HT + serotoninérgicos en implantes BS-NSC, y numerosos axones topográficamente inervado neuronas preganglionares simpáticas caudal en la columna de la celda intermediolateral en distancias largas (Figura 4). En contraste, en los animales lesionados sin injerto, TH + / 5-HT + fIBERS no se detectaron en la médula espinal toracolumbar debajo de la lesión (no mostrados).
Figura 1:. Diagrama que muestra la cateterización de la arteria femoral La arteria femoral (A.) se diseca desde el nervio (N.) y la vena (V.), y luego se punza con una aguja curva. El catéter conectado al transmisor se inserta en la arteria, colocando la punta del catéter en el nivel de la aorta torácica para la grabación cardiovascular (~ 4 cm).
Figura 2: MAPA Basal y HR se recuperan en la médula espinal lesionada ratas injertadas con BS-NSC En una cohorte representativa (n = 3 / grupo), la grabación de la telemetría indica significativamente menor MAPA basal y superior HR en ratas con SCI y ningún tratamiento 10 wee. ks después de la lesión (* p <0,05). En contraste, ambos parámetros cardiovasculares se recuperan al nivel de las ratas ingenuas 8 semanas después de BS-NSC injerto (10 semanas después de la lesión) (ambos p> 0,05; ANOVA seguido de post hoc de Fisher).
Figura 3: distensión colorrectal (CRD) inducida dysreflexic autonómica disreflexia autonómica se dispara durante un CRD 1 min tanto en animales injertados SCI y BS-NSC, manifiesta la hipertensión episódica acompañada de bradicardia.. (A) En una rata de control lesionada, MAP aumenta en aproximadamente 60 mmHg durante la distensión de colon. (B) Sin embargo, el aumento de la MAP está fuertemente reducida a 10 - 20 mmHg en una rata injertado con BS-NSC.
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Figura 4: Injertados BS-NSC se integran en el adulto anfitrión de la médula espinal y se diferencian en neuronas catecolaminérgicos y serotoninérgicos (A) Ocho semanas después de la BS-NSC injerto, las buenas prácticas agrarias y GFAP doble inmunomarcación demuestra relleno de la zona de la lesión con GFP etiquetados células implantadas en. una sección de la médula espinal longitudinal. (B) En contraste, existe un vacío en una médula espinal seccionado sin injerto. (C, D) Immunolabeling para la tirosina hidroxilasa (TH) y la serotonina (5-HT) revela muchos TH y 5-HT neuronas positivas dentro del injerto. (E, F) derivado del injerto TH + y 5-HT + axones se extienden y inervan las neuronas preganglionares simpáticas caudal etiquetados con Fluorogold en la columna de la celda intermediolateral. Las barras de escala: 1 mm (B), 25 m (D) y 50 m (F).
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Discussion
Tradicionalmente, una cánula llena de líquido se inserta en la arteria y se conecta a un transductor de presión para registrar los parámetros cardiovasculares como una instantánea terminal en cada animal 11. Para supervisar continuamente el rendimiento cardiovascular durante mucho tiempo, los sistemas de radio-telemétrico se emplean en muchos laboratorios. Esta herramienta más refinada puede registrar la presión arterial en el consciente, moviéndose libremente animales. En comparación con los catéteres llenos de fluido, de telemetría se considera una técnica más avanzada para evaluar con precisión la función cardiovascular en animales de SCI. Aunque en el presente estudio se implantó un transmisor sólo 1 día antes de la grabación, puede ser implantado antes o después de SCI para la adquisición de datos múltiples dependiendo de los requisitos experimentales 12. Para la presión arterial basal y de recursos humanos, ya sea central o periférico de grabación se puede lograr. Sin embargo, la respuesta a la distensión colorrectal cardiovascular no puede ser detectado por el método basado manguito de la cola-no invasiva ennuestra experiencia. Análisis telemétrico reciente verificó la persistencia a largo plazo de la hipotensión y taquicardia después de la transección de la médula torácica completa de la médula en ratas 9,13. El MAPA basal más baja y más alta HR en nuestras ratas de control SCI son consistentes con el informe anterior utilizando la misma técnica de grabación. La DA inducida colorrectal-se alivió en las ratas que recibieron injerto celular. En base a la evidencia histológica, catecolaminérgicos y serotoninérgicos entradas a SPN para diferentes segmentos de la columna vertebral puede dar cuenta de las mejoras fisiológicas.
Cateterismo transmisor es fundamental para la implantación y la grabación exitosa. En ratas cortados transversalmente cable de la columna vertebral, el diámetro de la arteria femoral es más pequeña de lo habitual debido a la falta de la función motora y sensorial de las extremidades posteriores. Parálisis completa por lo general resulta en la atrofia muscular. Los cirujanos pueden encontrar la punta del catéter para ser más grande que la arteria. En este caso, la aplicación de lidocaína al 2% en elsuperficie de la arteria provocando la vasodilatación permite la punta del catéter para ser fácilmente insertado en los vasos perforados. Notablemente, lidocaína inducida por vasodilatación persiste aproximadamente 4 - 5 min. Por lo tanto, la punción del vaso y cateterismo deben realizarse lo más rápidamente posible. En el período de adquisición de datos de los parámetros basales, se recogieron los puntos de datos cada 5 segundos durante 1 hora. Durante la grabación inducida por distensión colorrectal-3 min, sin embargo, los datos fueron muestreados cada 3 s con el fin de obtener más puntos de datos para un promedio de más precisa a lo largo de este corto período.
La implantación de un catéter en la arteria femoral puede interferir con el suministro de sangre de la extremidad posterior e inducir la necrosis de los tejidos, especialmente si la arteria distal se sutura. Sellar el punto en la arteria de inserción del catéter con una pequeña gota de pegamento de tejido en lugar de una sutura de seda puede restaurar al menos parcialmente el flujo de sangre. De este modo, los animales serían más saludables para el monitoreo a largo plazo.Alternativamente, el catéter del transmisor se puede implantar directamente en la aorta abdominal colocando el cuerpo del transmisor en la cavidad abdominal. Este método evita la descomposición de tejido en el miembro posterior ipsilateral, pero tiene un riesgo de influir en la función gastrointestinal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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